Summary
В этом видео мы демонстрируем протокол для вскрытия поперечной мышцы абдоминиса мыши и используем иммунофлуоресценцию и микроскопию для визуализации нервно-мышечных соединений.
Abstract
Анализ нейромышечной морфологии соединения может дать важное представление о физиологическом состоянии данного моторного нейрона. Анализ тонких плоских мышц может предложить значительное преимущество по сравнению с традиционно используемыми более толстыми мышцами, такими как мышцы заднейконечности (например. гастрочнемиус). Тонкие мышцы позволяют всесторонне о обзоре всей иннервации данной мышцы, что, в свою очередь, позволяет идентифицировать выборочно уязвимые пулы моторных нейронов. Эти мышцы также позволяют анализ параметров, таких как размер моторного блока, аксональный ветвление, и терминал / нодаль прорастания. Общим препятствием в использовании таких мышц является получение технических знаний, чтобы вскрыть их. В этом видео мы подробно протокол для вскрытия поперечного abdominis (TVA) мышцы от молодых мышей и выполнения иммунофторесценции для визуализации аксонов и нервно-мышечных соединений (NMJs). Мы демонстрируем, что этот метод дает полный обзор иннервации картины мышцы TVA и может быть использован для исследования патологии NMJ в мышиной модели болезни моторных нейронов детства, спинальной мышечной атрофии.
Introduction
Нейромышечные соединения (NMJs) являются синаптической связью между нижним моторным нейроном и скелетным мышечным волокном. Они традиционно считаются трехсторонней синапсе, состоит из нейрона (пресинаптического терминала), мышечного волокна (пост синаптический терминал) и терминальной ячейкиШванн 1. NMJs, как представляется, ранние и значительные цели в патологии в ряде заболеваний моторных нейронов и мышимодели 2,3. Типичными симптомами являются денервация, при которой двигательная эндплейт становится лишенной пресинаптической иннервации, отек пресинаптического терминала и снижение сложности морфологии NMJ4-11. Компенсационные ответы также могут быть отмечены, которые включают терминал и норд прорастания, где аксональные процессы простираются от оставшихся синаптических терминалов или интернодов до reinnervated denervated endplates12,13. Из-за жесткой корреляции между синаптической активностью и морфологией NMJ, можно получить много информации о функциональном состоянии моторных нейронов из анализа морфологии NMJ. Поскольку потеря NMJ часто представляет собой один из первых аспектовнервно-мышечной патологии 4,10, количественная оценка на уровне иннервации может дать важную информацию о прогрессировании патологии и потенциальном эффекте терапевтического вмешательства. Кроме того, поскольку потеря NMJ представляет собой значительный шаг в патологическом прогрессии, развитие терапевтических средств, которые могут стабилизировать связи и стимулировать регенерацию, может принести значительную пользу.
При анализе морфологии NMJ, выбор мышц имеет большое значение. Некоторые из основных соображений могут включать тип мышечного волокна, положение тела, и сравнительный анализ условий жизни человека. Кроме того, в тех случаях, когда требуются такие манипуляции, как инъекция веществ или травматическая травма нерва, важно также учитывать экспериментальную доступность. В целом, предпочтительнее анализировать диапазон мышц, расположенных по всему телу, отражающий ряд подтипов моторных единиц. Часто, однако, выбор мышц зависит от простоты вскрытия. Следовательно, анализ NMJ часто выполняется исключительно на больших аппендикулярных мышцах, таких как гастрокнеймиус. Для получения хорошего Окрашивания NMJ в таких мышцах часто требуется секционные или механические нарушения мышечных волокон. В результате, иннервация картина может стать нарушена и всеобъемлющий и высококачественный анализ иннервации моделей, прорастания и денервации часто скомпрометирована. Альтернативный подход заключается в использовании тонких плоских мышц, которые не требуют секции и могут быть окрашены и установлены нетронутыми, что позволяет всеобъемлющий обзор всей иннервации мышц. Есть ряд мышц, которые могут быть использованы для такого анализа, в том числе группа черепных мышц, (охватывающих леватор auris longus, auricularis выше, и аддуктор auris longus)14, грудные мышцы(например. триангуляции стерни) 15, и брюшной(например, поперечные abdominis (TVA)) мышцы. Основным препятствием в использовании таких мышц является техническая экспертиза, необходимая для вскрытия их без повреждений.
В этом видео, мы предоставляем протокол для вскрытия и выполнения иммунофлуоресцентной маркировки мышцы TVA от мыши, чтобы позволить всеобъемлющий анализ иннервации картины и морфологии NMJ. Мышцы TVA является преимущественно медленно дергаться мышцы, состоящие из глубочайшего слоя брюшной мускулатуры и innervated нижних межреберных нервов. Предыдущая работа показала, что он постоянно очень уязвим к патологии в ряде моделей мыши детства двигательной нейронной атрофии спинальной мышечной атрофии (SMA) и в других моделях мыши раннего начала двигательной дегенерациинейронов 4,16. Поэтому мы предлагаем, что TVA является полезной мышцей для проведения анализа NMJ в периферических невропатий.
Protocol
Все процедуры должны выполняться в установленные учреждением стандарты по уходу за животными.
1. Рассечение брюшной мускулатуры от мыши
- Перед началом, составляют 4% параформальдегид (PFA). Внимание: Всегда держите PFA в паровом капюшоне и носите соответствующее защитное оборудование.
- Усыпание мыши утвержденным методом. Примечание: Мышь, показанная на видео, была усыпляется передозировкой CO2 и вывихом шейки матки. Эта мышь представляет собой 4-недельную мышь дикого типа на гибридном фоне CD1/C57Bl6. Эта мышь была выведена в животных объектов в Университете Оттавы от мышей, которые были первоначально приобретены.
- Сделайте первоначальный разрез через кожу на уровне бедра и прорезать кожу всю дорогу вокруг мыши.
- Очистите кожу, потянув вверх, пока не достигнете уровня forelimb.
- Вырезать через брюшную мускулатуру на уровне бедра и продолжать разрез, пока не достигнет позвоночного столба.
- В этот момент, начать резать вверх через мускулатуру и ребра, пока вы не достигнете верхней конечности.
- Вырезать прямо поперек, пока вы не достигнете позвоночного столба на другой стороне.
- Вырезать вниз, пока вы не достигнете точки, в которой вы начали.
- Отпустите диафрагму снизу (заботясь, чтобы не повредить мышцу TVA) и поместите его в фосфат буферный солевой раствор (PBS) в SYLGARD покрытием рассечения блюдо с 0,2 мм рассечения булавки.
- Прикрепите грудную клетку и связанные с ней мускулатуры в блюдо, поверхностные стороны вверх, убедившись, что мышцы полностью растягивается.
- Слейте 1x PBS и заменить 4% PFA.
- Накрыть крышкой и оставить на качалке при комнатной температуре на 15 мин.
- Вымойте 3x в 1x PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
В этот момент фиксированные мышцы могут быть оставлены в холодильнике на ночь перед последующим вскрытием.
2. Изоляция мышц TVA
- Чтобы приступить к изоляции мышцы TVA, под микроскопом вскрытия, начните с резки через внешнюю косую мышцу на уровне последних нескольких ребер (см. рисунок 1 для аннотированного руководства).
- Вырезать прямо рядом с linea Альба (забота, чтобы не прорезать TVA ниже), пока вы не достигнете начала внутренней косой мышцы.
- Затем разрезать, чтобы освободить чрезмерно rectus abdominis и внешних косых мышц из верхней части TVA ниже.
- Удалите кровеносный сосуд и любой чрезмерного жира из мышцы TVA.
- Освободите мышцу от чрезмерного последнего ребра.
- Вырезать вокруг края мышцы и удалить на 24-хорошо пластины, содержащей PBS.
3. Иммунофлюоресцентная маркировка и микроскопия мышцы TVA
Для всех последующих шагов снимите жидкость с помощью тонкой наконечником пипетки и оставьте пластину на качалочной платформе. Если не указано иное, все последующие шаги выполняются при комнатной температуре.
- Инкубационный в PBS, содержащий 1:1,000 флуоресцентно помечены bungarotoxin в течение 30 минут, чтобы обозначить NMJs. Это можно сделать в темной комнате или под фольгой.
- Permeabilize мышцы, добавив 300 мкл на колодец 2% Triton X-100 в PBS и оставить на качалки платформы в течение 30 мин.
- Инкубация в блокирующих реагентах (4% BSA, 1% Triton в PBS) в течение 30 мин.
- Инкубационный в блокировании реагент, содержащий первичные антитела (нейрофиламент 1:100; синаптический белок пузырьков 2, 1:250) при 4 градусах Цельсия за ночь.
- Вымойте 3x в 1x PBS.
- Инкубация в PBS, содержащая 1:250 вторичных антител в течение 2-4 часов.
- Вымойте 3x в 1x PBS.
- Намонтировать мышцы на стеклянные горки с использованием достаточного флуоресцентного монтажа средств массовой информации и крышки.
- Слайды лучше всего просматривать с помощью фильтра двойного диапазона прохода на стандартном эпифлюоресцентном микроскопе.
- NMJ лучше всего известен с помощью проекции z-серии на конфокальцаторе, оснащенном, по крайней мере, целью 40X.
Representative Results
Вышеупомянутый протокол направляет изоляцию и окрашивание мышц TVA для анализа NMJ. Это позволяет провести анализ структур иннервации мышц, а также анализ морфологии NMJ с высоким разрешением(рисунок 2). Этот метод может быть успешно применен для выявить патологию NMJ в мышиных моделях двигательных нейронов, таких как SMA4,17(рисунок 3). В мышиных моделях SMA существует значительная внутримышечная изменчивость в патологии, однако мышца TVA постоянно сильно влияет. Об этом свидетельствует денервация моторных эндпластов, накопление неврофиламентов на пресинаптическом терминале и прорастание терминала(рисунок 3). Представленные здесь результаты показывают, что описанный выше метод может быть мощным методом для обеспечения всестороннего обзора иннервации и анализа патологии NMJ в моделях мыши.
Рисунок 1. Обзор брюшной мускулатуры мыши. (A) Изображение показывает грудной клетке с прилагается брюшной мускулатуры, которая была удалена из недавно усыпанной мыши и возлагали в рассечение блюдо поверхностной сторонойвверх( ). (B)Рассечение в А было аннотировано, чтобы отметить приблизительные границы мышц живота. Поверхностные мышцы живота можно увидеть на левой стороне вскрытия, и включают в себя внешние косые (очерченные синим цветом) и rectus abdominis (очерченные красным цветом). На правой стороне вскрытия, поверхностные мышцы были удалены позволило визуализации поперечной мышцы abdominis (очерченные зеленым цветом) и внутренней косой мышцы (очерченные желтым цветом). Цель этого протокола состоит в том, чтобы направить вскрытие верхней части мышцы TVA, показанной здесь как сплошной зеленый треугольник. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. Цельно-монтаж обзор нервно-мышечных соединений в мышцах TVA. Изображения, показывающие пример NMJs из мышцы TVA визуализированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием для неврофиламента (NF; зеленый), синаптический протеин пузырьков 2 (SV2; зеленый) и бунгаротоксин (BTX; красный). Изображения монтаж флуоресцентные микрографы, показывающие всю мышцу (A) или конфокальные изображения, показывающие группы (B) илиотдельных( C ) NMJs. Шкала бар 800 мкм (A), 70 мкм (B), 25 мкм (C). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Нейромышечная патология соединения в мышце TVA от мышиной модели SMA. Конфокальные микрографы, показывающие NMJs из мышцы TVA визуализированы с иммунофлуоресцентным окрашиванием для нейрофиламента (NF; зеленый), синаптический протеин пузырьков 2 (SV2; зеленый) и бунгаротоксин (BTX; красный) от любого контроля(Smn2B /) или SMA мыши модели (Smn2B / -). Обратите внимание, что в то время как нормальная морфология NMJ может наблюдаться у контрольных мышей, в мышцах TVA от Smn2B/- мышей есть свидетельства полной денервации (белая наконечник стрелы), частичной денервации (фиолетовая наконечник стрелы) терминальной прорастания (голубая наконечник стрелы) и пресинаптического отека (желтая наконечник стрелы). Пост-синаптические конечные пластины также менее сложны, отражая явно менее зрелый фенотип. Шкала бар 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение больше .
Discussion
В этом видео, у нас есть подробный протокол для вскрытия мышцы TVA от мыши и для всей установки иммунофторной маркировки NMJs в мышце. Мы также представляем данные, показывающие, что эта мышца может быть использована для анализа нервно-мышечной патологии соединения в мышиной модели SMA.
Успех в этом методе зависит от ряда факторов. Некоторые из наиболее распространенных проблем изложены ниже. Во-первых: плохое иммуногистохимическое окрашивание. Для этого может быть несколько причин, одной из наиболее распространенных из которых является использование различных реагентов к тем, которые перечислены в этом протоколе. Высокое качество электронной микроскопии класса PFA очень важно для обеспечения хорошего окрашивания, как и выбор антител, перечисленных в этом протоколе. Кроме того, у пожилых животных(т.е.> 3 месяца), получить хорошее качество окрашивания может быть сложнее. Это связано с увеличением толщины фасции, окружающей мышцу, и увеличением накопления жира между внешним косым и tranversus abdominis. Важно, чтобы сдирать жир, прежде чем приступить к иммунофлюоресценции. Это также может быть необходимо, чтобы сдирать некоторые фасции, покрывающей мышцы, которые могут стать утолщенными. Иногда трудно лишить фасции и жира из мышц, не понеся некоторые повреждения мышечного волокна и нарушения иннервации картины. Однако, если этот метод выполняется тщательно, хорошее качество окрашивания могут быть приобретены у мышей до по крайней мере 1 год. У более молодыхмышей (т.е.менее 3 месяцев) не должно быть необходимости выполнять какие-либо дразнить или разделения мышечных волокон. Во-вторых: трудно найти NMJs после вскрытия и окрашивания. Это часто потому, что вскрытие не распространяется под последним ребром. Большинство NMJs расположены чуть ниже последнего ребра и, следовательно, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить эту часть мышцы включены в вскрытие. В-третьих: присоединение мышцы ЭО к мышце TVA. Это часто жалоба, когда люди пытаются продлить вскрытие ниже уровня внутренней косой (IO) мышцы. Область мышцы TVA, где io также присутствует, труднее анализировать, так как может быть трудно различить, какая мышца есть какая. По этой причине, мы обычно просто вскрыть наиболее превосходную часть мышцы TVA. На этом уровне, нет никакой приверженности между мышцами EO и TVA, и поэтому это не должно быть существенной проблемой.
Одним из значительных препятствий для использования мышцы TVA, по сравнению с аппендикулярными мышцами, является доступность для хирургических манипуляций или инъекций веществ. Эти типы экспериментов могут иметь решающее значение для исследования физиологии NMJ в данной мышце. Хотя TVA, безусловно, менее легко доступны, чем более часто используемые мышцы, такие как tibialis передней или gastrocnemius, предыдущая работа показала, что можно denervate TVA хирургическим повреждением межреберныхнервов 18. Недавно мы также использовали эту мышцу для местного администрирования веществ под общим наркозом (неопубликованные данные). Хотя эти эксперименты могут представлять собой умеренную техническую проблему, эта работа показывает, что они осуществимы и, таким образом, расширить полезность этой мышцы для анализа NMJs под патологических и физиологических манипуляций.
Мышцы TVA является одним из ряда тонких плоских мышц, расположенных по всему телу, которые могут быть использованы для цельно-монтажного анализа иннервации моделей. Другие мышцы включают в себя группу черепных мышц иннервированы двигательных нейронов, происходящих из лицевого ядра ствола мозга, охватывающих levator auris longus, auricularis начальник, и аддуктор auris longus, вскрытия, для которых былиописаны ранее 14,19. Кроме того, мускулатура окружающих мышцы TVA, в том числе EO, IO, и rectus abdominis, также могут быть помечены и использованы для анализа NMJ. Для всестороннего анализа патологии NMJ в модели мыши, важно рассмотреть ряд мышц, расположенных по всему телу и не ограничивать анализ одной мышцы. Это иллюстрируется в мышиных моделях заболеваний моторных нейронов, где существует значительная неоднородность в уровнях патологии NMJ между различными мышцами20. Такая межмышечная изменчивость является чрезвычайно ценным инструментом при исследовании механизма уязвимости моторных нейронов и, следовательно, ограничение анализа одной мышцы может значительно уменьшить потенциал исследования.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (грант номер MOP 38040) для Р.К., мышечной дистрофии ассоциации (США) для Р.К., семьи SMA в Р.К. и Л.M.M, SMA Trust к T.H.G., и мышечной дистрофии кампании T.H.G. Л.M.M является получателем Рассеянного склероза общества Канады постдокторской стипендии, и Р.К. является получателем университета здравоохранения научно-исследовательский кафедры из Университета Оттавы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
