Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

Sommario

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Abstract

Il trasferimento di embrioni preimpianto ad una femmina surrogata è un passo necessario per la produzione di topi geneticamente modificati o per studiare gli effetti delle alterazioni epigenetiche originati durante lo sviluppo preimpianto sul successivo sviluppo ed adulto salute del feto. L'uso di una tecnica di trasferimento di embrioni efficace e coerente è fondamentale per migliorare la generazione di animali geneticamente modificati e per determinare l'effetto di trattamenti diversi su tassi di impianto e sopravvivenza a termine. Embrioni allo stadio di blastocisti vengono generalmente trasmesse mediante trasferimento uterino, eseguendo una puntura nella parete uterina introdurre la pipetta manipolazione embrione. L'orifizio eseguita in utero non viene chiuso dopo la pipetta è stata ritirata, e gli embrioni possono deflusso alla cavità addominale causa della pressione positiva dell'utero. La puntura può anche produrre una emorragia che altera l'impianto, blocca la pipetta di trasferimento e può influenzare embrione dviluppo, soprattutto quando gli embrioni che non vengono trasferiti zona. Di conseguenza, questa tecnica spesso si traduce in tassi di sopravvivenza partire embrione molto variabili e globali. Evitare questi effetti negativi, utero-tubarica trasferimento di embrioni approfittare della giunzione utero-tubarica come una barriera naturale che impedisce all'embrione di deflusso ed evitare la puntura della parete uterina. Maschi vasectomized sono necessari per ottenere i destinatari pseudopregnant. Una tecnica per eseguire vasectomia è descritto come un complemento al trasferimento di embrioni in utero-tubarica.

Introduzione

Il trasferimento embrionale è probabilmente la procedura chirurgica più frequente eseguita nel modello murino. Questa tecnica è essenziale per ottenere discendenza di embrioni sottoposti a tecniche di manipolazione in vitro e, di conseguenza, costituisce un passo necessario per lo sviluppo di modelli geneticamente modificati mediante iniezione pronucleo, trasduzione lentivirale, o formazione di chimera. Inoltre, la tecnica consente di studiare gli effetti dello sviluppo di diverse insulti che si verificano durante lo sviluppo preimpianto. L'uso di tecniche di riproduzione artificiale ¹ o l'esposizione a concentrazioni anomale di sostanze o....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Beltsville Area cura degli animali ed uso Comitati (BAACUC 11-015) secondo USDA cura degli animali e uso orientamenti.

1. Anestesia e Analgesia (comune per entrambe le procedure chirurgiche)

1. Pesare il mouse e caricare i seguenti anestetici e analgesici in due siringhe da 1 ml con 27 aghi G:
   1. Ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g di una soluzione 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0.005 ml / g di una soluzione di 2 mg / ml).
   2. Buprenorfina (0,1 mcg / g: 0,01 ml di una soluzione 0,01 mg / ml).
2. Immobiliz....

Risultati

Utero-tubarica trasferimento di embrioni fornisce un mezzo per trasferire gli embrioni in utero evitare alcune delle complicanze associate uterina trasferimento degli embrioni ^2,9,10. Nella Tabella 1 mostriamo qualche risultato rappresentativo abbiamo ottenuto il trasferimento di blastocisti CD1 sottoposti a diversi tipi di manipolazioni ai destinatari CD1 seguendo il protocollo descritto. La sopravvivenza a termine (% di embrioni risultanti in un cucciolo) o sopravvivenza a E15 (nel caso di .......

Discussione

La vasectomia è una tecnica chirurgica in avanti relativamente semplice che non comporta grandi difficoltà. Quando sanificazione con povidone iodio ed etanolo assicurarsi che l'ultimo lavaggio (con etanolo) rimuove povidone iodio, in quanto può irritare il peritoneo. L'accesso al dotto deferente può essere ottenuta anche scroto o eseguendo una incisione trasversale nell'addome ^8. Incisione scrotale è stato raccomandato di trasversali incisione addominale dovuto alla incisione relativament.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketamina	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Buprenorfina	Generico	NDC 400-42-010-01	Da ordinare da un veterinario autorizzato.
Unguento per gli occhi	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Aggiunto all'acqua potabile (0,3 mg/ml di amoxicillina triidrato e 0,075 mg/ml di clavulanato di potassio). Aggiungere 1,5 ml del flacone ricostituito da 15 ml a 250 ml di acqua.
Pinza seghettata per medicazione	ROBOZ	RS-8120	Qualsiasi pinza diritta in acciaio chirurgico di medie dimensioni funzionerà.
Pinze seghettate per microdissezione	ROBOZ	RS-5137	Queste sono curve con un angolo di 90º. Se si preferisce, è possibile utilizzare una pinza dritta.
Pinza per microdissezione leggermente curva	ROBOZ	RS-5136	Questo modello è particolarmente utile per trattenere l'ovidotto.
Forbici	ROBOZ	RS-5880	Funzioneranno tutte le normali forbici dritte piccole in acciaio chirurgico.
Ferri da 27 g	Beckton-Dickinson	305136	Si possono usare anche ferri più piccoli (30 g). 25 g potrebbero essere un po' troppo grandi.
Applicatore di clip	MiKRon	42763
Clip da 9 mm	MiKRon	427631
Dispositivo di rimozione delle clip	MiKRon	7637	In alternativa è possibile utilizzare due paia di pinze per denti (ROBOZ RS-8160).
Porta ago da sutura	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Può essere sostituito da qualsiasi sutura assorbibile da 4-0 a 6-0 con un ago curvo stretto.
Capillari in vetro	VWR	100 ul pipette calibrate 53432-921	Include un sistema di aspirazione della bocca che richiede solo il collegamento di un 0,22 µ m filtro nel tubo per essere pronto all'uso. Maggiori informazioni sono disponibili in Nagy et al.8
Bruciatore	KISAG AG	Typ 2002	Bruciatore a gas, può essere caricato con Kigas (CH-4512, dello stesso venditore). Possono essere utilizzati anche bruciatori ad alcool, ma il gas fornisce una temperatura più elevata e questo bruciatore fornisce una fiamma piccola e precisa.
Stereomicroscopio	Leica	MZFLIII	Si tratta di un costoso stereomicroscopio a fluorescenza, che può essere utilizzato anche per altri scopi. Ci sono opzioni più economiche come Leica MZ8 o Nikon SMZ-10 o SMZ-2B, solo per citarne alcune. È meglio usare due stereomicroscopi, uno per maneggiare gli embrioni (che non deve essere necessariamente molto bello) e un altro per la ricevente. Quello utilizzato per il ricevente dovrebbe mostrare una lunga distanza dalla piastra del tavolino alla lente dell'obiettivo, in modo da poter mettere a fuoco 3-4 cm sopra la piastra del tavolino (dove verrà posizionato l'ovidotto) e lasciare comunque un po' di spazio per il chirurgo; La maggior parte degli stereomicroscopi può farlo, ma alcuni non possono.
Illuminazione in fibra ottica	Dolan Jenner	Fiber lite	Per illuminare l'area chirurgica. Sono disponibili diversi sistemi.
Warm stages	americano scope	http://store.amscope.com/tcs-100.htmlQuesti	possono essere posizionati sopra la piastra del tavolino dello stereomicroscopio. Potrebbero essere necessarie alcune modifiche (inserimento di un bastoncino per livellare il tavolino) se è troppo corto per lo stereomicroscopio. Un grande palco caldo può essere utilizzato per riscaldare la gabbia, se disponibile. In caso contrario, è possibile utilizzare un normale termoforo, ma è necessario controllare la temperatura.
piatti di coltura per la manipolazione degli embrioni	Falcon	353001	351008; hanno fatto gocce più strette.

Possono essere utilizzati anche