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Medicine

颈脊髓损伤的小鼠模型研究后皮损呼吸神经可塑性

Published: May 28, 2014 doi: 10.3791/51235

Summary

呼吸衰竭是死亡的跟随颈脊髓损伤的首要原因。有呼吸衰竭引起的局部损伤宫颈可重复的,可量化的,可靠的临床前动物模型将有助于了解后续的呼吸和非呼吸神经可塑性,并允许测试假定的维修策略。

Abstract

颈椎脊髓损伤引起永久性瘫痪,并经常导致呼吸窘迫。迄今为止,还没有有效的治疗方法已发展到提高/改善呼吸衰竭以下高位颈脊髓损伤(SCI)。这里我们提出了很高的SCI在宫颈2(C2),同分异构的水平来研究不同的后皮损呼吸神经可塑性小鼠的临床前模型。该技术包括在C2级的外科局部损伤,这将导致隔膜的偏瘫,由于从位于脑干呼吸中枢膈运动神经元的传入神经阻滞。受伤的对侧保持不变,并允许动物恢复。不像影响运动功能(在胸椎和腰椎水平)等的SCI,呼吸功能并不需要动物的动机和赤字/恢复的量化可以容易地进行(隔膜和膈神经记录秒,全身通风)。此临床前C2脊髓损伤模型是一种功能强大,实用,可靠的临床前模型来研究各种呼吸道和非呼吸道神经可塑性的事件在不同层次(分子生理学),并测试不同的推定治疗策略,可以改善呼吸脊髓损伤患者。

Introduction

脊髓损伤是在人群中观察到的与戏剧性的发生率,如永久性瘫痪一个常见的​​损​​伤。然而,损伤的严重程度取决于初始损伤的水平和程度。呼吸衰竭是病死率以下上颈段脊髓损伤(SCI)1的首要原因。目前,唯一的治疗治疗是将病人下辅助通气。由于少数患者可以断奶了辅助通气2,由于其发生后皮损延迟自然恢复,需要开发新的创新型非侵入性的治疗是当务之急3。拥有一个良好的标准化的临床前模型来观察颈椎脊髓损伤对呼吸功能不全的影响,因此,研究的推定治疗策略的应用,是必不可少的。

在本技术文章中,我们描述了一个特定的临床前小鼠模型Ø在C2级别F呼吸障碍引起的局部颈脊髓损伤。这种模式是目前使用世界各地的一些实验室(综述:4-13)。然而,在手术过程中的细微差别可以在不同的调查中可以观察到产生这个特殊的宫颈损伤小鼠模型。一个C2脊髓损伤对呼吸输出的影响最早是在1895年14波特描述。颈椎半切引起膈运动神经元的传入神经 ​​阻滞从他们的中央驱动(位于rVRG在脑干, 图1A)上受伤的同侧,导致无声膈神经活动和随后的膈肌麻痹。对侧保持不变,并允许动物生存。不同于位于一个较低的脊柱节段(例如,在C 4级15挫伤性损伤)不同SCI,在两侧膈运动神经元核的完整性被保存下来。一个CERV后iCal的C2伤害,一些自发的活动可以在同侧(膈和隔膜)可以观察到由于它越过脊柱中线在段水平C3-C6(交叉膈途径,CPP, 图1B)对侧沉默突触通路的激活。菲,这是激活,根据定义,一个C2半切结合对侧phrenicotomy从而诱发同侧局部膈神经恢复,可发生从几小时到几周损伤后16-18。这个CPP途径对呼吸复苏的真正有益作用是有限的19,并进一步调查处理应当制定提高自发恢复3的大小。

该协议提供了一个强大的类型的临床前小鼠模型来研究呼吸后皮损可塑性各级(从学前教育和膈运动神经元,的interneurons,分子和cellula呼吸生理r,则前肢为例)的运动,以及一个模型来测试旨在改善以下C2分型颈脊髓损伤的呼吸和运动恢复侵入性和非侵入性的治疗策略。

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Protocol

该方案通过卓越(Paris Sud酒店,编号246556赠款协议大学)和大学德凡尔赛圣昆廷 - 烯伊夫林省的RBUCE-UP椅子的伦理委员会。

无菌手术器械1。准备

  1. 请用实验室的洗涤剂手术器械。
  2. 高压灭菌前手术器械。
  3. 在外科会话,通过将提示在热珠灭菌10分钟,在180℃下2次手术之间消毒的工具。

2,准备药物

  1. 准备2×1毫升注射器预麻醉药物的鸡尾酒及术后药物。
  2. 根据大鼠的重量,制备的预麻醉药物的注射器:卡洛芬(5毫克/千克),丁丙诺啡(50微克/千克),拜有利(5毫克/千克)和美托咪啶(0.5毫克/千克)。完成音量,以1毫升乳酸林格液。
  3. 在准备另一种注射器拨回,麻醉前用药:阿替美唑(500微克/公斤)。

鼠年3。麻醉

  1. 管理皮下注射到动物的在步骤2.2中所述的预麻醉药物溶液。然后,将动物放回笼子里,等到镇静效果出现。
  2. 将大鼠成一个封闭的腔充满了5%异氟醚在100%O 2,并等到呼吸节律减慢(大约30秒)。然后,从腔室取出大鼠,并将其放置到插管表。

4,经口气管插管

  1. 趴在他的背上的动物,然后通过将连接到他的门牙表表带固定头部。
  2. 用光纤灯,照亮了整个胸腔的空间。然后,放置喉镜(或做了一个自定义的,柔等人 20节)在动物的嘴。可视化的声带。
  3. 下滑e和放置一个导气管进气管(声带之间)。滑动经口气管(为16G导管的大小)上的导向。
  4. 除去导向,并检查与喉癌镜放置在气管管子的端部的水分的存在,证实了该管的气管中,而不是在食道的适当位置。
  5. 该管连接至一个啮齿动物呼吸机(683啮齿动物呼吸机,哈佛仪器)和调整异氟烷至2%的浓度(在100%O 2)。
  6. 固定经口气管外科胶带。

5,脊柱外科

  1. 将动物在手术加热板腹卧位,用鼻子指着90°角的外科医生。围绕保持37.5°C体温整个手术。
  2. 剃了头发与肩胛骨之间的快船,取下头发用纱布。
  3. 请用优碘皮肤,然后用70%的酒精。重复此步骤3次。
  4. 脚趾捏在手术开始前进行,以确保适当的麻醉深度。  然后,在肩胛骨之间剪刀进行横向切开皮肤rostro-尾端。
  5. 通过下面的肌腱,以防止任何出血切开acromiotrapezius肌肉rostro-尾端。然后将分离菱形肌访问spinalis肌肉(围绕脊椎)。
  6. 从C1收回spinalis肌肉到C3椎体。在C2椎体是一个具有突出的隆起。
  7. 通过用无菌棉签清洁围绕脊椎的背侧部分的肌肉。
  8. 开始小心地取出C2的隆起带咬骨钳。然后,继续认真直到脊髓背侧暴露。确保椎板切除术是一种背半椎板切除术。请特别注意包围脊髓,并在此区域附近动脉硬脑膜。
  9. 用#55镊子,解剖ROSTRO-尾端沿C2硬脑膜,接下来继续横向上的每个头端和尾端的一面。
  10. 海绵立脑脊液。
  11. 根据该颈脊神经后根号2与microscissors一个横截面。验证用微解剖刀,该病变的程度是足够接近到达脊髓(参见图2A为受伤的背视图)的中线。如果没有,那么另外一个切口可以作出来完成的伤害。如有出血,用消毒棉签。要小心,不要去对侧,否则动物将无法从伤病中恢复,将有一个呼吸衰竭。
  12. 缝合肌肉作为保护层和背面缝合皮肤。请用优碘饱和的无菌纱布伤口。
  13. 关闭异氟醚蒸发器,并注入了逆转​​药(阿替美唑[500微克/公斤,即时通讯]),检查体温。
  14. 当动物开始呼吸对呼吸机,从呼吸机上拔下气管套管,然后取出经口气管。将动物在加热笼进行恢复。

6,手术后护理

手术后,动物被持续监控,以确保可能恢复的最佳环境。抗生素(拜有利,5毫克/千克),消炎(卡洛芬,5毫克/千克)和丁丙诺啡(50微克/公斤)的药物给予,每12小时进行第2天手术后,以防止感染,减少发生手术后的疼痛。大鼠获得自由采食,以软的食物和水(或胶化水为第一手术后一天)。皮下液体可以用来防止脱水的前几个术后天。体重和食物摄入量是每天监测。他们的环境是丰富整个​​实验过程和时间伤后(双壳,管道在他们的笼子)。

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Representative Results

损伤的程度

成功与这个特殊的实验模型的可重复性依赖于每个机械手/外科医师的经验。呼吸恢复(膈神经活动和膈肌活动)的继C2损伤的后续量相关,其余幸免腹外侧白质21。由于损伤是“手工”和需要一些实践从外科医生,每个损伤的程度要由组织学技术(组织用多聚甲醛4%,冰冻组织切片,甲酚紫染色的固定)进行检查,以确定准确的尺寸的受损组织( 图2B)。

录音电

继C2脊髓损伤,同侧膈神经活动被取消( 图3A,看到摄影指导Vinit 17对于方法)。对侧膈神经的活动不会受损伤,并允许动物存活( 图3B)。后7天伤,轻微的活动可以记录一些动物的同侧,主要是因为它从对侧( 图3A3B)越过中线的CPP。类似的结果可以在膜片上的活性( 图3C3D)可以观察到,与在第7天同侧( 图3C)损伤后有轻微活性。这一活动是加强了时间伤后,可以在所有的动物中观察到数个月后(未示出)。

图1
图1的大鼠的呼吸解剖示意图。主吸气组织,膈前运动神经元位于rVRG(脑干)和位于膈神经核(C3到C6)膈运动神经元,其中投射它们的轴突到膜片的)横向视图B)示意图背鉴于对呼吸道下降的一个途径C2局部损伤的效果。请注意,从对侧交叉膈路径的越过中线在膈神经核水平段的存在。 点击这里查看大图。

图2
图2。图片在大鼠C2分伤害。手术部位的)背画面。箭头示出了注入电流的部位URY。请注意没有C2椎体(背部分)C2受伤的脊髓(左照片)的横截面的程度(右图,范围为灰色)的B)重建的。比例尺:1,000微米点击这里查看大图。

图3
图3:对呼吸系统输出C2损伤生理效应。 A)C2分伤废除同侧膈神经活动。注意同侧膈神经活动因交叉膈路径(CPP),B)C 2伤不会立即影响到对侧膈神经活性部分恢复7天伤后而7天后的伤害。 三)C2分伤害废除同侧膈肌活动。轻微活动时会出现后第7天损伤,主要是由于CPP活动。同侧观察到的信号有节奏的偏转是由于心电图,D的伪迹录音)继C2损伤,对侧膈肌活动仍然一样受伤之前,并允许动物的生存。 点击这里查看大图。

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Discussion

使得C2损伤模型的技术难点

该C2损伤小鼠模型是研究呼吸后皮损神经可塑性一个有趣的工具。然而,需要产生一个可重复的和可靠的模型的步骤多,而​​且每一个可能的研究的结果产生影响。例如,在插管过程中,非常小心的是要采取自气管管可产生气管的炎症,其可以导致多种并发症,如阻塞性呼吸衰竭,除了最初的呼吸功能不全,由于损伤本身。此外,在手术过程中进入脊髓可作为动物的恢复的关键。所有的步骤(肌肉解剖/退刀,背椎板切除术,durotomy,伤害本身)都非常谨慎,由于不同的动脉周围的手术部位,并进入脊髓在场的情况下进行线。广泛出血,必须避免由于手术后的恢复可能由失血受到阻碍,和脊髓缺血的发生原因,除了损伤。

需要注意的另一个重要部分是仪器的清洁和地点进行了手术室内。尽管抗生素药物被注射到动物和极端关心手术过程中所使用的“伪无菌”的条件下,可能发生细菌感染和影响整个研究计划要在这个模型执行。例如,全身性炎症引起的内毒素注射将取消呼吸神经可塑性22,并可能影响和/或隐藏其后的自发神经可塑性或推定恢复策略的影响。体温在整个过程中的监测也可以参加,以使这一实验模型的成功。的确,低温可以作为europrotectant急性脊髓损伤并能诱导一些有利的影响(见Ahmad 23审查)。

颈椎2节小鼠模型中的障碍(运动)一词急剧模型。这是常见的观察减重后一周,由于这样的事实,所述动物是偏瘫和经历了一些困难,达到食物和水的伤害。适当的帮助是由后手术操作者进行,以确保重量损失为初始重量(手动馈送)的约20%。因此,端部点的模式是初始体重的30%的重量降在一个星期。大约一个星期后手术,动物慢慢恢复部分运动使他们能够养活自己和恢复体重(见洛维特酒吧 24对运动功能恢复的研究)的能力。

在研究结束时,由于C2的伤害是“哈ndmade“由外科医生,为了再现性模型的可靠性,每个损伤的程度要由组织学技术被重建。特别是,当呼吸神经可塑性进行了研究,Fuller 21表明,呼吸恢复的以下一个C2损伤的量呈正相关,其余幸免腹侧白质。

在使用C2损伤的大鼠模型研究呼吸后皮损神经可塑性的优点

该C2小鼠模型来研究后皮损呼吸生理学和/或假定的策略,以改善/恢复呼吸功能不全带来许多优势,因为:1)大鼠都是现成的来自世界各地的商业化育种; 2)由于其体积小,寿命短,环境条件进行认真的监测,严格控制从出生到成年; 3)鼠已成为首屈一指的机型Of呼吸神经生物学,取代了更为传统的模式,猫。因此,大量的数据可在有关大鼠神经解剖学,神经化学,神经生理学和反射性通气反应的文献中,提供上下文中执行和解释实验结果; 4)(相对)低遗传之间市售的大鼠品系的异质性使得在实现统计功率所需的动物的数量的减少,并有利于不同实验室之间结果的比较; 5)大鼠有一个非常低的死亡率下颈髓损伤,从而减少了所需的统计力量的动物的数量; 6)大鼠有一个非常快速的运动功能恢复率下颈脊髓损伤(例如,对猫,狗或灵长类动物)。因此,使用大鼠的降低的时间长度的动物需要手术后的重症监护( 例如 ,膀胱表达,流体管理,等等),并且最小imizes动物受痛苦; 7)不同的是运动功能,呼吸功能并不需要动物的动机,很容易量化(隔膜肌电图,膈神经ENG,潮气量和频率); 8)的一个关键方面是“膈神经交叉现象”(CPP)。这种特殊的主题有使用大鼠作为模型广泛发表的文献(见Goshgarian 等人 5,16的评论。); 9)老鼠和人类有许多共同的特点在他们的呼吸控制系统,该系统使大鼠良好的临床前模型来研究呼吸功能不全下面的颈椎SCI12。此外,一个实验室已经开始成功地开发一个小鼠模型25 C2半切。这种方法提供了关于未来利用转基因动物的极大热情。

更临床相关动物模型是在颈椎水平26-28一个挫伤的伤害。然而,在伤的再现性inconsistent,主要是由于降呼吸途径的位置和不可能做了广泛挫伤(这将极大地降低了动物的存活率)。更多的工作必须做了阐述挫伤模型,以确定合适的方式来诱导永久赤字挫伤受伤。

用途为C2损伤小鼠模型

此C2脊髓损伤模型是各类可塑性的研究特别相关。例如,从受伤的识别预运动神经元位于脑干(rVRG核)29以及deafferented膈运动神经元细胞和分子水平的变化30-32进行了研究。随后的炎症过程33和细胞结构的变化(perineuronal净变动10)进行了调查继C2脊髓损伤。脊柱结构变化(替代PA的含义thways 34和脊髓的interneurons 8),或在隔膜运动终板4的超微结构变化的参与也积极参与下面的一个C2脊髓损伤的呼吸活动的自发恢复。在C2脊髓损伤模型中研究最多的话题是整个呼吸系统(潮气量,频率在非麻醉动物24)及其以后的自然恢复初始伤害的生理后果(对麻醉的准备,即膈神经活动17,膜片活动16,17以及最近的肋间活性35)。此C2 SCI小鼠模型也被用于研究后肢损伤和随后的自然恢复和恢复引起的下列非侵入性的战略(间歇hypoxias 24)。

结论

该C2脊髓损伤小鼠模型是一个强大的一ND有用的临床前模型来研究呼吸和非呼吸神经可塑性,并测试不同的推定治疗策略,可改善脊髓损伤患者的呼吸。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

这项工作是由欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)根据编号246556赠款协议(欧洲项目RBUCE-UP)的资助,HandiMedEx分配由法国公共投资委员会。马塞尔Bonay由Chancellerie德社区学院巴黎(腿华先生),全宗德Dotation RECHERCHE恩桑特Respiratoire和中心D'援助Respiratoire住所德法兰西岛(CARDIF)支持

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal
Male Sprague Dawley Rat Janvier 225-250 g
Surgical Instruments
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tool 91150-20
Student Standard Pattern Forceps Fine Science Tool 91100-12
Mayo-Stille Scissors Fine Science Tool 14013-15 Curved
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tool 91500-09 Straight
Spring Scissors - 8 mm Blades Fine Science Tool 15025-10 Straight Blunt/Blunt
Friedman Pearson Rongeur Fine Science Tool 16121-14 Curved
Dissecting Knife - Fine Tip Fine Science Tool 10055-12 Straight
Olsen-Hegar Needle Holder Fine Science Tool 12002-14 Serrated
Weitlaner-Locktite Retractor Fine Science Tool 17012-11 2x3 Blunt
Absorbable surgical sutures Centravet BYO001 Suture size 4-0
Equipment
Hot Bead Steriliser Fine Science Tool 18000-45
Catheter  Centravet CAT188 16 G
Laryngoscope
Guide wire
Laryngeal mirror Centravet MIR011
Lactated Ringers Centravet RIN020
Syringe Centravet
Needle Centravet
O2 Air Liquid I1001M20R2A001
683 RodentT Ventilator 115/230V Harvard Apparatus 55-0000
Stand-Alone Vaporizer WPI EZ-155
Thin line heated bed WPI EZ-211
Air canister WPI EZ-258
Drugs
Carprofen Centravet
Rimadyl Centravet RIM011
Buprenorphine Centravet BUP001
Baytril Centravet BAY001
Dexmedetomidine Centravet DEX010
Atipamezole Centravet ANT201
Betadine solution Centravet VET002
Isoflurane Centravet VET066

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References

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生理学,第87,大鼠,颈脊髓损伤,呼吸赤字,交叉膈现象,呼吸神经可塑性
颈脊髓损伤的小鼠模型研究后皮损呼吸神经可塑性
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Keomani, E., Deramaudt, T. B.,More

Keomani, E., Deramaudt, T. B., Petitjean, M., Bonay, M., Lofaso, F., Vinit, S. A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity. J. Vis. Exp. (87), e51235, doi:10.3791/51235 (2014).

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