Summary
Den wormsorter letter genetiske skærme i Caenorhabditis elegans ved at sortere orme ifølge udtryk for fluorescerende journalister. Her beskriver vi en ny anvendelse: sortering efter kolonisering af en GFP-udtrykkende patogen, og vi beskæftiger det at undersøge dårligt forstået rolle patogen anerkendelse i at indlede immunrespons.
Abstract
Den wormsorter er et instrument, svarer til en FACS maskine, der anvendes i undersøgelser af Caenorhabditis elegans, typisk at sortere orme baseret på ekspression af en fluorescerende reporter. Her vil vi fremhæve en alternativ anvendelse af dette instrument, til sortering orme efter graden af deres kolonisering af en GFP-udtrykkende patogen. Denne nye anvendelse tilladt os at tage forholdet mellem kolonisering af orm tarmen og induktion af immunreaktioner. Mens C. elegans immunreaktioner på forskellige patogener er blevet dokumenteret, er det stadig ukendt, hvad der igangsætter dem. De to vigtigste muligheder (som ikke udelukker hinanden) er indregning af patogen-associerede molekylære mønstre, og afsløring af skader forårsaget af infektion. At skelne mellem de to muligheder, skal eksponering for patogenet kan adskilles fra de skader, den forårsager. Den wormsorter aktiveret adskillelse af orme, der blev udstrakt-koloniseret af Gram-negativ patogen Pseudomonas aeruginosa, med skaden sandsynligvis forårsaget af patogen belastning, fra orme, der blev ligeledes udsat for, men ikke, eller marginalt, koloniseret. Disse forskellige populationer blev brugt til at vurdere forholdet mellem patogen belastning og induktion af transskriptionelle immunreaktioner. Resultaterne antyder, at de to er adskilt, støtter muligheden for patogen anerkendelse.
Introduction
Automatisk orm sortering er meget ligesom FACS, der opererer ved at måle et fluorescerende signal i en orm (som typisk udbydes af transgen ekspression af reporter-proteiner), da det passerer rettede i et rør, så omdirigering enten til en samling rør / brønd eller til en affaldsbeholder ifølge til gating parametre af forskeren 1.. Den wormsorter kan fremme forskning på mange måder, et eksempel på at ansætte det som et analytisk værktøj er en undersøgelse, der fulgte spatiotemporale mønstre af promotor aktivitet for næsten 1.000 gener 2.
Men den væsentligste anvendelse af wormsorter er genetiske skærme efter målgenekspression niveauer eller lokalisering af fluorescerende protein langs aksen af snekken 3-5.
Her beskriver vi en ny ansøgning om wormsorter, i følge kolonisering af ormen med en fluorescens-mærkede patogen. Med dette som et værktøj, vi fokuserede på forholdet mellem Pathogen kolonisering / belastning og immunrespons, at få ny indsigt i de mekanismer, der er ansvarlige for iværksættelse af immunreaktioner i ormen.
I næsten alle organismer er undersøgt til dato, indledning af medfødte immunrespons til mikrobielle patogener afhænger anerkendelse af patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs), og / eller fare / skade-associeret molekylære mønstre (dæmper) 6,7. De første er konserverede mikrobielle strukturer, der omfatter dele af den mikrobielle cellevæg, dets flagellum eller dens tolagede 6, det andet omfatter både frigivet molekyler (fx ATP 8), ændrede proteiner eller andre markører for ændrede cellulære processer 9,10. Begge typer af signaler er anerkendt af proteiner, der er udpeget som mønstergenkendelse receptorer (PRRS), som ved specifik binding af et mønster molekyle aktiverer en kæde af begivenheder, der fører til et beskyttende respons. C. elegans har været yderst nyttig som en tractaligt model til at dissekere forskellige aspekter af vært-patogen interaktioner, men én ting, der er ikke godt forstået, er, hvordan immunreaktioner indledes i ormen. Ingen af de putative receptorer, der er orthologe til mønstergenkendelse receptorer (PRRS) i andre organismer er blevet vist at binde PAMPs, og mange af de orthologer PRRS, som er afgørende for immunreaktioner i andre organismer viser en overraskende begrænset bidrag til orm patogene reaktioner og modstand. For eksempel er Drosophila Toll receptor, hvilket er vigtigt for at modstå Gram-positive patogener, repræsenteret i C. elegans ved en eneste homolog, tol-1, som bidrager til beskyttelse mod Gram negative patogener Salmonella Typhimurium 11, men ikke fra andre testede Gram-negative eller positive patogener 11,12. Disse observationer, kombineret med data indikerer, at immunreaktioner kunne induceres ved at forstyrre cellulært protein translation hsom førte nogle til at foreslå, at C. elegans primært registrerer dæmper 9,13,14. Ikke desto mindre rapporter, der beskriver evne døde patogener til at fremkalde immunrespons tyder på, at PAMP binding kan have en vigtig rolle i patogen anerkendelse i C. elegans 15,16. Tidligere arbejde med fokus på immunreaktioner i alderen synkroniseret genetisk identisk C. elegans befolkninger, viste stor individuel variation i intestinal kolonisering af den bakterielle Gram-negative patogener Pseudomonas aeruginosa.
Men transskriptionsprofilering undersøgelser behandlede disse trinløst koloniserede befolkninger som én enhed 17,18. Drage fordel af denne variation, har vi udviklet en protokol fokusering en automatiseret wormsorter at adskille forskelligt koloniserede befolkninger Caenorhabditis elegans udsat for GFP-udtrykkende P. aeruginosa. Undersøgelse genekspression i forskelligt-koloniserede befolkninger Facilitated vurdering af forholdet mellem patogen belastning (og den tilhørende skader) og immunreaktioner og givet nye indsigter om patogen anerkendelse i C. elegans 19.. Nedenfor beskrives protokollen, som kan anvendes til at sortere orme inficeret med nogen fluorescens-mærkede patogen.
Til potentielle brugere skal det bemærkes, at antallet af orme der kræves for at blive sorteret, afhænger af arten af de efterfølgende analyser og protokoller i brug. For eksempel i tilfælde af microarray genekspression analyse> 1.000 orme vil blive forpligtet til at indhente nok RNA, hvis der anvendes standardprotokoller, men ~ 100 orme ville være tilstrækkeligt, hvis forstærkning er ansat, så hurtig indsamling af materiale og dermed minimere stress til orme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Opnåelsen af et synkroniseret kultur unge voksne dyr
- Grow orme på flere NGM plader podet med OP50-1 E. colibakterier (10x koncentreret fra en mættet kultur), indtil mange orme har nået den gravide stadie.
- Forkæl GRAVID dyr med æg-prep løsning til at opnå en synkroniseret kultur (æg).
- Plate æg på flere 60-mm NGM plader podet med 10x koncentreret OP50-1 ved en densitet på omkring 150-200 æg / plade.
- Pladerne inkuberes ved 25 ° C i 2 dage (indtil orme har nået L4 - Ung voksen stadie).
2. Forberedelse Pseudomonas aeruginosa Plader og inficerer Worms
- På dagen for æg-prep (trin 1.1) at inokulere en PA14 :: GFP kultur i 2 ml Kings B-medium indeholdende rifampicin ved en slutkoncentration på 100 ug / ml. Inkuber kulturen ved 37 ° C med omrøring O / N.
- Plate den PA14 :: GFP culTure på så mange Langsom Killing Plates (SKP), som er nødvendige for analysen. På hver 150 mm SKP petriskål pipette 75-100 ul mættet kultur og fordeles jævnt ved hjælp af en steril glas sprederen. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 20-24 timer.
- Fjern pladerne fra inkubatoren, og lad dem køle af til stuetemperatur (~ 20 min). Brug M9 buffer, vaske orme fra trin 1.4 på PA14 :: GFP plader i en minimal mængde væske. Ved anvendelse af 150 mm plader kan flere hundrede orme anbringes på en enkelt plade.
- Pladerne inkuberes ved 25 ° C i 18-21 timer. For P. aeruginosa-eksponerede unge voksne orme, dette er den tid vindue, der viser optimal fordeling af koloniseret vs noncolonized dyr.
3. Opsætning af Wormsorter
Før udførelse af prøven slags, sikre, at maskinen fungerer korrekt. Nærmere oplysninger kan fås ved henvendelse til http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, og the vigtige skridt er skitseret nedenfor.
- Sæt kappen ventil trykket til cirka 5 psi (4,5-5,5 området).
- At kontrollere, at kappevæske strømningshastighed er hensigtsmæssigt at placere en 15 ml konisk rør under dispenseren, tænde for skeden ventil, og sluk for sorteringsanlæg ventil. Hold røret under dispenser til 60 sek. Lydstyrken i røret bør være 9-10 ml. Hvis det er uden for dette område, justere hylsteret ventil trykket i overensstemmelse hermed.
- For at sikre at kappevæske strømningshastighed (indstillet som i trin 3.2), vil give præcis sortering, teste den slags rate ved hjælp af 40 mM kontrol partikler:
- Sluk kappen ventil. Tilsæt ca 25 ml kontrol partikel opløsning til reservoiret.
- Tænd hylsteret ventil, og prøven ventilen.
- På den computer, software, navigere til "kontrol partikel-mode" og klik erhverve.
- Sørg for, at partiklen strømningshastigheden er ~ 5-8 partikler / sek med en TOF (Time Of Flight) tilnærme breddenaf partiklen, 40 um. En sådan TOF viser, at kun en enkelt 40 um objekt passerer ad gangen. Hvis værdierne er uden for dette område, justere indstillingerne (efter anvisningerne ovenfor) tilsvarende.
4.. Sortering Koloniseret vs Noncolonized Worms
- Brug M9, vask orme i 15 ml konisk rør. Tillad voksne orme at synke til bunden af røret ved hjælp af tyngdekraften, og supernatanten fjernes. Fyld røret med frisk M9. Gentag denne proces 3-4x. Dette fjerner en stor del af larver samt overskydende bakterier og tager omkring 10 minutter.
- Tilføj orme til wormsorter reservoir med en blidt-blanding lille omrører.
- Juster første signal gevinst ved at sætte den grønne PMT til 600 og de røde og gule PMT til 200.
- Begynd at erhverve data for at justere indstillingerne.
- Sigt efter en slags sats på 25-30 arrangementer (orme) pr sek. Hvis antallet er for høj, fortyndes orme i reservoiret med M9 overensstemmelse hermed. Hvis hastigheden er foro lav, tilføje flere orme i et lille volumen M9.
- Hvis forsøget kræver en meget stringent adskillelse af koloniseret vs noncolonized orme, skal du indstille "tilfældighed check" til "ren". Dette sikrer, at to objekter i tilfælde forekommer for tæt på hinanden eller i samme dråbe maskinen afviser drop stedet for at samle den.
- For at sortere populationen af interesse, tegne gates omkring akserne angiver størrelse (for at få voksne orme) og fluorescens intensitet (dvs. høj for koloniseret, lav for noncolonized). Værdierne for fluorescens gating skal bestemmes empirisk.
- Placer en multi-brønds plade eller en petriskål under dispenseren til at indsamle orme derefter åbne den slags ventil til at begynde sortering orme.
- Saml en lille population af dyr for at kontrollere, under mikroskopet, at sorteret befolkning er populationen af interesse. Hvis ikke, justeres gating af parametre og fortsætte med prøvetagning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når alder-matchede, genetisk identisk C. elegans udsættes for P. aeruginosa, iagttages en bred fordeling i niveauet af kolonisering (figur 1A). Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her effektiv separation af noncolonized fra koloniserede orme kan opnås (Figur 1B). I modsætning noncolonized orme, koloniserede orme vise tegn på skader, såsom træghed og reduceret afføring 19. Sidstnævnte kan være en grund til, at orme koloniseret af P. aeruginosa har svært clearing infektion. Det har direkte konsekvenser for den beskrevne protokol tyder på, at orme sorteret som noncolonized ikke tidligere koloniseret. For direkte at teste, om denne påstand er korrekt, blev håndplukkede koloniserede orme underlagt tilsvarende vasketrin som dem i sorteringen eksperiment og efterfølgende undersøgt under et fluorescerende mikroskop, kun 4/56 ryddet patogen. Derfor er det sandsynligt, thved andelen af tidligere koloniserede orme blandt de sorteres som noncolonized er ubetydelig. Men det er tilrådeligt at overvåge ændringer i kolonisering under vask skridt til at forhindre konsekvenserne af fejlagtige sortering på analyse, som kan være mere af et problem for andre patogener end P. aeruginosa.
Tidligere arbejde beskæftiger protokollen beskrevet her brugt sorteret orme til en microarray genekspression analyse og observeret væsentlige identiske reaktioner på P. aeruginosa i koloniserede og noncolonized worm befolkninger, der var blevet udsat for patogen for den samme mængde tid 19. Figur 2 viser den samme tendens ved hjælp af kvantitative (q) RT-PCR for at måle ekspressionen af fire gener, der er kendt for at være en del af C . respons elegans immun: Lys-2 koder for et lysozym F08G5.6 og F55G11.2 er to ikke-karakteriserede gener, der reagerer specifikt til infektion, hvoraf det første bidrager også infektition modstand og pgp-5, der reagerer på infektion samt til heavy metal stress. Alle fire gener blev induceret lignende ved P. aeruginosa eksponering, uanset kolonisering status orme. Dette bekræfter tidligere offentliggjorte resultater indikerer, at kolonisering og dens tilhørende skaden ikke er nødvendige for en immunreaktion, i stedet peger på patogen-associeret molekylære mønstre som signalet. At pgp-5 induceres i noncolonized dyr, som ikke forventes at være oplever omfattende skader, foreslår en overlapning i de regulatoriske programmer kontrollerer immunreaktioner og generelle stressreaktioner i C. elegans.
Figur 1. Koloniseret og noncolonized C. elegans adskilt ved hjælp af en wormsorter.. (A) repræsentant billede af vildtype voksen C. elegans udsat for GFP-udtrykkende P. aeruginosa for 18 timer. (B) Repræsentative billeder af en noncolonized og koloniserede orme adskilt ved hjælp af wormsorter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Colonization er ikke nødvendig for transkriptionel respons på P. aeruginosa. RNA niveauer af lys-2 (A), F08G5.6 (B), F55G11.2 (C) og pgp-5 (D) målt ved QRT-PCR i vildtype-dyr udsat for E. coli eller P. aeruginosa </ Em> for ~ 18 timer. Vist er midler og SD af dobbelte målinger fra et eksperiment, der er en repræsentant for tre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Materialer og reagenser, der er nødvendige for en wormsorter eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåden beskriver vi drager fordel af fluorescerende mærkning af enheder uden for orm, til at følge interaktionen mellem snekken og dens omgivelser. I tilfælde vi præsenterer, er separation baseret på mærkning af et patogen og blev ansat til at adskille orme med tung patogen belastning fra dem uden (eller lys) belastning. Efterfølgende genekspressionsanalyse fandt ingen forskel i immunresponser mellem de to grupper, hvilket tyder på, at de var uafhængige af patogen belastning. Det signal, som initierer reaktionen blev vist andre steder for at være fysisk forbundet med bakterier, snarere end at blive udskilt, hvilket tyder på, at dette signal kan være en PAMP. Sammen disse resultater støttede den hypotese, at PAMP anerkendelse spiller en rolle i at indlede immunrespons i C. elegans 19..
En fordel ved sortering protokollen beskrevet ovenfor er, at både koloniserede og noncolonized orme er isoleret fra en enkelt population. Ther afhængig af at have en befolkning med en optimal fordeling af dyr, der er koloniseret vs noncolonized. Vi har fundet, at når inficere unge-voksne, vildtype orme med P. aeruginosa, svarede dette til en eksponeringstid på ca 18 timer. Denne eksponering tid producerede en befolkning, hvor flertallet af dyr blev koloniseret til en "mellemliggende" grad, men flere hundrede orme viste fuld kolonisering, og et lignende antal blev noncolonized. Mens dette repræsenterer en optimal fordeling til vores formål, andre kan definere deres egen optimale distribution.
Under sortering, er det tilrådeligt at have "kvalitetskontrol" er indbygget i hvert forsøg. Vi gjorde det på to måder. Én for genekspressionsstudier, vi håndplukket et lille antal (koloniserede og noncolonized) orme under en fluorescerende dissektionsmikroskop, som kan bruges til qRT-PCR på et begrænset sæt af gener. Disse tjener som "gold standard" for hvad gen expressiden i en virkelig ren population ville se ud. For det andet, er det god praksis at sortere 20 eller flere orme til en plade for hver sorteres automatisk befolkning til at kontrollere under en fluorescerende mikroskop, at instrumentet fungerer som forventet. Afhængigt af den nedstrøms anvendelse, kan kræves forskellige grader af "fidelity" af sortering protokollen. Når sorteret orme ikke er i overensstemmelse med den ønskede grad af kolonisering, bør gating parametre justeres (trin 4.7). Det skal bemærkes, at de strengere portene, jo højere det oprindelige antal orme, der er nødvendige, og forsøg skaleres op i overensstemmelse hermed.
Det her beskrevne forsøg kan udføres med enhver pathogen (så længe det fluorescens er mærket). Efter sortering, behøver efterfølgende analyser ikke nødt til at overholde genekspressionsanalyse, og kunne fokusere på overlevelse eller endda adfærdsanalyse. Endvidere kunne lignende protokoller bruges til analytiske formålAt følge metabolit absorption, eller at kvantificere patogen belastning, idet sidstnævnte giver en enklere alternativ til kimtal, som er meget variabel 20,21. Stigningen i antal og hastighed kan lette kvantificering patogen belastning under forskellige betingelser, herunder genetiske forstyrrelser i værtslandet eller patogen, og forskellige miljøforhold. Eftersom wormsorter kan udstyres til at opdage flere fluorescerende molekyler, sporing kolonisering behøver ikke være begrænset til en enkelt type bakterier. Denne evne ville være nyttigt for økologiske undersøgelser, giver mulighed for forskellige mikrober til at konkurrere om kolonisering. I laboratorieundersøgelser af patogenese, C. elegans typisk dyrkes på en bakteriel monokultur. Imidlertid er studiet af mekanismer for medfødte immunitet i naturen, hvor der findes patogener blandt hundredvis af andre mikroorganismer, der kan påvirke immunitet begyndt at samle opmærksomhed 22,23.
Sammenfattende using af wormsorter til en lang række applikationer tillader forsøg skal udføres på kort tid, og / eller på stor skala. Udvidelse af repertoire af sådanne ansøgninger kunne fremme vores forståelse af C. elegans fysiologi. Navnlig inden for C. elegans medfødte immunitet, overlevelse er en ofte brugt metrik til afprøvning af bidragene fra forskellige gener. Men kolonisering er mere proksimalt til de begivenheder, der indleder immunitet mens det stadig giver en funktionel output. Brug protokoller som beskrevet her for at isolere og / eller analysere populationer af interesse er et værdifuldt redskab til at studere forskellige aspekter af de tidlige begivenheder i immunrespons i ormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ellison Medical Foundation for deres støtte. Vi ønsker også at takke medlemmerne af Abby Dernburg laboratorium for assistance med at bruge wormsorter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
- Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
- Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
- Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
- Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
- McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
- Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
- Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
- Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
- Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
- Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).
