דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב ג elegans

Summary

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

Abstract

פרוטוקולים לאנוקסיה / רעב בסי אלגנס אורגניזם מודל הגנטי לדמות איסכמיה / reperfusion. תולעים מופרדים מחיידקים שבמזון והניחו מתחת לאנוקסיה 20 שעה (איסכמיה מדומה), ולאחר מכן עברו לאווירה נורמלית עם אוכל (reperfusion המדומה). תוצאות פרדיגמה ניסוייות זה במותו גדל ונזק עצבי, וטכניקות מוצגות להעריך כדאיות האורגניזם, שינויים במורפולוגיה של תהליכי מגע של תאי עצב, כמו גם מגע רגיש, המייצג את הפלט ההתנהגותי של תפקוד עצבי. לבסוף, שיטה לבניית חממות חוסר חמצן באמצעות מיכלי אחסון מטבח המשותף מתוארת. התוספת של יחידת בקרת זרימה המונית מאפשרת לשינויים שנעשו בתערובת הגז בחממות המותאמת אישית, ואמבט מים במחזור מאפשר לשניהם בקרת הטמפרטורה ועושה את זה קל לזהות דליפות. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה בעלות נמוכה לאופן מסחרייחידות זמינות.

Introduction

סי אלגנס הוא נמטודות שאומצה באופן נרחב כאורגניזם מודל אוקריוטים תאיים מאז השקתו ב ^-1 ברנר. זהו מודל זול, פשוט, ותכליתי, המאפשר קישורים קלים בין שינויים ופנוטיפי הגנטיים משנים ^2.

איסכמיה מאופיינת בחוסר של חומרים מזינים ואספקת חמצן לרקמות, ואחריו reperfusion, כאשר פרץ של מיני חמצן תגובתי מיוצר ³ ורוב הנזק מתרחש. ב2002, מודל של איסכמיה / reperfusion (IR) בג elegans פותח ⁴ מעורב הגשה כל התולעת לאנוקסיה, מחסור באבות מזון ועומס חום למשך כ 20 שעה אחרי 24 שעות בתנאים רגילים. למרות שמודל זה הוא מבחינה טכנית אנוקסיה רעבה (AS) מצב, מוות של תאים מתרחש באמצעות מנגנונים הנשמרים ביונקים, לרבות נזק שנגרם על ידי חמצון במהלך reperfusion ^{5. יתר על כן, בדומה לIR יונקים, נזקים הנגרמים על ידי AS ב C. elegans ניתן למנוע על ידי נפשית מראש איסכמי 6,7 או 8,9 נפשית מראש חומר הרדמה.}

הפרוטוקולים שלהלן מדגימים כיצד לחקות IR בג elegans באמצעות מודל AS, איך להבקיע מומים מורפולוגיים והתנהגותיים הנובעים מAS, ואיך להתאים את הפרוטוקול באופן שמאפשר לניסוי שיבוצע בהשקעה ראשונית נמוכה באמצעות חלופה קאמרית בקלות-נבנה בהזמנה אישית .

Protocol

1. ג elegans צמיחה

1. הכן את צלחות 35 מ"מ צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר זרע עם OP50 חיידקים, כמו לכל שיטות טיפוח סטנדרטיות ^1.
2. לסנכרן סי אלגנס ידי הצבת 6 מבוגרים הרה להולדת על צלחת NGM seeded. הסר את המבוגרים לאחר ~ 100 ביצים כבר הונחו (~ שעה 3).
3. דגירה הצלחות במשך 3 ימים ב20 מעלות צלזיוס, ובשלב התולעים פיתחו לשלב בוגר צעיר והם אופטימליים לניסוי זה. פרוטוקולים אלטרנטיביים לסינכרון ג elegans מתוארים במקומות אחרים ^10.

2. חומרים לAS

1. חיץ M9 (22 מ"מ KH ₂ PO _4, 42 מ"מ Na ₂ HPO _4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ צריך להיות מטוהר של חמצן על ידי equilibrating עם N ₂ (יכול לשמש גם ארגון) במהלך 30 דקות לפני הניסוי וכל זמן מוקף בקרח.
2. לעשות חור קטן (3 מ"מרחב) במכסה של 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות שבתולעים יוצבו במהלך AS. החור מאפשר חילוף גזים ללא שמירה על המכסה פתוח, כמו זה יכול להוביל לאידוי תקשורת מוגזם.

3. אנוקסיה / רעב

1. לנהל את כל הניסויים לפחות בשלושה עותקים.
2. הוסף 1 מיליליטר של RT, חיץ M9 מחומצן לכל צלחת 35 מ"מ המכילה תולעים בוגרות צעירות גדלו כפי שתואר לעיל. להיות זהיר, כדי למנוע הסרת חיידקים מהצלחת (להוסיף M9 לקצוות שבו חיידקים לא זורעים). לאחר ~ 1 דקות התולעים צריכים להיות שוחים בM9.
3. מעיל קצה פיפטה 1 מיליליטר עם ארגון ה-BSA על ידי pipetting וגירוש פתרון BSA 1% סטרילי.
4. להטות את הצלחת המכילה את התולעים בחיץ M9 בזהירות, להסיר M9 מאותו המקום שבו הוא הוסיף, ולמקם את ההשעיה בmicrocentrifuge הצינורות שהוכנו מראש. תן לנוח בקרח עד התולעים ירדו לחלק התחתון של הצינורות (~ 1-2 דקות).
5. הסר את הסכום המקסימאלי של M9 האפשרי מבלי להפריע לתולעים מהצינור (שעזב סביב 100 μl), להוסיף 1 מיליליטר של M9 וקר-מטוהר החמצן ובמקום צינור על קרח עד התולעים ליישב לתחתית שוב. חזור על 3x השלב האחרון. בכביסה האחרונה, להסיר M9 עד ~ 100 μl נשאר בצינור.
6. מניחים את הצינורות עם התולעים בM9 deoxygenated בתוך תא חוסר חמצן / anoxic (ראה הוראות שלהלן, סעיף 3.6.1), או לחלופין, למכל אטום מותאם אישית (ראו הוראות שלהלן, סעיף 3.6.2).
   1. אם קאמרי anoxic / חוסר חמצן מסחרי הוא לשמש, להשאיר כמה M9 מטוהר בתוך החדר לפני שמתחיל שלב 3.5 וחזור על שלב 3.5 פעם התולעים בתוך החדר.
   2. אם קאמרי מותאם אישית הוא לשמש, תיאור מפורט של איך ליצור מנגנון עלות נמוכה מוצג בסוף הפרוטוקול זה ותואר על ידי קבוצה אחרת בעבר ^11. בקצרה:
      1. לעשות שני חורים במכסת 250 מיכל מיליליטר טאפרוור מהסוג ולהוסיף מחברים צינור אליהם. אחד ישמש להזריק את תערובת הגז ואילו השני יהיה יציאת הגז לתוך אמבט מים.
      2. הנח את התולעים אל תוך החדר ולאטום את החדר באמצעות המכסה.
      3. גז עם N ₂ זרימה מתמדת (100 מיליליטר / דקה).
      4. מניחים את המכל בתוך אמבט מים ב26 ° C. ודא שצינור היציאה הוא שקוע היטב במים ולכן אין החזרי אוויר ושאין דליפות במערכת (לכאורה על ידי בועות הנובעות מהחדר עצמו).
7. דגירה התולעים ב26 מעלות צלזיוס למשך 20 שעה.

4. Reperfusion המדומה

1. אחרי 20 שעות בתנאי AS, הסר את הצינורות מתא הדגירה לאוויר חדר.
2. פיפטה ג elegans עם טיפ מצופה-BSA (כמו בשלב 3.3) על גבי OP50 זורעים 35 מ"מ צלחת NGM. דגירה הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.אחרי זה, התולעים יהיו מוכנים להיות קלע.

5. זיהוי המלח נגד תולעים בשידור חי

1. באמצעות איסוף פלטינה, בקלילות לגעת בחלק העליון של הראש של התולעת. תולעים חיים יעברו לאחור לאחר שנגע. אם התולעים nonresponsive, להבקיע מת. לעתים, תולעת לא תזוז אחורה, אך עשוי להפגין תנועת ראש מצד לצד קל. אמנם לא מבחינה טכנית מת, התולעים האלה הם כמעט בטוחים לפוג תוך מספר שעות, וצריכים להיות הבקיע כמת. אם מחכה יותר מדי זמן כדי לצבור התולעים, בקיעה פנימית של צאצאים יכולה להתרחש ו" שקיות של תולעים "אלה יכולים להיקרע, מה שהופך את איתור הפגרים קשים מאוד.
2. הסר את שני תולעי החיים ומתים מהצלחת כפי שהם נספרים להימנע מספירה כפולה. ניתן להעביר את התולעים חיים לצלחת נפרדת כדי לבצע מבחני התנהגותיים. כמות תולעי חיים ביחס לסך הכל מיוצגת כ% מתולעים ששרדו (איור 1 א ).

6. לגעת Assay תגובה

1. תיאור מפורט של פרוטוקול זה הוצג בהארט, אן ג, ed. התנהגות (3 יולי 2006), WormBook, ed. ג elegans מחקר הקהילה, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
   1. להבקיע למגע תגובה, לזהות תולעים שנעים וקל לגעת בצד של הראש של התולעת (בסמוך לחלק האמצעי של הלוע) עם בחירת עפעף (איור 3).
   2. אם התולעת נעה אחורה, ציון מגיב כמו, אם לא, ציון nonresponsive כ( איור 1). חזור על שלב 10-15x זה עבור כל תולעת עם 10 מרווחי שניות. לחקור לפחות 10 תולעים בכל קבוצה יש את הנתונים מדויקים. אותו assay יכול לשמש כדי להעריך קדימה שינויי locomotory הבאים במגע קל לקיר הגוף האחורי. הקפד שלא לגעת בראש או זנב של התולעת, שכן זה מעורר התנהגות מובחנת.
   3. לבסוף, בשנתזנים של חברה בקרה גנטית [N2 בריסטול wild-type לMEC מוטציה חיובית, (mechanosensory) לשלילי - למשל CB1338 MEC-3 (e1338) IV] לכייל את הכוח שעם לגעת בתולעים. מדי קשה של גירוי יהיה לעורר תגובה התנהגותית במוטנטים MEC, מעט מדי לא לעורר השפעה בבקרת N2 wildtype.

7. עצבי שינויים

1. כדי להמחיש פוסט כשינויים עצביים, השתמש מתח המבטא GFP בתאי עצב MEC להגיב בנגיעה ^4,5. יש נוירונים אלה תהליכים ארוכים שרצים לאורך קיר הגוף ובקיע מומים מורפולוגיים. בנוסף, המידע המורפולוגיים יכול להיות משולב עם מדדי התנהגותיים של תפקוד עצבי, כפי שתואר לעיל. זן אחד שיכול לשמש למטרה זו הוא TU2583, אשר זמין מג מרכז לגנטיקת elegans ומכיל transgene המשולב uIs25 להביע GFP לכאן ולכאןמ 'אמרגן MEC-18, או לחלופין TU2562, המכיל MEC-3 :: GFP היתוך משולב.
2. הכן את כרית agarose.
   1. ממסים 2% agarose במים, מביא ל1x M9 עם מלאי 10x, ולתחזק את הפתרון ב70 ° C.
   2. מניחים ירידה (~ 20 μl) של פתרון זה בשקופית זכוכית (25 מ"מ x 75 מ"מ) שהושמה בין שתי שקופיות אחרות, כל אחד מהם יש חתיכת קלטת אחת בצד התחתון שלהם.
   3. הנח שקופיות זכוכית סופיות בניצב הראשון על גבי פתרון agarose 2%, ולתת לו להתקרר ב RT. זה אמור ליצור משטח שהוא בעובי של הקלטת.
   4. הסר את השקופית העליונה ולהוסיף 10 μl של M9 המכיל tetramisole 0.1%, אשר יהיה לשתק את התולעים.
3. להעביר חלק (~ 10) לחיות תולעים על 2% שקופיות agarose. מניחים coverslip עליהם ולדמיין את ה-GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרת 100X עם התאורה המתאימה.
4. פגוםנוירונים יציגו מחרוזת cytosolic קרום של דפוס פנינים בתהליכים, המורכבת מ"פונקטום המרובים (איור 2 א), ו / או מומים שבו התהליכים מופיעים להיות שבורים (איור 2). רוזן "פונקטום וליקויים בשני נוירונים לכל תולעת, תוך שימוש בסך של לפחות 10 תולעים.

8. תוצרת מעבדת Hypoxic קאמרי

1. סגנון טאפרוור, מיכל סגר, אטום ניתן retrofit כתא anoxic. תשמור על עצמך כדי לבחור מיכל שהוא קטן כמו אפשרי. מיכל קטן יוצר סביבת חוסר חמצן מהיר יותר וקל יותר להשתלב באמבט המים (איור 4).
2. לעשות שני חורים על המכסה (ניתן לעשות זאת עם מברג או על ידי חימום מלקחיים ומאלצים לתוך המכסה) והכנס את מחבר פלסטיק או מתכת שמתאים לצינורות (איור 5 א). השתמש בדבק שיכול להיות ממוקם מתחת למים, וגם מקבל קשה לאחר ייבוש, הימנעות תנועה שלהמחבר ולכן צמצום האפשרות של זליגה (איור 5).
3. המכל צריך להיות ממוקם בתוך אמבט המים, כך שהוא שקוע לחלוטין (איור 4). לטבול את המכל, השתמש במשקל בקבוק או במשקל צלילה.
4. אחד מחיבורי הצינור ישמש להציג את תערובת גז והצינור האחר יפעל כהקלה בלחץ, ולכן הוא צריך להישאר מתחת למים, כך שהמכל מסוגרת מהסביבה החיצונית (איור 4).
5. הרכב האוויר יכול להיות מווסת על ידי שימוש בגז בהתאמה אישית, בקרי זרימה המוניים או כל מנגנון שמערבב את הגזים הרצויים. זרימת הגז צריכה להיות מבוקרת, כמו זרימה גבוהה יכולה ליצור אידוי מוגזם. לדוגמא, במכל מיליליטר 250, 100 מיליליטר / דקה של גז תספק מרחב טוב לתולעים ושטף מתאים.
6. אורכו של הצינור צריך להישמר עד למינימום, כפי שהם יכולים להיות חדירים לגז,llowing הכניסה של O _2. חשוב להימנע משימוש בסיליקון, Tygon צינורות כחומרים אלה הם חדירים לחילוף גזים. אנחנו מעדיפים צינורות פוליפרופילן או ניילון. זכוכית או צינורות מתכת לשמור על הגזים טובים, אבל גם יותר קשים לעבוד איתו.

Results

הכפפת ג elegans ל20 שעות של AS ב26 מעלות צלזיוס בתא דגירה תוצרת מעבדה מותאמת אישית כפי שתואר (סעיף 3.6.2) הביא לתמותה משמעותית (איור 1 א) ^5. דימות פלואורסצנטי הבאה של "פונקטום והפסקות בתהליכים עצביים ה-GFP שכותרת של ניצולים אישרה את נוכחותו של מומים מורפולוגיים (איור 2). הניצולים גם הגיבו היטב לקיר גוף מגע קל (איור 1). מודל זה כבר בשימוש על ידי מספר קבוצות כדי ללמוד איך נטייה גנטית, התערבות תרופות, ופלסטיות מטבולית משפיעה על תוצאות AS תלויות ^{4-6,8,9,12,13.}

איור 1. ג elegans הישרדות ומגע תגובה לאחרAS.) אחוז מהתולעים כי תערוכת 24 לאחר כשעת הישרדות. זן N2 הוא הרקע הגנטי הסוג בר, וKWN85 מכיל transgene משולב שמתייג נוירונים MEC עם GFP. ב ') בתגובה למגע גירויים של החיים ג elegans (הזנים N2) לאחר AS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מומים (PLML וPLMR) לגעת שינויי נוירון לאחר AS. נוירון מגע כגון תהליכים והפסקות (א) או ההצטברות של אגרגטים GFP בתהליכים (ב ') והמפותלים היו במעקב שבנותרו בחיים בהרדמה ג eleg ans לאחר AS.

איור 3. איסוף ריס. איסוף עפעף מורכב. בהבלעה, פירוט של הריסים דבוקים לעץ הקיסם.

איור 4. קאמרי חוסר חמצן בתוך אמבט המים מתוצרת מעבדה. מיכל סגור מוכן להתחיל את הניסוי. חצים מצביעים על כניסת הגז ויציאה ומשקל הבקבוק משמש כדי למנוע ממנו צף.

231fig5.jpg "/>
איור 5. פרטים של הצד הפנימי וחיצוני של מכסה מיכל. א) בצד חיצוני של מיכסה מיכל, המציין את הצינור ומחבר שלו מחובר לצד חיצוני של מיכסה מיכל חור. שנעשה בעבר ב '), המציין את מחבר הצינור מחובר לחור שנעשה בעבר.

Discussion

כפי שכבר בשימוש נרחב בג elegans למודל פציעת IR. כמה נקודות מפתח צריכה להיות מודגשות לפרוטוקול זה: סי אלגנס הם עמיד למגוון רחב של פציעות, המצדיק את הצורך ב3 עלבונות נלווים (חום, רעב ואנוקסיה) כדי להשיג מוות באמצעות מערכת זו. אנוקסיה לבד לא הורגת את התולעים בחלון זה זמן ^14. יתר על כן, עלייה בטמפרטורה היא לחץ נוסף, ולכן חשוב לעקוב מקרוב. לאמיתו של דבר, רעב אינו תורם באופן משמעותי לתואר של תמותה שנצפתה ^7, כשלעצמה, אבל זה נראה להפחית שונות בין משכפל ניסיוני. בהתחשב בכך שלא יכול להיות שונה משמעותי מיום ליום, שזה חשוב ביותר כדי להשוות דגימות להפעיל ישירות במקביל, ולחזור על ניסויים על פני ימים רבים. באופן כללי, תוצאות נמדדות בשלוש צלחות נפרדות של 50-100 תולעים / תנאי ניסוי ואלה הםn בממוצע ונחשב כלשכפל ניסיוני אחד. באופן כללי, בין שבעה לתשעה משכפל נראה מספיק כדי להשיג או לשלול את מובהקות סטטיסטיות.

השלב ההתפתחותי של התולעים המשמשים בניסוי גם צריך להיות במעקב צמוד כמו הרגישות של שלבים שונים לניזק משתנה באופן משמעותי ^15,16. השימוש של צעירים הוא סטנדרטי, ותולעי שלב זחל (L3 וL4) נראים עמיד יותר להשפעות המזיקות של AS (נתונים שלא פורסמו).

פרוטוקול זה מציג שתי דרכים לביצוע הניסויים, אחד באמצעות מנגנון מתוצרת מעבדה (באמצעות מכולות טאפרוור מסוג וקלט גז ¹¹⁾ ואחרים באמצעות תא חוסר חמצן מסחרי ^4,6. ניתן להשיג אנוקסיה באמצעים אחרים שצורכים את החמצן, כפי שתואר במקומות אחרים ^13,17. השימוש בטכניקות חלופיות כדי ליצור סביבת חוסר חמצן יכול לשנות את הזמן כמו הדגירה דרושהכדי ליצור את הכמות הרצויה של מוות. מיקוד ~ הישרדות 20% הוא נקודת מוצא אידיאלית ללימוד התערבויות מגן, בעוד 80% הוא באופן דומה אידיאליים עבור התערבויות שתחמרנה את ההשפעות המזיקות של AS. עוד אזהרה חשובה היא הזמן שבו תולעים מתים / חיים עשרות הצופה. אם הזמן לניתוח מורחב מעבר 24 שעות, הנתונים עלולות להטעות שכן תולעים מתים הפכו קשים יותר ויותר לזהות. זה יכול להיות בגלל פגרי תולעת הופכים שקופים יחסית לאורך זמן, אלא גם לעובדה שעוברים מופרים יכולים להתפתח לצאצאים לאחר המוות הפנימי של הפגרים ולשבש אותם כפי שהן עולות.

הניתוח של מורפולוגיה עצבית יכול להיות שונה כדי לבחון את דפוסי ביטוי חלבון ^18, פיצול גרעיני ⁴ ופרמטרים נוספים ¹⁹ ידי החלפת זן תולעת המבטא את סמן מקודד גנטי המתאים. אזהרה סופית אחת היא שההדמיה שלצריכים לעשות תהליכים עצביים פחות מ 30 דקות לאחר הצבת התולעים בשקופית. בעלי חיים נשמרים תחת הרדמה בשקופיות לתקופות ארוכות יותר יכולות להציג נזק כעצמאי. התאם את כמות בעלי חיים לכל שקופית על פי הזמן הדרוש כדי לעקוב ולנתח אותם.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  זן	CGC		זן מסוג Wild. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	טרנסגן פלואורסצנטי משולב המשמש לתיוג נוירוני מגע. http://www.cbs.umn.edu/CGC/< לאדם>
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	מוטציה קנונית mec-3 שאינה רגישה למגע. http://www.cbs.umn.edu/CGC/< לאדם>
צינור מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	0030 120.086
ניקון Eclipse TE2000-U מיקרוסקופ	Nikon USA	TE2000-U
חממה בטמפרטורה נמוכה	שלדון ייצור בע"מ	דגם 2005
קיסם			ניתן להכין קיסם ריסים על ידי הצמדת ריס לקיסם עץ, ולאחר מכן הצמדת הקיסם לפיפטה מזכוכית של פסטר (<חזק>איור 3).
תא היפוקסי	Coy	8307030	תא כפפות היפוקסי מצויד בזרז פלדיום ובקר CO2.