Abstract
Odorant moleculen binden aan hun doel receptoren in een precieze en gecoördineerde manier. Elke receptor herkent een specifiek signaal en stuurt deze informatie naar de hersenen. Als zodanig bepaalt hoe olfactorische informatie wordt naar de hersenen, modificeren zowel perceptie en gedrag verdient onderzoek. Interessant ook wordt steeds duidelijker dat cellulaire transductie en transcriptiefactoren betrokken bij de diversificatie van reukreceptor neuron. Hier bieden wij een robuust geheel monteren immunologische etikettering methode om in vivo reukreceptor neuron organisatie assay. Met deze methode identificeerden we allemaal reukreceptor neuronen met anti-Elav antilichaam, een bekende pan-neurale marker en Or49a-mCD8 :: GFP een reukreceptor neuron specifiek uitgedrukt in NBA neuron met anti-GFP antilichaam.
Introduction
Het olfactorische systeem wordt onderscheid gemaakt tussen een enorme verscheidenheid van geurmoleculen en vervolgens de verkregen informatie naar de hogere hersencentra. Deze ingang wordt gebruikt om fundamentele dierlijke gedrag, zoals voeding en paring 1-6 nauwkeurig te regelen. Zoals elk olfactorische soort neuron is gekoppeld aan een specifieke set van geuren, de diversificatie van de olfactorische receptor neuronen (ORN) s is essentieel voor een goede olfactorische systeem functioneren 7.
Drosophila genetica stelt ons in staat om enkele cel niveau onderzoek bij moleculaire mechanismen geassocieerd met ORN ontwikkeling en fysiologische functie 8-16 uit te voeren. Ganse berg immunostaining van Drosophila antennes heeft ons in staat om te begrijpen in meer detail de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de diversificatie van olfactorische receptor neuronen (ORN) s 7. Hierin bieden wij een uitgebreide beschrijving van een eenvoudige methode om achieve dit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid appel plaat
- Meng 12,5 g agar, 125 ml 100% in de handel verkrijgbaar appelsap, 12,5 g glucose, en 375 ml H 2 O. Magnetron het mengsel gedurende 1 tot 2 minuten en giet de 3 cm celkweekschaal. Bewaren bij 4 ° C.
2. Genetische kruis
- Gebruik de volgende representatieve genetische kruis:
Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118
3. Dissection en kleuringsprotocol
- Verdoven van de vlieg en snijd de vlieg hoofd verticaal door vast te houden met behulp van een pincet.
- Plaats de antennes bevattende gedeelte voorzichtig op een appel plaat.
- Snijd het derde segment van de antenne met behulp van fijne dissectie schaar.
- Breng 90 pl van het fixatie-oplossing (4% paraformaldehyde in 0,1% PBST (PBS met 0,1% Triton X-100)) naar het midden van een glazen bodem kweekschaal.
- Voorzichtig overdracht van de ontleed antennae met een scherpe naald rechtstreeks naar de fixatie-oplossing. Indien nodig, fysiek onderdompelen de antennes in de oplossing met behulp van naald.
- Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was de antennes in 0,4% PBST (PBS met 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuten elk, waardoor ze in dezelfde schaal. Gebruik geel tips om te verwijderen en PBST oplossing toe te voegen. Gebruik 90 ul van de wasoplossing elke keer.
OPMERKING: Plaats de schotel in een shaker tijdens immunohistochemie. Voor het verwijderen of toevoegen van de oplossing in de schaal, brengt de antennes in het midden van de schaal met de naald en voorzichtig toevoegen of verwijderen oplossing van de rand van de schaal. - Blokkeer de antennes met 90 ul van 5% normaal paardenserum in 0,1% PBST gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Na verwijdering van de blokkerende oplossing, incubeer de antennes met 90μl van primaire antilichamen in 0,1% PBST dat 5% paardenserum gedurende 48 uur bij 4 ° C in een vochtige houder zoals eerder beschreven
- Was de antennes 6x 10 minuten in 0,4% PBST.
- Incubeer de antennes met 90 gl secundaire antilichamen in 0,1% PBST dat 5% paardenserum gedurende 48 uur bij 4 ° C. Was 6x 10 minuten met behulp van 0,4% PBST.
- De antennes monteren, verwijderen PBST uit de kweekschaal zoveel mogelijk en geleidelijk twee verschillende concentraties glycerol aan de antennes. Voeg eerst 40% glycerol om de schotel 1 tot 2 minuten; deze verwijder en voeg 80% glycerol.
- Extract voorzichtig de antennes (inclusief 80% glycerol) van de cultuur schotel met behulp van gele punt en leg ze op een dia. Plaats voorzichtig een dekglaasje op de bovenkant en sluit de dekglaasje randen met nagellak. De antennes zijn nu klaar om te worden afgebeeld door fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ervoor zorgen dat zowel de dissectie en fixatie snel worden uitgevoerd is een belangrijke factor in het bereiken van succes met dit protocol. Met behulp van fijne schaar en pincet is ook van cruciaal belang. Na immunokleuring werden fluorescent gelabeld antennes onderzocht onder een confocale microscoop. We normaal gesproken 1 uM secties met behulp van een 20x lens. We gelabeld NBA 7 ORNs behulp Or49a-mCD8 :: GFP en telde het aantal NBA ORNs in wild-type antenne. De mCD8-GFP reporter wordt celmembraan gelokaliseerd en zo de expressie te zien in figuur 2 vertoont de celmembraan van OR49a ORNs die GFP. In figuur 2 toont NBA ORNs expressie met anti GFP-antilichaam en anti Elav werd gebruikt als pan-neurale marker. Het gemiddelde aantal NBA ORNs per antenne is 20 (n = 8).
Figuur 1: Algemeen overzicht van de dissection procedure.
Figuur 2: Projectie van confocale Z-serie een succes ontleed antenne. Om neuronen detecteren anti-Elav antilichaam werd gebruikt als een pan-neurale marker (A) en anti-GFP antilichaam aan specifieke geurstof receptor expressie (B) en samengevoegd beeld te detecteren zoals in (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontleding van de Drosophila antenne beschrijven we is eenvoudig en in een laboratorium omgeving. Om een succesvolle dissectie te garanderen, is het essentieel om fijne kanten schaar gebruiken. Terwijl de immunokleuring ontleed antenne, is het belangrijk te incuberen in een vocht gevulde container verdamping van de antilichaamoplossing voorkomen. De ontleed antenne heeft de neiging te zweven in de oplossing. Met 0,1% Triton in PBS gedurende de fixatie verhinderde stappen zullen verzinken van de antenne vergemakkelijken de oplossing en betere kleuring waarborgen. Met behulp van 'glazen bodem cultuur schotel "kon tijdens immuunkleuring het verlies van antennes te beperken en te zorgen voor de kleine hoeveelheden (90 pl) van antilichaam-oplossing gebruikt in elk experiment.
Neuronale-klasse diversificatie is een centraal kenmerk van neurogenese. Dit fysiologisch proces wordt geïllustreerd in het olfactorische systeem, dat een grote reeks van reukreceptor neuron gebruikt (ORN)klassen. Generatie van uiteenlopende ORNs met geurende receptor expressie en axonale targeting is cruciaal voor het genereren van de neuronale diversiteit nodig informatie uit het geurmoleculen hogere hersencentra. Onze hele mount antenne immunokleuringen protocol helpt bij het bevorderen van ons begrip van de moleculaire mechanismen van ORN diversificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door MEXT gesteund programma voor de Strategic Research Foundation bij Private universiteiten en JSPS Young Scientist B subsidie voor HT Wij willen Ohtake Norihito bedanken om de videoclips te bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
