Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Frédéric Catez; Antoine Rousseau; Marc Labetoulle; Patrick Lomonte

doi:10.3791/51091

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Article de méthode

Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

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DOI :

10.3791/51091

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23 janvier 2014

Frédéric Catez¹^,²^,⁵ , Antoine Rousseau⁴ , Marc Labetoulle⁴ , Patrick Lomonte¹^,²^,³

¹Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, ²Université de Lyon 1, ³Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, ⁴Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, ⁵Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

Dans cet article

Résumé

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.

Résumé

Cellule à l'unité co-détection d'un gène, le produit de l'ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l'expression génique. Il s'agit d'un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d'où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l'absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l'approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d'ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l'ADN à l'ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d'amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d'obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d'anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.

Introduction

Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte ^1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression de....