Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

Zusammenfassung

Der Prozess der Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel spezifischer Proteine ​​und subzellulären Kompartimenten an der Stelle der Zellmembran Verletzung. Dieses Protokoll beschreibt Assays, um diese Prozesse zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von verletzten Zellen zu heilen ist eine grundlegende zelluläre Prozess, aber zellulären und molekularen Mechanismen der Heilung verletzten Zellen beteiligt sind kaum verstanden. Hier Assays werden beschrieben, die Fähigkeit und die Kinetik der Heilung von kultivierten Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen zu überwachen. Das erste Protokoll beschreibt einen Endpunkt basierten Ansatz, um gleichzeitig zu beurteilen Zellmembran Reparaturfähigkeit von Hunderten von Zellen. Das zweite Protokoll beschreibt ein Echtzeit-Bild Ansatz, um die Kinetik der Zellmembran Reparatur in einzelnen Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen mit einem gepulsten Laser zu überwachen. Wie Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel von spezifischen Proteinen subzellulärer Kompartimente und an den Ort der Verletzung, das dritte Protokoll beschreibt die Verwendung von oben Endpunkt Ansatz für eine solche Veranstaltung Handel (lysosomale Exozytose) in Hunderten von Zellen verletzt bewerten und gleichzeitig die letzte Protokoll beschreibt die Verwendung von gepulstem Laser Verletzungen zusammen mit TIRF microsKopie an die Dynamik der einzelnen subzellulären in verletzten Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen. Während die Protokolle beschreiben die Verwendung dieser Ansätze, um die Verbindung zwischen Zellmembran Reparatur und lysosomale Exozytose in kultivierten Muskelzellen zu studieren, können sie als solche für andere adhärenten Kulturzelle und subzellulären Kompartiment der Wahl angewendet.

Einleitung

Zellmembran hält die Integrität der Zellen durch eine Barriere zwischen der Zelle und der extrazellulären Umgebung. Eine chemische, elektrische oder mechanische Reiz, die die normalen physiologischen Schwelle sowie das Vorhandensein von eindringenden Krankheitserregern überschreitet kann jedes Ergebnis zu Verletzungen der Zellmembran und lösen eine anschließende zelluläre Reaktion auf diese Verletzung zu reparieren. Um diese Verletzungen der Zellmembran überleben Zellen besitzen einen effizienten Mechanismus zur Reparatur. Dieser Mechanismus ist calciumabhängig und erfordert intrazellulären Transports von Proteinen, wie Annexine und MG53 ua sowie subzellulären Kompar....

Protokoll

1. Imaging Cell Membrane Repair Mit Schütt (Glasperlenspiel) Verwundung

Dieses Protokoll erlaubt separat Kennzeichnung der verletzten Zellen und solche, die nicht heilen. Die Quantifizierung dieser Populationen von Zellen erfordert die Verwendung von drei Bedingungen: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca ^{2 +,} 2 zu reparieren. Kontrolle 1 (keine Schädigung C2) - Die Zellen werden in Gegenwart von Ca ^{2 +} 3 inkubiert, aber nicht verletzt, und. Control 2 (keine Reparatur C3) - Zellen werden in Abwesenheit von Ca ^{2 +} zu reparieren.

1. Zellen wachsen auf> 50% Konfluenz auf drei sterile De....

Ergebnisse

Für Single-Cell-Imaging hier beschriebenen Protokolle sind, die Fähigkeit und die Kinetik der Zellmembran Reparatur (Protokolle 1 und 2) und die subzelluläre Handel und Fusion von Lysosomen während der Reparatur zu überwachen (Protokolle 3 und 4).

Protokoll 1 zeigt eine Groß Assay, der die Kennzeichnung aller verletzten Zellen und der Identifizierung von verletzten Zellen, die zur Reparatur fehlgeschlagen ermöglicht. Die Ergebnisse in Abbildung 1 zeigen, dass, während die un.......

Diskussion

Zellmembranschäden in vivo auftritt, aufgrund einer Vielzahl von physiologischen Belastungen und verschiedene experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um diese zu imitieren. Dazu gehören verletzen Zellmembran von adhärenten Zellen durch Abschaben sie von der Schale oder durch Passagieren durch eine enge Bohrung Spritze ^9,10. Nach solchen Verletzungen heilen die Zellen in Suspension und nicht an die extrazelluläre Matrix eingehalten, wie sie normalerweise in dem Gewebe zu tun. Wieder andere, wie die .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HBSS	Sigma	H1387	Zur Aufbereitung von CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
HEPES	Fisher	BP410	Zur Aufbereitung von CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
FITC Dextran (Lysin fixierbar)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM oder PBS
Glasperlen	Sigma	G8772
TRITC Dextran (Lysin fixierbar)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM oder PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM Farbstoff	Invitrogen	T3163	1 µ g/µ l in CIM oder PBS
FITC Dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml im Wachstumsmedium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in Wachstumsmedium
Alexa Fluor 488 Huhn Anti-Ratte IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in Blockierlösung
Eindeckmittel	Dako	S3023
Deckgläser	Fisher	12-545-86
Glasboden Petridum	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C
Silikon O-Ring	Bellco	1943-33315
Deckglashalter	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Verwendet für Wachstumsmedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Verwendet für Wachstumsmedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Hühnerserum	Sigma	C5405	5% Hühnerserum in CIM wird zur Blockierung der Lösung während der Immunfärbung
verwendet PBS (Ca2+ und Mg2+ frei)	VWR	12001-664
Epifluoreszenzmikroskop	Olympus America, PA	IX81
TIRF Illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluoreszenzbeleuchtung	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Bilderfassungs- und Analysesoftware	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Gepulster Laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Inkubator auf der Bühne	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS