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慢性EAE小鼠模型中神经干细胞/祖细胞的全身注射

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DOI：

10.3791/51154

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2014年4月15日

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1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

本文内容

摘要

神经干细胞/祖细胞（NPCs）的移植在神经再生医学领域具有广阔前景。系统性递送NPCs已成为一种高效、低侵入性的治疗方案，可将干细胞成功输送至患有实验性慢性中枢神经系统炎症损伤的啮齿类动物和非人灵长类动物的脑和脊髓中。

摘要

神经干细胞/前体细胞（NPCs）是用于移植治疗策略的一种前景广阔的干细胞来源，旨在实现再生神经学中的脑修复或功能重建。这一方向源于大量实验证据，表明在多种神经系统疾病的临床前模型中，通过局部或系统性移植NPCs可实现脑组织的修复。

这些实验数据表明，细胞递送途径是脑部疾病修复性干细胞治疗面临的主要障碍之一，亟需进行评估。对于表现为孤立且可触及的脑部病灶的疾病，如脊髓损伤和帕金森病，脑实质内干细胞移植是一种合理的策略。然而，这一原则在具有多灶性、炎性以及在时间和空间上广泛播散特征的疾病中应用效果较差，包括多发性硬化症（MS）。因此，通过系统性递送神经前体细胞（NPC）靶向脑组织，已成为一种微创且具有治疗效力的方法，可用于将细胞递送至患有实验性慢性中枢神经系统（CNS）炎症损伤的啮齿类动物和非人灵长类动物的脑和脊髓中。

这种替代性的细胞递送方法依赖于NPC的趋向性，特别是其固有的能力：（i）感知微环境 通过 功能性细胞黏附分子以及炎症性细胞因子和趋化因子受体；(ii) 在静脉内注射后穿过渗漏的解剖屏障i.v）或脑室内（脑室内) 注射；(iii) 在脑和脊髓炎性损伤的多个血管周围部位积聚；以及i.v.对不同的宿主靶细胞产生显著的组织营养和免疫调节作用 体内.

本文介绍了我们在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中建立的同基因型神经前体细胞（NPCs）经静脉（i.v.）和颅内脑室（i.c.v..）递送方法，该模型用于模拟慢性中枢神经系统炎症性脱髓鞘。我们预期，系统性干细胞递送将成为再生神经病学中靶向炎症脑组织的一种有效技术。

引言

来自体内研究的强有力证据表明，在中枢神经系统疾病动物模型中移植体神经干细胞/前体细胞（NPCs）具有显著的治疗效果1-8。然而，在将这些实验结果转化为临床应用之前，必须仔细考虑与干细胞向宿主体内递送相关的若干问题。对于多灶性、慢性的炎症性脑病的（非造血性）修复性干细胞治疗而言，一个尤为重大的挑战是确定NPC注射的最佳途径。要确定干细胞递送的最佳方案，必须充分理解目标疾病的病理生理学特征（局灶性或弥散性；原发性炎症性或原发性变性），并对递送技术的可行性及相关风险进行审慎分析。

尽管局灶性（例如 进入神经系统实质）干细胞移植是治疗以局部损伤为特征的中枢神经系统（CNS）疾病（例如 帕金森病和亨廷顿病、脑与脊髓创伤性损伤以及脑卒中）的一种合理策略，但在多发性硬化症（MS）等疾病中，由于中枢神经系统损伤具有多灶性、慢性且空间上广泛播散的特点，并随时间逐渐累积，这种相同的方法可能在实际操作中并不可行。在此类情况下，将细胞移植靶向各个病灶还受到移植的神经前体细胞（NPCs）在中枢神经系统实质内长距离迁移能力有限的限制，因此迫切需要探索其他更合适的、侵入性更小的NPC移植途径以实现对中枢神经系统的有效靶向治疗。

NPCs靶向颅内肿瘤的观察结果展现出巨大前景例如. 胶质瘤）在小鼠体内经血管外周注射后可在中枢神经系统外形成肿瘤9。继这一开创性研究之后 体内 干细胞病理趋向性的证据10，已有大量数据表明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验动物模型中，系统性移植神经前体细胞（NPCs）在治疗炎症性中枢神经系统损伤方面的可行性和治疗效果 通过 静脉内（i.v.) 或脑室内（脑室内（i.c.v）NPC 注射1,2,5,6,8.我们首次证实，这一过程依赖于移植的神经前体细胞（NPCs）靶向并进入炎症中枢神经系统的能力，以及随后在特定微环境中启动多种细胞间通讯程序的能力。 体内11为了特异性靶向中枢神经系统，将神经前体细胞直接递送至脑脊液（CSF）循环中 脑室内 注射，或进入血液 通过 i.v. 注射后，一旦进入血液或脑脊液（CSF），移植的神经前体细胞（NPCs）会主动与血脑屏障（BBB）或血脑脊液屏障（BCSFB）相互作用，并迁移至中枢神经系统实质。NPC移植物与BBB（或BCSFB）之间的这种相互作用由NPC表面特定的一组细胞黏附分子（CAMs）所调控，并通过活化的内皮/室管膜细胞高表达CAM的相应配体而得以促进。12-14这些细胞黏附分子（CAM）的例子包括透明质酸受体CD44，以及细胞间黏附分子（ICAM）-1配体极迟抗原（VLA）-4。5,15,16 （在白细胞中负责与活化的室管膜细胞和内皮细胞相互作用），以及较低水平的淋巴细胞功能相关抗原（LFA）-1和P-选择素糖蛋白配体（PSGL）-1。NPCs还表达多种趋化因子受体，包括CCR1、CCR2、CCR5、CXCR3和CXCR4（但不表达CCR3和CCR7），这些受体在功能上均具有活性，两者 体外 和 体内5,16因此，全身注射的神经前体细胞利用这些黏附分子以及G蛋白偶联受体（GPCRs），在炎症性中枢神经系统部位富集。相反，全身注射的神经前体细胞在健康小鼠中不会进入中枢神经系统 通过 血管或脑脊液通路2因此，中枢神经系统炎症，或由全身注射细胞因子或脂多糖（LPS）引起的内皮/室管膜细胞活化作为化学诱导性脑炎模型，对于全身注射的神经前体细胞在脑和脊髓中的聚集是必要的。2因此，通过全身性NPC疗法成功靶向中枢神经系统，依赖于识别疾病特异性的“机会窗口”（WoO），即在该窗口期内，脑和脊髓的微环境有利于NPC的聚集及其跨内皮迁移。此类条件通常出现在急性与亚急性炎症的背景下。17进入中枢神经系统后，移植的未分化NPC已被证明可改善患有EAE的小鼠以及较大非人灵长类动物的临床病理特征。这种改善被描述为仅依赖于极少的细胞替代2 以及在中枢神经系统血管周围显著分泌具有免疫调节和神经保护作用的旁分泌因子2,5,6,18 对比 非中枢神经系统炎症区域19,20 (例如 淋巴结）以响应浸润性免疫细胞引发的炎症细胞信号5.

本文描述了将体性神经前体细胞（NPCs）系统性注射到慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中的关键方法学要点。更具体而言，我们定义了已建立的实验方案，包括：（i）从小鼠成年C57BL/6品系的侧脑室下区（SVZ）分离、扩增并制备用于移植的体性NPCs；（ii）在这些小鼠中诱导慢性EAE；以及（iii）对EAE小鼠进行具有治疗效果的系统性（i.v. 或 i.c.v）NPC移植。

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方案

所有涉及动物的操作均依照英国政府内政部根据《1986年动物（科学程序）法案》批准的实验动物护理原则进行（项目许可编号 PPL No. 80/2457，授予 SP）。

1. 从小鼠成年脑室下区（SVZ）分离体细胞神经干细胞/前体细胞（NPCs）

  1. 解剖器械和培养基的准备
    注意：这两种溶液必须在解剖器械准备前1-2小时配制，并在使用前至少20-30分钟于37 ºC预热（有助于稀释木瓜蛋白酶并优化酶活性）。
    1. 高压灭菌一把直头尖头剪刀、一把小型手术剪刀和两把小型带齿弯镊。
    2. “消化”溶液：准备两个独立的50 ml离心管，分别加入：
      溶液1：25 ml Earle's 平衡盐溶液（EBSS）＋10 mg 乙二胺四乙酸（EDTA）＋10 mg L-半胱氨酸；以及
      溶液#2：25 ml EBSS + 50 mg 木瓜蛋白酶。
    3. 配制“完全生长培养基”（CGM）：在完全小鼠基础培养基中加入小鼠增殖添加剂、肝素（0.002%）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；10 ng/ml）、表皮生长因子（EGF；20 ng/ml）以及抗生素（青霉素/链霉素）。
  2. 脑解剖
    注意：由于颞骨边缘锋利，去除时容易损伤组织。为避免此问题，需用镊子牢固夹住骨骼，用力拔出，直至整块骨骼完全移除。
    1. 每次制备NPCs时，通过颈椎脱位法处死5-7只4-8周龄的C57BL/6小鼠。
    2. 用70%乙醇（溶于水）清洁处死小鼠的毛发，然后用直头锐利剪刀在耳后剪断以取下头部；
    3. 使用小型手术剪在中线处做切口，剪开颅骨上方的皮肤。用镊子将两侧皮肤折起，暴露颅骨。
    4. 使用小型手术剪在颅底两侧各做一处小切口，去除脑桥/延髓下方的颅骨（腹侧颅骨）。随后牵拉并取出颞骨。用同一把手术剪沿颅骨从基底部至嗅球处进行全长剪切，注意不要损伤脑表面。同时，在额骨与眼球之间做一剪切，以利于顶骨的移除。用两把镊子分别夹住两侧顶骨并向外牵拉，逐步去除颅骨。在牵拉过程中需注意保护脑膜，避免在去除骨片时损伤脑组织。
    5. 颅骨去除后，将镊子插入脑组织与颅骨之间，彻底分离残留的脑膜。轻柔地将脑组织从颅腔中抬起。剪断视神经以完全释放脑组织，最后将脑放入含有冷磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中收集。
    6. 将离心管置于冰上，并对所有小鼠重复相同操作。
  3. SVZ解剖、神经球形成与维持实验
    平均细胞数 × 稀释倍数 × 104

    其中 104 表示血细胞计数板计数室的总体积转换（总体积 = 0.1 mm³）3 -> 10-4 cm3 -> 10-4 ml）。在考虑稀释倍数时，必须同时计入使用CGM进行的稀释和使用活体染料进行的稀释。例如，若在四个角的方格中总计数到160个细胞，则细胞悬液的最终密度（cells/ml）为：

    160/4 × 5（用CGM稀释）× 2（用活体染料稀释）× 104
    1. 打开配备有解剖显微镜的解剖通风橱。
    2. 使用70%乙醇（溶于水）清洁所有表面，并喷洒抗支原体溶液以降低污染风险。
    3. 在烧杯底部铺上无菌纱布（以保护锋利器械），加入70%乙醇（溶于水）。将两把镊子、一把显微剪刀和一把手术刀片浸入乙醇中。
    4. 将整个大脑放置于脑切片矩阵中。
    5. 使用两片剃须刀片，从脑前极向后2 mm处进行冠状切面切割，排除视束，并在上一次切口后方3 mm处进行第二次切割；将组织置于洁净的培养皿中。
    6. 在解剖显微镜下分离SVZ组织，并切成1 mm大小3 使用虹膜剪将组织剪成小块。所有脑组织均重复此操作。
      1. 将上述两种溶液（第1.1.2节）充分混合，并在脑组织解剖完成且SVZ组织准备进行消化后，立即通过0.22 μm滤膜过滤。
    7. 将切片转移至30 ml“消化”溶液中，用10 ml移液器轻轻重悬，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟2每15分钟轻轻振荡试管2-3次。
    8. 300 × g 离心 10 分钟
    9. 吸除上清液，将沉淀重悬于200 μl CGM培养基中，先用P1000移液器吹打10-20次，再用P200移液器吹打10-20次，直至获得单细胞悬液。
    10. 用CGM将悬液补至5 ml，转移至T25 cm²培养瓶中2 烧瓶
    11. 5-7天后 体外 （DIV）神经球将形成。将悬浮液收集至15 ml离心管中，以150 × g离心10分钟。
    12. 移除上清液，并将沉淀重悬于200 μl CGM中。
      使用P200移液器将神经球机械吹打100–150次，直至获得单细胞悬液，再用CGM定容至1 ml。
    13. 稀释细胞悬液， 例如 将10 μl细胞悬液加入40 μl CGM中，得到1:5稀释液，充分混匀。取10 μl稀释后的细胞悬液与10 μl活体染料混合，充分混匀。
    14. 将10 μl的1:1细胞悬液与活体染料溶液的混合液加入血细胞计数室中。分别计数4个角上的方格内活细胞（无色）和死细胞（蓝色）的数量。为确定每毫升的细胞数量，请使用以下计算公式：
    15. 重悬 2 x 105 5 ml CGM中的细胞转移至T25 cm培养瓶2 烧瓶
    16. 每隔 4–5 天重复步骤 1.3.11–1.3.12。从第二次扩增传代开始，通过活体染料排除法评估细胞活力，并按照克隆密度（8,000 个细胞/cm²）接种神经前体细胞（NPCs），开始建立连续的生长曲线21保持细胞数量，并每隔4-5天重复该操作。为绘制连续生长曲线，请按以下步骤进行：
      注意：为了获得良好的细胞制备效果，在培养4-5天后（DIV），细胞球直径应达到150-200 μm。为了准确估算细胞密度，必须找到最佳的稀释倍数，使血细胞计数板中的细胞分布均匀且互不重叠。理想情况下，总细胞数应在50-200个之间。计数时，仅统计位于方格内部且未接触边界的细胞。此外，细胞活力是获得健康细胞制备的关键因素，应高于90%。线性生长曲线也是健康细胞制备的另一个指标。
      1. 统计活细胞和死细胞的数量（例如 1.3 × 106).
      2. 通过将活细胞数量除以接种细胞数量来确定生长速率（例如 1.3 × 106/2 × 105= 6.5).
      3. 通过将前一时间点（初始时刻 = 2 × 10）存在的细胞总数乘以细胞生长速率，计算出细胞的总数量。5).
      4. 报告均值 ± 标准差，以建立线性趋势线。
    17. 从第6代开始，机械解离被酶解解离取代。在150 × g离心10分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬于200 μl细胞聚集体解离液中，使用P200移液器吹打重悬7–8次，于37 °C、5% CO₂条件下孵育10分钟。2.
    18. 用 P200 轻柔吹打重悬 7–8 次，以获得单细胞悬液，加入 800 μl CGM。对细胞（包括活细胞和死细胞）进行计数，并测定其存活率。重悬至 2 × 10⁶ 个细胞/mL5 5 ml CGM中的细胞转移至T25 cm培养瓶2 烧瓶
  4. NPCs 的病毒转导 体内 细胞追踪
    注意：为了验证病毒转导效率，应平行构建转导与非转导神经前体细胞（NPCs）的生长曲线。此外，克隆形成效率（即细胞制备物中能够形成神经球的细胞绝对数量）或基于DNA含量的细胞周期分析（使用碘化丙啶，PI）也可作为细胞状态的进一步指标。如果感染细胞的比例不理想，可对同一细胞群体重复一次病毒转导操作。当感染水平达到满意程度，且生长曲线与野生型细胞相当后，即可对转导的NPCs进行扩增和/或移植。
    1. 收获神经球并获得单细胞悬液。以高密度（1.5 × 10⁶6 T75 cm² 培养瓶中的细胞2 在10 ml CGM中
    2. 12小时后加入3 x 106 T.U./ml 第三代慢病毒载体 pRRLsin.PPT-hCMV，经工程化改造 E. coli-衍生的β-半乳糖苷酶（lacZ）或绿色荧光蛋白（GFP）。
    3. 48小时后，收集细胞，以300 × g离心10分钟，按1:1比例重新接种细胞。
    4. 传代3次后 体外 验证感染效率。流式细胞术常用于检测感染效率，通常认为满意的感染水平应达到75-95%的阳性细胞。在后续连续传代扩增3代后，再次检测感染效率，以验证标记基因表达的稳定性。
  5. 神经球冻存
    1. 从T25 cm培养瓶中收获神经球2 离心管，300 × g 离心 10 分钟，弃上清液。
    2. 用1 ml冻存液（CGM加10%二甲基亚砜（DMSO））重悬细胞沉淀。
    3. 将冻存管置于 -80 °C 冻存盒中。
    4. 至少24小时后，将细胞转移至冻存盒中，在-80 °C条件下可保存数月，或转移至液氮（N2用于长期保存。
  6. 神经球解冻
    注意：为避免神经前体细胞（NPCs）与DMSO长期接触产生毒性作用，解冻过程必须尽可能迅速。
    1. 从 -80 °C 中取出冻存管2 并将其置于干冰上保存。
    2. 将冻存管置于水浴中快速解冻，直至细胞悬液几乎完全融化，仅剩少量冰晶悬浮物。
    3. 用 5 ml 预热的新鲜 CGM 重悬细胞悬液。
    4. 300 × g 离心 10 分钟
    5. 移去上清液，用 5 ml 新鲜 CGM 轻柔重悬细胞，将细胞悬液接种至洁净、未经处理的 T25 cm 培养瓶中2 烧瓶
  7. 1.7）NPC 表征
    注意：最后一次洗涤的 PBS 可替换为含 0.05% 叠氮化钠的 PBS，以防止真菌生长或污染，盖玻片可于 4 °C 保存 2–3 周。

    注意：若需对细胞内标志物进行染色，应在封闭液的 PBS 中加入通透剂。如果一抗来源于山羊，则封闭液中应使用牛血清白蛋白（BSA）或其他非山羊来源的血清。

    注意：若需对细胞内标志物进行染色，应在一抗溶液中加入透化试剂。
    1. 将一个13 mm的玻璃盖玻片放置于24孔板底部。在每张盖玻片上加入150 μl包被液，形成一小滴。于37 °C、5% CO₂条件下孵育至少30分钟。2.
    2. 收获神经球并解离，以获得单细胞悬液。
    3. 计数活细胞并稀释至80,000个细胞/35 μl。轻轻抽吸除去盖玻片上多余的包被液，加入35 μl细胞悬液进行接种。
    4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 25 分钟2在相差显微镜下快速检查细胞是否已开始贴壁。
    5. 通过将基础小鼠培养基与适当的补充剂混合来制备分化培养基（参见 表1）和抗生素（青霉素/链霉素）。
    6. 加入400 μl分化培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.
    7. 在培养3天后，用新鲜的分化培养基更换一半的培养液。
    8. 6天体外培养后，移除培养基，用PBS洗涤一次。在化学通风橱中移除PBS，加入300 μl预热的含4%蔗糖的4%多聚甲醛（PFA）。室温（RT）孵育5分钟。移除PFA，用PBS洗涤3次。
    9. 进行免疫细胞化学实验时，移除PBS，加入含10%正常山羊血清（NGS）的PBS（封闭液），室温孵育1小时。
    10. 除去封闭液，加入用含1% NGS的PBS稀释的目标一抗。4 °C过夜孵育，或在室温下孵育120分钟。
    11. 孵育后，用 PBS 洗涤 2 次。加入用含 1% NGS 的 PBS 稀释的适当二抗，室温孵育 60 分钟。
    12. 用 PBS 洗涤 2 次，然后在避光条件下，用含通透剂的 PBS 将 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）按 1:20,000 稀释后对细胞核进行复染，室温孵育 3 分钟。用 PBS 洗涤 2 次，再用蒸馏水洗涤 1 次。
    13. 在玻璃载玻片上滴加一滴封片剂，用镊子将盖玻片带有细胞的一面朝向封片剂进行封片。轻轻按压盖玻片以挤出多余的封片剂。将载玻片置于室温避光处，待封片剂完全干燥后，于 4 °C 保存。

2. C57Bl/6 小鼠中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的实验性自身免疫反应

  1. 乳化液的制备
    1. 在玻璃烧杯中制备乳化液，其中包含含 4 mg/ml 结核分枝杆菌［又称完全弗氏佐剂（CFA）］的不完全弗氏佐剂，以及 200 μg MOG（肽段 35-55），每只小鼠所需乳化液总体积为 300 μl。
      注：MOG免疫小鼠在CFA中的适当对照组为仅用CFA免疫的小鼠。MOG免疫小鼠的疾病发作预期变异为 11.3 (±1.8) dpi。

      注：计算所需乳化液总体积时，应按待免疫小鼠数量的两倍体积准备。优先使用玻璃器皿而非塑料器皿，以尽量减少乳化液的浪费。
      1. 使用带有19 G针头的玻璃注射器混合约30分钟，并始终将乳化液置于冰上。
      2. 为验证乳化液是否制备完成，将少量乳化液滴入水中。只有当液滴保持原形而不扩散时，乳化液才可进行注射。
      3. 用仅含CFA的乳化液免疫对照组小鼠，实验组小鼠（MOG免疫）则使用含MOG的CFA乳化液。MOG免疫小鼠的疾病发作预期变异为 11.3 (±1.8) dpi。
    2. 将19 G针头转移至1 ml塑料注射器，吸取乳化液。避免产生气泡，更换为25 G针头，并将注射器置于冰上。装有乳化液的注射器即可使用，应于冰上保存数小时。
  2. 免疫接种
    1. 将小鼠（6-8周龄，雌性）放入加温箱中，等待约10分钟，使尾静脉扩张。
    2. 将一只小鼠从加温箱转移至小鼠固定器中，关闭固定器以防止小鼠移动。
    3. 用1 ml胰岛素注射器吸取100 µl百日咳毒素（5 μg/ml），避免产生气泡。缓慢将溶液注入尾静脉。拔出针头后，用纸巾轻压数秒以止血。
    4. 将小鼠放回笼中，并对所有小鼠重复相同操作。
    5. 通过持续吸入异氟烷（1-2%，2 L/min）麻醉一只小鼠，并在两侧 flank 区域及尾根部皮下注射100 μl乳化液（每只小鼠共300 μl乳化液）。缓慢拔出注射器，避免乳化液泄漏。
    6. 用耳标打孔器标记小鼠，将其放回笼中并观察直至完全恢复。对所有小鼠重复此步骤。
    7. 48小时后（免疫后第2天，dpi），重复步骤2.2.3。
  3. EAE小鼠的行为学分析
    1. 从免疫后第5天（5 dpi）开始，每日称量小鼠体重，并使用表1中描述的评分系统监测其运动功能表现。

3. 将神经干细胞/祖细胞注射至尾静脉（i.v.）

  1. 细胞准备
    1. 以 300 × g 离心 10 分钟收集神经球。
    2. 弃去上清液，加入 200 μl 细胞聚集体解离液。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
    3. 使用 P200 移液器轻柔吹打 10–12 次（避免产生气泡），直至获得单细胞悬液，再用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的基础培养基补至 800 μl。
    4. 使用活细胞染料检测细胞活力并计数，随后用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的基础培养基将细胞悬液稀释至终浓度为 106 个细胞/150 μl。将细胞悬液置于冰上保存，待用。
  2. NPC i.v. 注射
    注意：理想的单细胞悬液解离效果以及避免气泡是两个关键因素，可降低细胞团块/聚集体或栓塞形成的风险，从而防止静脉阻塞及由此导致的动物死亡。
    1. 在疾病高峰期（感染后 16–18 天），称量小鼠体重并进行评分。根据评分将小鼠分组，确保各组间具有均一性。
    2. 将小鼠放入预热箱中，约等待 10 分钟，使尾静脉充分扩张。
    3. 将一只小鼠从预热箱转移至小鼠固定器中，并关闭固定器以防止其移动。
    4. 用 1 ml 胰岛素注射器吸取 150 μl 细胞悬液，确保完全排除气泡。缓慢将溶液注入尾静脉。拔出针头后，用纸巾按压注射部位数秒钟以止血（图 6A 和 6B）。
    5. 将小鼠放回笼中，观察直至其恢复。对所有小鼠重复上述操作。

4. 将神经干细胞/祖细胞注射至小脑延髓池（i.c.v）

  1. 细胞准备
    1. 以 300 × g 离心 10 分钟收集神经前体细胞（NPC）。
    2. 弃去上清液，加入 200 μl 细胞聚集体解离液。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
    3. 使用 P200 移液器轻柔吹打 10–12 次，直至获得单细胞悬液，再用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的基础培养基定容至 800 μl。
    4. 计数细胞，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的基础培养基稀释至所需细胞密度。将细胞悬液置于冰上保存，待用。
  2. 4.2) NPC 脑室内（i.c.v.）注射
    1. 在疾病高峰期（感染后 16–18 天），称量小鼠体重并进行评分。根据评分将小鼠分组，确保各组间具有同质性。
    2. 将小鼠置于立体定位仪上，持续吸入异氟烷（1–2%，2 L/min）。使用耳杆固定小鼠头部，然后调整口鼻固定装置，确保小鼠头部平坦且固定牢固。
    3. 用聚维酮碘（PVP-I）擦拭小鼠头部皮肤，在头部后部做切口以剪开皮肤，暴露颅骨。
    4. 使用显微操作器，将微量注射器针头通过颈部后方中线处完整的肌肉和韧带，插入枕骨与寰椎之间的裂隙。针头的弯曲部分应全程紧贴枕骨内表面，如文献22所述。
    5. 缓慢插入针头并等待数秒。操作者应学会识别针头“钩住”小鼠颅骨的感觉，然后再开始注射细胞悬液。在 3–5 分钟内缓慢注射所需体积的细胞悬液。注射完成后，将针头留置数秒，再缓慢拔出注射器。
    6. 缝合皮肤，将小鼠放入恢复笼中，直至完全苏醒。

5. 组织处理

  1. 用0.5 ml氯胺酮（100 mg/ml）、0.25 ml赛拉嗪（23.32 mg/ml）和4.25 ml无菌水的混合物深度麻醉小鼠，进行经心脏灌注，先用含EDTA的生理盐水冲洗，再用4%多聚甲醛（PFA）固定。取出脊柱和脑组织，并在4 °C条件下用4% PFA后固定12小时。用PBS洗涤组织，从骨骼中分离出脊髓，并将组织在4 °C下至少浸泡于30%蔗糖（PBS配制）中48小时。将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并按文献2所述方法用液氮速冻。
  2. 使用切片机将组织切成10–12 μm厚的切片。
  3. 或者，将新鲜组织包埋于琼脂糖中，使用振动切片机切成50–80 μm厚的切片。
  4. 上述两种情况下，均在37 °C下用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）溶液孵育过夜（O/N），以检测细胞核内的β-半乳糖苷酶活性。
  5. 将含有β-gal+细胞的切片重新切成5 µm厚的切片，并使用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，50 μg/ml）标记星形胶质细胞、抗神经元核抗原（NeuN，1 μg/ml）标记神经元、抗Nestin（10 μg/ml）标记未分化神经细胞，进行双重染色。
  6. 后续步骤按第1.7.11和1.7.12节所述进行。对于多重染色，务必使用偶联不同荧光染料的二抗。
  7. 对于含有GFP标记细胞的组织，按步骤5.1–5.3所述操作，随后进行多重染色。
  8. 向载玻片上滴加数滴封片剂，并加盖组织盖玻片。
  9. 对于使用生物素偶联抗体染色的组织，配制亲和素-生物素复合物（ABC溶液，见表2），并在室温下振荡孵育45分钟。
  10. 用1% H2O2孵育切片5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
  11. 用PBS洗涤两次。
  12. 在室温下用ABC溶液孵育1小时。
  13. 用PBS洗涤两次。
  14. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液和0.3% H2O2进行孵育。在显微镜下监测反应进程，一旦切片开始呈现棕褐色即刻用PBS洗涤（通常约5–10分钟）。
  15. 用PBS洗涤两次，并按步骤5.7所述进行后续操作。

材料与试剂的完整列表见表2。

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结果

NPC的衍生与鉴定
SVZ 解剖取材于 6 至 8 周龄 C57Bl/6 小鼠，每组使用 5–7 只小鼠，通过机械法和酶解法进行组织解离图1A）。在CGM中培养数天后，开始形成游离的神经球（图1A 和 1B）。原代球体每4-5天收集一次，并进行机械传代。传代时测定活细胞与死细胞数量，绘制累积细胞数以生成生长曲线（图1C）。这可以反映其增殖速率，从而为评估神经前体细胞（NPC）制备物的整体稳定性提供一个间接参数。当以神经球形式增殖时，NPCs 表达有丝分裂活性标志物（磷酸化组蛋白 H3，PHH3； 5 μg/ml以及未分化的神经细胞（例如 Nestin) (图 2A）. 经移植后在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中具有治疗效力的未分化神经前体细胞（NPCs）必须表达包括CD44在内的细胞表面黏附分子5 μg/ml），VLA-4 的 α4 亚基（10 μg/ml) (图 2F）。在适当的分化条件下培养时，NP...

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讨论

基于体细胞干细胞的疗法正成为治疗多发性硬化症（MS）等慢性炎症性中枢神经系统疾病最有前景的策略之一11。尽管维持其治疗效果的机制仍需进一步阐明，但神经前体细胞（NPC）移植在多种神经退行性疾病实验模型中已展现出显著作用，这引发了一种颇具争议的观点：干细胞疗法可能很快将应用于人体研究。然而，在设想这些创新疗法的潜在临床应用之前，我们必须面对一些关键问题并解答若干尚未明确的疑问，例如确定最适合移植的干细胞来源（自体移植 vs 异体移植，多能性 vs 多潜能性）以及最佳给药途径。

神经退行性疾病的病理生理学各不相同，有些疾病具有空间局限性（例如 脊髓损伤、脑卒中），而另一些则表现为时空上的播散（例如 多发性硬化症）。因此，对局灶性病变而言，局部注射（干细胞）可能是一种合适的治疗方法；但对于存在多灶性脑损伤的弥漫性病变，这种方法可能效果不足，甚至完全不可行，这构成了需要克服的额外挑战。

大量一致的证据表明，静脉输注可能是一种有效且侵入性较低的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jayden Smith 对手稿的批判性审阅和校对。本工作获得了美国国家多发性硬化症协会（NMSS，部分资助项目编号 RG-4001-A1）、意大利多发性硬化症协会（AISM，资助项目编号 2010/R/31）、意大利卫生部（GR08-7）、Wings for Life、拉古萨农业人民银行（BAPR）、欧洲研究理事会（ERC）在 ERC-2010-StG 资助协议编号 260511-SEM_SEM 下的支持，以及欧洲共同体（EC）第七框架计划（FP7/2007-2013）在资助协议编号 n° 280772-iONE 下的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养
EBSSSigmaE2888
L-半胱氨酸Sigma AldrichC7352
木瓜蛋白酶Worthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
小鼠 NeuroCult 基础培养基Stem Cell Technologies05700
NeuroCult 增殖添加剂Stem Cell Technologies05701
肝素SigmaH3393
碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B-1000
表皮生长因子PeprotechAF-100-15-1000
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Invitrogen1514012
Matrigel（包被溶液）BD Biosciences354230
NeuroCult® 分化试剂盒（小鼠）Stem Cell Technologies05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（10倍浓缩）PAA LaboratoriesH15-011
Myco tracePAA LaboratoriesQ052-020
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650
免疫荧光
正常山羊血清PAA LaboratoriesB11-035
聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚Sigma AldrichT8787
小鼠抗 Nestin 抗体Abcamab11306
兔抗 GFAP 抗体DAKO203344
小鼠抗组蛋白 H3（磷酸化 S10） Abcamab14955
兔抗 MAP-2 抗体Abcamab32454
大鼠抗 MBP 抗体AbD SEROTECMCA409S
抗 O4 抗体，克隆 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
封片液DAKOS3023
EAE
不完全弗氏佐剂Sigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35–55) Espikem
百日咳毒素List Biological Laboratories181
组织处理
直头虹膜剪Fine Sciences Tools14060-09
钝头/弯头镊子Fine Sciences Tools11080-02
脑组织切片器Zivic InstrumentsBSMAS005-1
手术刀片Swann-Morton324
P200、P1000 移液器
氯胺酮（Vetalar）Boehringer Ingelheim01LC0030
赛拉嗪（Rompun）Bayer32371
立体定位仪KOPFModel 900
Hamilton 注射器Hamilton7762-04
多聚甲醛（PFA）Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒Vector LaboratoriesPK-6100

参考文献

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  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
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  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
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