De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

Samenvatting

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

Samenvatting

De Western blot technieken die oorspronkelijk werden opgericht in de late jaren 1970 zijn nog steeds actief gebruikt vandaag. Echter, deze traditionele methode van Western blotting heeft een aantal nadelen dat lage kwaliteit resolutie, onechte bands, verminderde gevoeligheid, en een slechte eiwit integriteit omvatten. Recente ontwikkelingen zijn drastisch verbeterd tal van aspecten van de standaard Western blot protocol om hogere kwalitatieve en kwantitatieve gegevens te produceren. De Bis-Tris gel systeem, een alternatief voor de conventionele Laemmli systeem, genereert een betere scheiding van eiwitten en resolutie, onderhoudt eiwit integriteit, en vermindert elektroforese een 35 min looptijd. Bovendien is de iBlot droge blotting systeem drastisch verbetert de effectiviteit en de snelheid van eiwit overdracht aan het membraan 7 minuten, dit in tegenstelling tot de traditionele eiwit overdrachtmethoden die vaak meer inefficiënt met lange overstaptijden. In combinatie met deze zeer innovatieve modificaties, eiwit detection met infrarood fluorescerende beeldvorming resulteert in een hogere kwaliteit, meer accurate en consistente gegevens vergeleken met de standaard Western blotting techniek van chemiluminescentie. Deze technologie kan simultaan twee verschillende antigenen op dezelfde membraan door gebruik tweekleurige nabij-infrarode kleurstoffen die worden gevisualiseerd in verschillende fluorescente kanalen. Bovendien zijn de lineariteit en grote dynamiek van fluorescerende beeldvorming maakt de precieze kwantificering van zowel sterke als zwakke eiwitbanden. Dus dit protocol beschrijft de belangrijkste verbeteringen van de klassieke Western blotting methode, waarbij deze ontwikkelingen verhogen de kwaliteit van gegevens tijdens de speeltijd van dit experiment sterk verminderen.

Inleiding

De techniek van Western blotting werd ontwikkeld tussen 1977 en 1979 om een betere werkwijze te creëren voor het detecteren van eiwitten met behulp van antilichamen ^1-3. Deze procedure gebruikt elektroforetische overdracht van eiwitten aan membranen van SDS-PAGE gels met doeleiwitten gevisualiseerd met secundaire antilichamen en gedetecteerd door autoradiografie, UV-licht, of een peroxidase reactieproduct ^3. Aldus dezelfde basisprincipes nog steeds veel gebruikt in de huidige Western blot protocollen. Echter, deze klassieke Western blotting techniek biedt wel veel nadelen, zoals langzame elektroforese doorlooptijden, lage resolutie en kunstmatige eiwit bands, gevoeligheid voor afbraak van eiwitten, en beperkte gevoeligheid evenals een slechte kwaliteit van de gegevens ^4. Daarom is dit protocol beschrijft significante vooruitgang en verbeteringen aan de standaard westernblotprocedure dat nauwkeuriger kwalitatieve en kwantitatieve gegevens genereert.

"> Het Laemmli voor het scheiden van een groot aantal eiwitten door SDS-PAGE is de meest gebruikte gel voor Western blotting ^5. Ondanks de populariteit van deze Western blotting systeem kan deze werkwijze leiden band vervorming, verlies van resolutie, en onechte banden ^4. Dit kan een gevolg van de deaminering en alkylering van eiwitten door de hoge pH (9,5) van de scheidende gel, re-oxidatie van gereduceerde disulfidebindingen vanwege de verschillende redox toestand van de gel, en splitsing van aspartyl-prolyl zijn peptidenbindingen vanwege het verwarmen van het eiwit in Laemmli buffer (pH 5,2) ^4,6. De Bis-Tris gel systeem, dat werkt op een neutrale pH (7.0), biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de Lamemmli systeem. Dit systeem verbetert eiwitstabiliteit, minimaliseert eiwitmodificaties, onderhoudt eiwitten in hun verminderde staten, voorkomt aspartyl-prolyl decollete tijdens de elektroforese, en nog belangrijker, de elektroforese looptijd is 35 min. ^4,6,7. Bovendien, thij Bis-Tris gel systeem produceert ook scherpere bands, hogere resolutie en scheiding, en verhoogde gevoeligheid resulteert in meer betrouwbare gegevens ^4.

In combinatie met de Bis-Tris gelsysteem, de iBlot droge blotting systeem maakt gebruik veldsterkte en stromen aanzienlijk verminderen de transfer van eiwitten uit gelen op membranen binnen 7 min. ^8. Deze overdracht is gebaseerd op het droge blotting methode die een efficiënte en betrouwbare overdracht van eiwitten ⁸ genereert. Voor een gedetailleerde vergelijking van de werkzaamheid van het iBlot transfersysteem met de conventionele overdracht systemen verwijzen wij u naar de volgende website: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Het maakt gebruik van een anode en kathode stack, die bestaan ​​uit een gelmatrix die de passende overdracht buffers, die als ion reservoirs ⁸ bevat. Tijdens de overdracht water elektrolyse helpt voorkomen de vorming van zuurstof uit de koperanode resulteert in een consistentere proteïnetransfer zonder dat vervorming band ^8. Bovendien, deze overdracht verhoogt ook de snelheid van het verminderen van de afstand tussen de elektroden ^8.

Hoewel chemiluminescentie is de meest voorkomende en traditionele techniek voor detectie van eiwit Western blot analyse, twee-kleuren infrarood fluorescerende detectie verbetert de gevoeligheid, kwaliteit en nauwkeurigheid van Western blot data. Deze detectiemethode gebruikt infrarood laser excitatie twee optimale golflengten 700 nmen 800 nm, een duidelijke beeldgegevens met de grootste signaal-ruisverhouding en de hoogste gevoeligheid ⁹ genereren. Aldus kunnen beide doeleiwitten tegelijkertijd gevisualiseerd op hetzelfde membraan met de 700 nm en 800 nm fluorescentiedetectie kanalen. Belangrijker is dat de lineariteit en dynamische bereik van infrarood fluorescentie maakt nauwkeurige kwantitatieve analyse van zowel sterke als zwakke eiwitbanden ^9. Bovendien is dit protocol levert enorme voordelen en verbeteringen ten opzichte van de klassieke Western blotting techniek verlagen de elektroforese en overdrachtstijden van dit experiment zonder de werkzaamheid van deze processen gebruik infrarood fluorescerend eiwit detectie grotere kwalitatieve en kwantitatieve Western blot data produceren.

Protocol

1. Voorbereiding van Whole Cell Lysaten van Cultuur van de Cel

1. Plaats celcultuurschalen op ijs en voeg koude PBS met 5 mM EDTA (bijv. 5 ml PBS met 5 mM EDTA/10 cm ² plaat). Verwijder hechtende cellen van de schaal met een cel schraper en breng de celsuspensie aan een koude 15 ml conische buis.
2. Pellet de celsuspensies door lage snelheid centrifugatie bij 1000 rpm (230 xg) gedurende 5 min bij 4 ° C. Plaats conische buizen op ijs en het supernatant voorzichtig zuigen zonder verstoring van de pellet.
3. Was de pellet met 1 ml PBS met 5 mM EDTA en overbrengen celsuspensie een koude 1,5 ml centrifugebuis. Quick Spin suspensie bij 13.000 rpm (13.226 x g) gedurende 10 seconden om cellen te pelleteren. Verwijder supernatant voorzichtig zonder verstoring van de pellet en plaats buisjes op ijs.
4. Resuspendeer de pellet in 25-200 pi (afhankelijk van de korrelgrootte, bijvoorbeeld 3 x 10 ⁶ cellen commentaar ~ 150 ul RIPA-buffer) inRIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% NP-40) met vers toegevoegde protease en fosfataseremmers in een 2x eindconcentratie. Kort vortex elke buis en incubeer suspensie voor 20-30 minuten op ijs. Noot: er zijn verschillende lysis buffers die kunnen worden gebruikt om eiwitten te extraheren, die verschillen in hun vermogen om eiwitten en sterkte van de denaturering detergens (bijvoorbeeld SDS, Triton X-100 of NP-40) oplosbaar. RIPA buffer bruikbaar voor het bereiden gehele cellysaten en verstoren eiwit-eiwit interacties.
5. Een post-nucleaire fractie centrifuge lysaten maken bij 14.000 rpm (15.339 x g) gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande naar een nieuwe buis zonder verstoring van de nucleaire verrijkte pellet en plaats buisjes op ijs. Let op: de kern-verrijkte pellet kan ook los van de buis bij het uitpakken van het supernatant. Om het verzamelen van de nucleaire verrijkte pellet te gaan, moet de pipet direct into de viskeuze-nucleaire verrijkte pellet en het op te stellen met de pipet om te beschikken.
6. Bepaal de eiwitconcentraties van elk monster volgens de instructies van de fabrikant met dergelijke eiwitten kwantificering assays BCA of Bradford.

2. Monstervoorbereiding en elektroforese

1. Bereid een monster volgens de volgende tabel hieronder beschreven. Als alternatief kan β-mercaptoethanol worden gebruikt bij een eindconcentratie van 2,5%. Toch moet het reductiemiddel aan elk monster tot een uur worden toegevoegd voordat de gel. Het totale volume is goed voor pipetteren variaties met slechts 20 pi van elke bereide monster geladen per putje.

   REAGENS	Deelmonster
   Eiwitmonster	X pi
   4x LDS Sample Buffer	6 pl
   500 nM DTT Reducing Agent	2.4 pl
   Gedeïoniseerd Water	Tot 15,6 ul
   Totaal Volume	24 pl

2. Warmte monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Terwijl de monsters zijn verwarming, voorbereiden 1000 ml 1x MES of MOPS Running Buffer (50 ml 20x MES of MOPS Running Buffer plus 950 ml gedemineraliseerd water). MOPS loopbuffer lost middelgrote eiwitten van 14-200 kDa, terwijl MES loopbuffer lost kleiner molecuulgewicht eiwitten tussen 2-200 kDa met een lagere pKa, waardoor de MES loopbuffer sneller dan de MOPS ⁴ lopen. Zo hebben deze twee buffers contrasterende effecten op de migratie van ionen in de stacking gel die leidt tot verschillen in de scheiding van de eiwitbanden ^4. Zet opzij en combineer 200 ml van 1x MES of MOPS loopbuffer met 500 ui Antioxidant, die zal worden gebruikt om de bovenste Buffer kamer van het Min vulleni-Cell elektroforeseapparaat.
3. Zodra de monsters worden afgewerkt verwarming, snelle draai monsters voordat u ze op ijs.
4. Voor de montage van de prefab Bis-Tris-gels in de Mini-Cell eenheid voor elektroforese volg de instructies van de fabrikant. Let op: zorg ervoor dat elke gel is gericht op een zodanige wijze dat de kortere (kleinere) cassette van elke gel naar binnen gericht in de richting van de Buffer Core en de gels zijn niveau en stevig gedrukt tegen de Buffer Core om lekkage uit de Eerste Kamer Buffer vermijden.
5. Vul het bovenste Buffer Kamer met de 200 ml 1x MES of MOPS Running Buffer met de Antioxidant en de Tweede Kamer Buffer van de Mini-Cell eenheid met ongeveer 600 ml 1x MES of MOPS Running Buffer. De extra 200-300 ml lopende buffer kan worden opgeslagen voor later gebruik. Het is echter niet aanbevolen de buffer tijdens de elektroforese run als pH en kwaliteit van de buffer kan worden gewijzigd recyclen.
6. Plaats 20 gl van elk eiwit sample in elk putje. Als het snijden het membraan in verschillende stroken om sonde voor meerdere antilichamen (dat wil zeggen meer dan 2), is het sterk aanbevolen om 2-5 ul van de voorgekleurde eiwit standaard in de eerste en de laatste putjes van elke gel te laden als deze zal dienen als snij geleidingen voor het scheiden van de verschillende delen van het membraan zonder dat de beeldvorming van de eiwitbanden.
7. Run gelen bij 200 V constant gedurende 35 minuten met een verwachte stroom van 110-125 mA / gel aan het begin en 70-80 mA per gel eind. Elektroforese is voltooid wanneer de tracking kleurstof migreert naar de platina draad langs de Buffer Core.

3. Eiwit Transfer De iBlot Dry Blotting System

1. Volledig de mini-gels te scheiden door het breken van de gebonden zijkanten van de cassette (dit kan een knetterend geluid produceren). Gooi de kortere (kleinere) plaat en de gel zorgvuldig te brengen van de langere (gleuf) plaat in een bak met gedemineraliseerd water enVerwijder de dikke voeten gedeelte van de gel aan de onderkant. Opmerking: in zeldzame gevallen kan de gel het langer hechten aan de kortere plaat in plaats van, sleuven plaat. In dit geval, gooi het langer spleetplaat en verwijder de dikke voeten gedeelte van de gel aan de onderkant. Dan voorzichtig de gel te brengen van de kortere plaat om gedemineraliseerd water.
2. Monteer de anode en kathode overdracht stapels volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: zowel nitrocellulose of PVDF-membranen bieden kwalitatief hoogwaardige en efficiënte overdracht van eiwitten en zijn compatibel met fluorescerende detectie ^8. Echter, PVDF membraan heeft een hogere bindingscapaciteit (240 ug / cm ³⁾ dan nitrocellulose (200 ug / cm ^{3) 8.}
3. Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen of lucht gevangen tussen de gel en membraan omdat dit een verstoring van het eiwit bands voorkomen tijdens de overdracht. Let op: doe het membraan of de transfer niet trimmener stapelen om uw gel maat passen, omdat dit zal direct contact tussen de anode en kathode stapels veroorzaken.
4. Na het correct monteren van de overdracht stapels op het droge blotting apparaat, selecteert u de juiste spanning programma (dwz Programma 3: 20 V voor 7 min) en beginnen met de overdracht. Opmerking: eiwitten groter dan 150 kDa neiging migreren langzamer en kan een langere overstaptijd van 8-10 min is. Bovendien zal voorafgaande incubatie van de gel in 20% ethanol gedurende 5-10 minuten ook helpen om de overdracht efficiëntie van deze grote eiwitten verbeteren. Zodra de overdracht programma is voltooid, wordt het apparaat automatisch uitschakelen van de stroom. Het beste is om onmiddellijk te verwijderen van de membraan en doorgaan met het blokkeren procedure beter eiwitdetectie waarborgen en te voorkomen uitdroging van het membraan.

4. Infrarood Fluorescent Protein Detection

1. Blok membraan (s) in een minimum van 0,8 ml / cm ² van Odyssey Blocking Buffer (Do Not Add Tween-20) gedurende 1 uur ofovernacht bij 4 ° C. Membraan (s) kan ook worden geblokkeerd met niet vette droge melk, maar dit kan leiden tot hogere achtergrond en interfereren met eiwitdetectie.
2. Incubeer membraan (s) in primair antilichaam in de gewenste concentratie in Odyssey Blocking buffer met 0,1% Tween-20 gedurende de nacht bij 4 ° C. Twee kleurdetectie, waarbij twee verschillende antigenen worden gevisualiseerd op dezelfde blot, moeten de twee primaire antilichamen afgeleid van verschillende gastheersoorten en gelijktijdig toegevoegd aan het membraan (s). Opmerking: voor het incuberen van het membraan (en) primair antilichaam, kan het membraan (s) worden gesegmenteerd in verschillende stukken om probe voor meerdere antilichamen (meer dan 2) op hetzelfde membraan.
3. Was membraan (s) 3x gedurende 10 minuten in TBS plus 0,1% Tween-20 met voorzichtig schudden.
4. Incubeer membraan (s) met de-fluorescent gelabelde secundaire antilichamen bij een verdunning van 1:20.000 voor de 700 nm kanaal en 1:6,000-1:10,000 voor de 800 nm kanaal in Odyssey Blocking buffer met 0,1% Tween-20 gedurende 30-60 min (incuberen membraan (s) langer dan 1 uur kunnen de achtergrond toenemen). Bescherm membraan (s) tegen licht. Opmerking: de secundaire antilichamen moeten worden afgeleid van dezelfde gastheersoort als elk van de primaire antilichamen en gelabeld met verschillende fluoroforen.
5. Was membraan (s) 3x gedurende 10 minuten in TBS plus 0,1% Tween-20 met voorzichtig schudden. Bescherm membraan (s) tegen licht.
6. Membraan (s) kunnen worden gedroogd of opgeslagen in TBS en PBS zonder Tween-20 bij 4 ° C totdat afgetast en afgebeeld met een infrarood Imaging System. Fluorescent signaal zal gedurende enkele maanden stabiel blijven indien goed beschermd tegen het licht.

Resultaten

Twee-kleuren infrarood fluorescentie detecteert zowel sterke als zwakke banden op hetzelfde membraan met verbeterde gevoeligheid en de hoogste signaal-ruisverhouding duidelijke Western blot beelden te produceren. Typische resultaten die door twee kleuren Western blot detectie gevisualiseerd in zowel de 700 nm en 800 nm fluorescentie kanalen worden toegelicht in figuren 1 en 2. De bovenste Western blot in figuur 1 toont de gelijktijdige (overlay) detectie van totaal ERK1...

Discussie

De kritische stappen in het genereren van hoge kwaliteit, kwantitatieve Western blots volgens dit protocol zijn de volgende: 1) het meten proteïneconcentraties; 2) monstervoorbereiding, 3) het blokkeren van het membraan en, 4) kwaliteit en kaliber van het primaire antilichaam.

De nauwkeurigheid van het meten van het totale eiwit-concentraties kan een grote impact hebben op het kwantificeren van eiwit bands sinds de uitzonderlijke gevoeligheid van infrarood fluorescerende detectie eventuele k...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A