Utéro-tubaire transfert d'embryons et la vasectomie dans le modèle de souris

Résumé

Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées.

Résumé

Le transfert d'embryons de pré-implantation à une femme de substitution est une étape nécessaire à la production de souris génétiquement modifiées ou pour étudier les effets de modifications épigénétiques origine au cours du développement préimplantatoire sur le développement et la santé du fœtus adulte ultérieure. L'utilisation d'une technique de transfert d'embryons efficace et uniforme est essentielle pour améliorer la production d'animaux génétiquement modifiés, et à déterminer l'effet de différents traitements sur les taux d'implantation et de survie à long terme. Des embryons au stade de blastocyste sont généralement transférés par transfert de l'utérus, la réalisation d'une ponction dans la paroi utérine pour introduire la pipette de la manipulation de l'embryon. L'orifice effectué dans l'utérus ne se ferme pas après la pipette est retirée, et les embryons peuvent écoulement à la cavité abdominale, en raison de la pression positive de l'utérus. La ponction peut également produire une hémorragie qui affecte l'implantation, bloque la pipette de transfert et peut affecter l'embryon développement, en particulier lorsque les embryons sont transférés sans zona. Par conséquent, cette technique entraîne souvent des taux de survie faible embryon très variables et globaux. Éviter ces effets négatifs, le transfert d'embryon utéro-tubaire profiter de la jonction utéro-tubaire comme une barrière naturelle qui empêche l'embryon sorties et éviter la ponction de la paroi utérine. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-. Une technique pour effectuer la vasectomie est décrite en tant que complément au transfert d'embryons utéro-tubaire.

Introduction

Le transfert d'embryons est probablement l'intervention chirurgicale le plus souvent réalisée dans le modèle de souris. Cette technique est essentielle pour obtenir la progéniture d'embryons in vitro soumis à des techniques de manipulation dans et, par conséquent, constitue une étape nécessaire pour le développement de modèles génétiquement modifiés par injection pronucléaire, transduction lentivirus, ou la formation de chimère. En outre, la technique permet l'étude des effets sur le développement de diverses insultes qui se produisent au cours du développement préimplantatoire. L'utilisation des techniques de reproduction artifi....

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par la Région Beltsville soin et l'utilisation des animaux Comités (BAACUC 11-015) en conformité avec l'USDA Animal Care et Directives d'utilisation.

Une. Anesthésie et l'analgésie (commune pour les deux interventions chirurgicales)

1. Peser la souris et charger les anesthésiques et analgésiques suivants dans deux seringues de 1 ml avec 27 g d'aiguilles:
   1. La kétamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g d'une solution à 10 mg / ml) et de xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g d'une solution à 2 mg / ml).
   2. La buprénorph....

Résultats

Transfert d'embryons utéro-tubaire fournit un moyen de transférer les embryons dans l'utérus d'éviter certaines des complications associées au transfert d'embryon de l'utérus ^2,9,10. Dans le tableau 1, nous montrons un résultat représentatif, nous avons obtenu le transfert de blastocystes CD1 soumis à différents types de manipulations aux bénéficiaires CD1 suivant le protocole décrit. La survie à long terme (% des embryons résultant en un chiot) ou la survie à E15 (dans le.......

Discussion

La vasectomie est une technique chirurgicale relativement simple qui ne comporte pas de difficultés majeures. Quand la stérilisation avec de la povidone iode et de l'éthanol assurez-vous que le dernier lavage (avec de l'éthanol) supprime povidone iode, car il peut irriter le péritoine. L'accès au canal déférent peut également être obtenue par le scrotum ou la réalisation d'une incision transversale dans l'abdomen ^8. Incision scrotale a été recommandé de transversales incision abdo.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	À commander par un vétérinaire agréé.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	À commander par un vétérinaire agréé.
Buprénorphine	Générique	NDC 400-42-010-01	À commander par un vétérinaire agréé.
Pommade oculaire	Novartis	Genteal
Antibiotique	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Ajouté à l’eau de boisson (0,3 mg/ml d’amoxicilline trihydratée et 0,075 mg/ml de clavulanate de potassium). Ajouter 1,5 ml du flacon de 15 ml reconstitué à 250 ml d’eau.
Pince dentelée	ROBOZ	RS-8120	N’importe quelle pince droite en acier de qualité chirurgicale de taille moyenne fera l’affaire.
Pince dentelée de microdissection	ROBOZ	RS-5137 Ceux-ci	sont incurvés à un angle de 90º ;. Des pinces droites peuvent être utilisées si vous préférez.
Pince à micro dissection légèrement incurvée	ROBOZ	RS-5136	Ce modèle est particulièrement utile pour maintenir l’oviducte.
Ciseaux	ROBOZ	RS-5880	N’importe quel petit ciseau droit en acier de qualité chirurgicale ordinaire fera l’affaire.
Aiguilles de 27 g	Beckton-Dickinson	305136	Des aiguilles plus petites (30 g) peuvent également être utilisées. 25 g peut être un peu trop grosse.
Applicateur de clips	MiKRon	42763
mm Clips	MiKRon	427631
Extracteur de clips	MiKRon	7637	Deux paires de pinces à dents (ROBOZ RS-8160) peuvent être utilisées à la place.
Porte-aiguille de suture	ROBOZ	RS-7820
	Sourcier Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Peut être remplacé par une aiguille étroite et incurvée pour toute suture résorbable de 4-0 à 6-0.
Pipettes en verre	VWR	100 ul calibrées 53432-921	Il comprend un système d’aspirateur buccal qui ne nécessite de fixer qu’un 0,22 µ ; m filtre dans le tube pour être prêt à l’emploi. Vous trouverez plus d’informations sur Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Brûleur à gaz, peut être chargé avec Kigas (CH-4512, du même fournisseur). Des brûleurs à alcool peuvent également être utilisés, mais le gaz fournit une température plus élevée et ce brûleur fournit une flamme petite et précise.
Stéréomicroscope	Leica	MZFLIII	Il s’agit d’un stéréomicroscope coûteux à fluorescence, qui peut également être utilisé à d’autres fins. Il existe des options moins chères telles que le Leica MZ8 ou le Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, pour n’en nommer que quelques-unes. Il est préférable d’utiliser deux stéréomicroscopes, l’un pour manipuler les embryons (qui n’a pas besoin d’être très beau) et l’autre pour le receveur. Celui utilisé pour le receveur doit afficher une longue distance entre la plaque de platine et la lentille de l’objectif, afin de pouvoir se concentrer à 3-4 cm au-dessus de la plaque de platine (où l’oviducte sera placé) et de laisser encore un peu de place au chirurgien ; La plupart des stéréomicroscopes peuvent le faire, mais certains ne le peuvent pas.
Fibre optique ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	Pour éclairer la zone chirurgicale. Il existe différents systèmes disponibles.
Étapes chaudes	Portée américaine	http://store.amscope.com/tcs-100.html	Ceux-ci peuvent être placés sur la plaque de platine du stéréomicroscope. Certaines modifications (insertion d’un bâton pour niveler la platine) peuvent être nécessaires si elle est trop courte pour le stéréomicroscope. Une grande scène chaude peut être utilisée pour réchauffer la cage si elle est disponible. Sinon, un coussin chauffant ordinaire peut être utilisé, mais la température doit être vérifiée.
Des boîtes de culture pour la manipulation d’embryons	Falcon	353001	351008 peuvent également être utilisées ; elles ont fait des gouttes plus étroites.

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