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Neuroscience

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Abstract

Anche se di breve durata, mitosi è un processo multi-step complesso e dinamico fondamentale per lo sviluppo di organi compreso il cervello. Nella corteccia cerebrale di sviluppo, mitosi anormale di progenitori neurali può causare difetti di dimensioni e funzione cerebrale. Quindi, vi è una necessità critica per strumenti per comprendere i meccanismi di neurale progenitore mitosi. Sviluppo corticale nei roditori è un modello eccezionale per lo studio di questo processo. Progenitrici neurali mitosi è comunemente esaminati nelle sezioni di cervello fissi. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per l'imaging dal vivo della mitosi in ex vivo fettine di cervello embrionali. Noi descrivere i passaggi critici per questa procedura, che includono: l'estrazione del cervello, l'incorporamento del cervello, vibratome sezionamento di fette di cervello, colorazione e coltura di fette, e time-lapse imaging. Abbiamo poi dimostrare e descrivere in dettaglio come eseguire un'analisi post-acquisizione della mitosi. Includiamo risultati rappresentativi from questo test utilizzando il colorante vitale Syto11, topi transgenici (istone H2B-EGFP e centrin-EGFP), e in utero elettroporazione (mCherry-α-tubulina). Discuteremo di come questa procedura può essere meglio ottimizzato e come può essere modificato per lo studio della regolazione genetica della mitosi. Vivo imaging di mitosi in fettine cerebrali è un approccio flessibile per valutare l'impatto dell'età, anatomia, e perturbazione genetica in un ambiente controllato, e per generare una grande quantità di dati ad alta risoluzione temporale e spaziale. Quindi questo protocollo integrerà gli strumenti esistenti per l'analisi dei neurali progenitrici mitosi.

Introduction

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come eseguire l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi in fettine di cervello embrionali. Utilizzo di immagini dal vivo di fette di cervello nella cultura, questo protocollo fornisce un metodo semplice per saggiare molteplici aspetti della mitosi nei progenitori neurali in un ambiente altamente simile ad un ambiente in vivo. Esso può essere applicato a cervello di animali e / o cervelli mutanti che sono state manipolate con elettroporazione in utero) 1-5. Questa tecnica è ideale anche per testare l'effetto di agenti farmacologici su mitosi precursori neurali, semplicemente aggiungendo un agente al mezzo di coltura. In sintesi, questo articolo farà un protocollo tecnicamente impegnativo accessibile a coloro che studiano la neurogenesi.

Durante la neurogenesi, distinte popolazioni progenitrici neurali subiscono divisioni precise per generare neuroni che alla fine contribuiscono a sei strati corticali dell'adulto neocorteccia 6-8. All'inizio dello sviluppo corticale, la piscina precursore neurale si espande come neuroepiteliale (NE) le cellule si dividono simmetricamente di auto-rinnovarsi. Cellule NE poi convertono in cellule gliali radiali (RGCs). Inizialmente RGCs dividono simmetricamente per produrre due nuovi RGC, tuttavia durante la maggior parte della neurogenesi, la modalità principale RGC 'di divisione è asimmetrica. In divisione asimmetrica, 1 RGC dà luogo ad una nuova RGC e di un neurone post-mitotico, o un progenitore più specializzato (sia per un breve precursore neurale (SNP), un glia radiale esterna (ORG), o un progenitore intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, e ORG possono generare neuroni alla sub-ventricolare, e regioni basali della corteccia, rispettivamente. Quindi, la divisione cellulare dei progenitori è un processo fondamentale per generare neuroni del neocorteccia.

Numerosi studi indicano una correlazione tra specifici tratti mitotici di RGCs e il destino delle cellule figlie. Haydar et al. Ed Takahashi et al.hanno dimostrato che la durata mitotico RGC e ciclo cellulare aumento di lunghezza come procede neurogenesi, un reperto eco nel follow-up di studi 10-13. Un certo numero di studi hanno suggerito che fuso mitotico orientamento rispetto al ventricolo influenza aspetti della neurogenesi e corticogenesi, compresi i tipi di neuroni generati e posizione della progenie nel cervello, rispettivamente 3,10,14-16. Sia orientamento del piano di clivaggio influenza direttamente il destino della cellula è controversa, ma la conclusione resta che questo mitotico impatti parametri neurogenesi. Ulteriori sottolineando l'importanza della mitosi è l'osservazione che molti geni coinvolti nei meccanismi di mitosi sono cruciali per la neurogenesi e per il corretto sviluppo del cervello 17-20.

La mitosi è un processo dinamico, ma fino ad oggi la maggior parte degli studi che descrivono neurali progenitrici mitosi utilizzare l'analisi di sezioni di tessuto fissi o immagini di progenitori neurali tramite coltura cellulare in vitro. Così, i metodi tradizionali per valutare la mitosi forniscono solo un'istantanea di questo processo e non riescono a scoprire come le cellule si comportano in un tessuto. Vivo imaging progenitrici neurali mitosi è diventato sempre più uno strumento fondamentale per comprendere la funzione dei progenitori neurali. Per esempi vedere questi riferimenti 4,8,10,21-25. Diversi protocolli in essere sono stati pubblicati per la preparazione e l'imaging di fette di cervello 26,27. Tuttavia ad oggi, un protocollo completo per l'imaging e analisi di mitosi non è stata descritta né dimostrato in video.

Questa tecnica offre diversi vantaggi significativi rispetto analisi fisso di sezioni cerebrali. Analisi Time-lapse di fette di cervello consente la generazione di un numero significativamente maggiore punti di dati che possono essere analizzati in modo flessibile. In primo luogo, i dati vengono raccolti presso i singoli punti di tempo nel corso di alcuni minuti a diverse ore. Si può analizzare punti temporali individuali (per creare un montaggio statico) opuò combinare diversi momenti in film. In secondo luogo, confocale di fette consente la generazione di dati in diverse sezioni Z in fettine cerebrali. Come risultato, le singole sezioni possono essere analizzati. In alternativa, pile di singole sezioni possono essere combinati in una proiezione massima intensità. Terzo, analisi viene fatta nel contesto di un tessuto, rivelando come cellule si dividono rispetto alle cellule e strutture vicine. Quarto, è ideale per l'analisi di mutanti che mostrano alcune prove di difetti mitotici. Insieme, questo protocollo aiuterà a chiarire passaggi critici per aiutare gli investigatori che intendono effettuare l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi nei propri laboratori.

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Protocol

1. Preparazione dei supporti (figura 1, Punto 1)

  1. Fetta Cultura Media
    1. 25 ml di fetta di terreno di coltura è sufficiente per preparare piatti peggiori 5 in vetro con 2 fette per bene.
    2. In una provetta da 50 ml, aggiungere 250 ml di una soluzione di N2 100x e 500 microlitri di una soluzione 50x B27 senza vitamina A. Aggiungere DMEM/F12 ad un volume di 22,5 ml.
    3. Filtro sterilizzare soluzione e successivamente aggiungere 1,25 ml di siero di cavallo inattivato calore e 1,25 ml di siero fetale bovino.
    4. Incubare soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C per tutta la durata della preparazione delle fette.
    5. Aggiungere fattori di crescita (EGF, FGF e concentrazione finale di 10 ng / ml e 20 ng / ml, rispettivamente) immediatamente prima dell'inizio della coltura. La composizione di questo mezzo è stato ottimizzato per promuovere la sopravvivenza delle cellule in coltura e per aumentare il tasso di proliferazione dei progenitori neurali. Ciò quindi massimizzare la probabilità diosservare cellule in mitosi nella fetta.
  2. HBSS completa dissezione Solution
    1. Preparare 500 ml di piena HBSS aggiungendo 50 ml di 10x HBSS, 1,25 ml di 1 M Hepes (pH 7.4, FC 2,5 mm), 6 ml di 2,5 M D-glucosio (FC 30 mm), 2,2 ml di 0,9 M NaHCO 3 (FC 4 mm) e autoclavato diH 2 O al volume finale di 500 ml.
    2. Soluzione Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C fino alla raccolta delle corna uterine dal mouse incinta. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per settimane.
    3. Mantenere HBSS in ghiaccio durante l'intera procedura di dissezione.
  3. Incorporare soluzione
    1. Per l'inclusione di quattro cervelli embrionali, preparare 30 ml di 3% agarosio low melting nella soluzione completa HBSS. In una provetta da 50 ml conica, aggiungere 0,9 g di agarosio low melting e pieno HBSS a 30 ml.
    2. Mescolare la soluzione con un vortex e fondere in un forno a microonde con il tubo in piedi e il tappo aperto.
    3. Mentre nel microonde, monitorare la soluzione di pOverflow revent a causa di eccessiva ebollizione. Quando bolle si avvia, interrompere il forno a microonde e agitare la soluzione.
    4. Ripetere queste operazioni fino a quando tutta l'agarosio si è sciolto.
    5. Conservare la provetta in un bagno d'acqua a 42 ° C.

2. Dissezione degli embrioni (figura 1, punto 2)

  1. Dopo un'attenta eutanasia del mouse in stato di gravidanza, raccogliere le corna uterine e trasferirli in un piatto di 10 centimetri 2 Petri contenente freddo pieno 1x HBSS. L'età dell'embrione può variare a seconda dello studio. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la coltura di fette di cervello da giorni embrionali E12.5 a E17.5. A causa delle loro dimensioni, i cervelli più giovani tendono ad essere più difficile da lavorare.
  2. Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo 26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essereconservato a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli.
  3. Raccogliere gli embrioni e sezionare i cervelli embrionali come descritto precedentemente nel ratto e topo 26,27, fino ad ottenere un cervello embrionale completo compreso hindbrain e proencefalo con i due emisferi cerebrali. Questi possono essere conservati a temperatura ambiente finché non sono stati sezionati tutti i cervelli.

3. Embedding dei cervelli embrionali (Figura 1, punto 3)

  1. In un recipiente contenente ghiaccio, creare un buco nel ghiaccio per inserire gli stampi incorporamento in.
  2. Versare il terreno agarosio 3% in uno stampo di plastica e posizionare che stampo nel foro preparato nel ghiaccio.
  3. Mescolare il mezzo agarosio con la punta di un termometro digitale finché la temperatura raggiunge i 35 ° C.
  4. Prontamente trasferire il cervello nel mezzo di inclusione.
  5. Punto Critico: Per rimuovere l'eccesso HBSS all'interfaccia tra il cervello e l'agarosio, con cura e asciugare delicatamente / ruotare il cervello voltenella soluzione incasso con le pinze.
  6. Un cuscino di agarosio gelificata formerà sul fondo dello stampo a contatto con il ghiaccio. Una volta che il cuscino può essere sentito con la punta della pinza agitando il cervello, posizionare il cervello con la dorsale verso l'alto. Il cervello non dovrebbe sprofondare fino al fondo dello stampo.

4. Preparazione di agarosio Block (Figura 1, punto 4)

  1. Lasciate che il agarosio indurire nel ghiaccio per almeno 5 min.
  2. Utilizzando una lama di rasoio, sezione angoli dello stampo.
  3. Ritagliarsi cautela un blocco di agarosio intorno al cervello con una lama di rasoio. Cercare di ridurre al minimo il numero di tagli per evitare perturbando il cervello incorporato.
  4. Assicurarsi che il blocco ha una superficie più ampia nella regione caudale del cervello (contro la regione rostrale, vedi Figura 1, punto 4) per aumentare la stabilità del blocco sul piedistallo sezionamento.
  5. L'ultimo taglio dovrebbe essere quello sul lato caudale del cervello;questo taglio definirà il piano di sezione corretta con il vibratome.
  6. Farlo allineando la lama perpendicolare all'asse rostro-caudale del cervello e il blocco di agarosio. Far scorrere verso il basso la lama caudalmente lungo l'asse rostro-caudale e fare il taglio finale di circa 5 mm dalla regione più caudale del cervello.
  7. Impostare il blocco di agarosio / cervello da parte e ripetere l'incorporamento di altri cervelli.

5. Trasferimento dei cervelli incorporati nel vassoio della Vibratome (Figura 1, punto 5)

  1. Aggiungere una goccia di colla sul fondo del vassoio vibratome. Posizionare colla in modo che i blocchi di agarosio saranno posizionati all'interno dell'estensione della lama vibrante.
  2. Posizionare il lato del blocco di agarosio / cervello caudale sul bordo della spatola, con circa il 50% del ribaltamento blocco oltre il bordo della spatola.
  3. Applicare la faccia caudale del blocco di agarosio per la colla e far scorrere la spatola di distanza, mantenendo il blocco di agarosio al fondo del vassoio con la shoulder di un paio di pinzette. Non lasciate che la spatola contattare direttamente la colla.
  4. Sia la colla solidificare a temperatura ambiente per 5 min.

6. Sezionamento del Brains embedded (Figura 1, punto 6)

  1. Riempire il vassoio vibratome con HBSS.
  2. Definire le posizioni di partenza e di arrivo della lama vibratome.
  3. Genera 200-250 micron fette. Con il vibratome VT1000S, utilizzare i seguenti parametri: velocità 2-4, frequenza 8.
  4. Rimuovere con attenzione le fette dal vibratome quando vengono tagliate. Trasferire le fette con una spatola e il back-end di pinzette in 12 piatti e pieni di piena HBSS. In alternativa, alcuni ricercatori hanno usato un pennello al posto di pinzette Punto chiave:. Durante il trasferimento, fare attenzione che le fette di cervello rimangono attaccati al agarosio circostante.

7. Syto11 colorazione delle fette (Figura 1, punto 7)

  1. Diluire Syto11 ad una concentrazione finale di0,5-1 mM nel terreno di coltura fetta integrati con fattori di crescita.
  2. Nel pozzetto di una piastra 12 pozzetti, incubare fette da un cervello in 2,5 ml di soluzione colorante per 1 ora a 37 ° C.
  3. Lavare le fette in 2,5 ml di mezzo di coltura fetta senza macchiare soluzione per 20 min.

8. Montaggio fette in un piatto fondo di vetro (Figura 1, punti 8, 9)

  1. Preparare 15 ml di incorporamento soluzione di collagene per fetta. Preparare una soluzione di 1,5 mg / ml di collagene miscelando 375 ml di 3 mg / ml di soluzione di collagene di tipo I con 75 ml di DMEM 10x, 9,4 ml di NaOH 1 M, e 290 ml di H 2 O. Memorizzare sul ghiaccio.
  2. Una goccia 15 ml della soluzione di collagene nella parte inferiore di un fondo 35 millimetri vetro micropozzetti piatto. Stendere con una punta di pipetta in base alle dimensioni della fetta.
  3. Trasferire la fetta nella goccia di collagene con una spatola e un paio di pinzette Punto chiave:. Montaggio più sezioni in diversipiatti ORL aumenta la probabilità di acquisire fette adatti per l'imaging. Schermo attraverso diverse sezioni e selezionare quelli che meglio soddisfano i criteri descritti di seguito nella sezione "Rappresentante dei risultati".
  4. Lasciate le fette incubare a temperatura ambiente per 10 min prima di trasferirli in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  5. Dopo 20 minuti, aggiungere 1,2 ml di fetta di terreno di coltura nel fondo di vetro micropozzetti Dish. Aggiungere 600 pl di mezzo alla volta e stendere con un puntale.
  6. Catturare un'immagine basso ingrandimento della fetta cervello per registrare il livello anatomico e l'integrità della fetta.

9. Imaging Live della Slices (Figura 1, i passaggi 10, 11)

  1. Lasciate le fette recuperare nell'incubatrice per almeno 1 ora e 30 min a 37 ° C con 5% di CO 2 prima di imaging in tempo reale.
  2. Immagine le fette con il microscopio della scelta, tenendo presente che Syto11 è molto incline a photobleaching. Qui un inverted disk spinning microscopio confocale viene utilizzato (Andor XD rivoluzione filatura microscopio confocale disco). In alternativa un microscopio confocale a scansione laser può essere usato. I seguenti parametri sono per il microscopio disco rotante set-up.
  3. Durante l'intera sessione di imaging in tempo reale, fette mantenere a 37 ° C, 5% CO 2 in una camera di incubazione umidificata collegata al microscopio.
  4. Celle di immagine con un obiettivo 60X olio siliconico con una distanza di lavoro di 300 micron, e una apertura numerica di 1,3 (per esempio vedere figure 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un obiettivo olio 100X con una distanza di lavoro di 130 micron e una apertura numerica di 1,4 (per esempio vedere Figura 4C) può anche essere usato. La risoluzione della fotocamera è di 512 x 512.
  5. Fotografia le celle di un 30 um z-stack, con il centro della z-stack situata a circa 40 micron sotto la superficie della fetta. Cercando di immagine più in profondità nel tessuto può causare l'obiettivo di aggiungerepressione meccanica sulla fetta. Ciò può compromettere l'integrità della fetta cervello. Se si intende effettuare ricostruzioni 3D delle cellule, utilizzare un z-intervallo di non più di 2 pm.
  6. Regolare la potenza del laser e tempi di esposizione per limitare photobleaching. Utilizzare tempi di esposizione che vanno da 30 a 200 msec, a seconda dell'intensità del segnale Syto11.
  7. Con un palco motorizzato, immagine più posizioni in più sezioni montate in 1 piatto. Ad esempio, l'immagine fino a 20 posizioni sparse 4 fette differenti in 1 piatto unico.
  8. Per l'imaging in tempo reale, utilizzare una risoluzione temporale inferiore a 5 minuti per consentire l'individuazione delle diverse fasi della mitosi. Utilizzando Syto11 e / o istone H2B-EGFP, 4-5 ore di immagini dal vivo sono sufficienti per osservare un numero significativo di cellule mitotiche. Tuttavia, se l'imaging scarsamente etichettati cellule in mitosi (come quelli raggiunti da elettroporazione in utero), quindi un parametro di imaging più lungo (durante la notte) è appropriato e lavora noill.
    Nota: Usando questo protocollo, di solito osserviamo in media 10 cellule in mitosi per posizione. Come detto sopra, l'imaging aerei montato fette aumenta la probabilità di avere un esperimento riuscito. Con questo approccio tipicamente identificare le cellule mitotiche in quasi tutti gli esperimenti eseguiti con Syto11 o istone H2B-EGFP.

10. Post-acquisizione Analisi della mitosi (figura 2)

Tutte le procedure descritte in questa sezione sono stati ottimizzati in Fiji (ImageJ), che è vantaggioso perché si tratta di un software open source gratuito. Sono a disposizione per eseguire le stesse operazioni, ad esempio Metamorph, Imaris, e Amira altre soluzioni software.

  1. Identificazione dei Mitotic Figure in Fiji
    1. Dopo aver aperto il set di dati per una posizione di "HyperStack", selezionare un piano z (vedere la Figura 2A per la posizione della barra di scorrimento) dove il tessuto e le cellule aspetto sano (vedi criteri nella sezione discussione).Scorrere attraverso la dimensione temporale per identificare le cellule che passano attraverso anaphase, in quanto è il più facile fase mitotico da identificare.
    2. Scorrere indietro nel tempo per identificare il punto di tempo in cui la cellula entra mitosi (condensazione del DNA). La cella può muoversi attraverso z-aerei, ma la risoluzione temporale e parametri z-stack descritti in precedenza sono stati ottimizzati per attivare questo processo.
    3. In un foglio di calcolo, registrare il 4D coordinate della cella nella HyperStack (X, Y, Z e tempo, vedere la Figura 2A per visualizzare la posizione di questi dati nell'interfaccia Fiji), che entra mitosi. Conoscendo queste coordinate impedirà contare la stessa cella più volte.
    4. Scorrere in avanti nel tempo e registrare il tempo quando la cella passa da una fase all'altra. Documentare la durata di ciascuna fase mitotica per una data cella.
    5. Procedere con altre cellule, attraverso l'intero set di dati (più celle all'interno e tra posizioni).
  2. 3D Ricostruireione delle cellule e quantitativa di rotazione durante la metafase (Adattato da Haydar et al, 2003) (Figura 2B).
    1. Dopo aver identificato più celle mitotiche, utilizzare le coordinate di una cella e scorrere in avanti nel tempo fino all'inizio di metafase.
    2. Ruotare l'intero "HyperStack" in modo che il bordo ventricolare è planare (usando il "Immagine / Trasforma / Ruota ..." il comando). Utilizzare lo strumento "angolo" per determinare l'angolo di applicare per questa rotazione.
    3. Identificare il piano z dove la cella di interesse è più visibile. In quel piano, utilizzare lo strumento "rettangolo di selezione" per disegnare una selezione che comprende tutta la cella.
    4. Identificare le z-piani che includono la cella di interesse. Utilizzare il comando "Immagine / Duplica" per creare un "sub-stack". Nella finestra di dialogo, lasciare "HyperStack Duplica" selezionata. Il "Slices (z)" parametro corrisponde alle z piani, tra cui l'intero cell, e le "Frames (t)" parametro corrisponde al punto di tempo corrente.
    5. Se la risoluzione è scarsa, aumentare la dimensione della "sub-stack" utilizzando il "Immagine / Regola / Taglia ..." il comando.
    6. Generare una ricostruzione in 3D della cella al punto di tempo corrente utilizzando il "progetto Image/Stacks/3D ..." il comando. I parametri per questo comando vengono visualizzati nella figura 2B. La "spaziatura fetta" corrisponde all'intervallo tra ciascuna delle immagini piano z (micron). Importante: assicurarsi che la dimensione fisica (micron), del sub-stack è stato conservato. In caso contrario, l'interpolazione dei pixel nella dimensione z sarà errato, e la ricostruzione 3D sarà imprecisa.
    7. Utilizzando la barra di scorrimento, ruotare la conseguente ricostruzione 3D in modo che il bordo della piastra di metafase è visibile. Il numero di telaio corrisponde all'angolo beta descritto in Figura 3B, registrare questo numero. Utilizzoil tool "angolo" e la "Analyze / Measure ..." il comando, misurare l'angolo tra l'orizzontale e una linea che attraversa il piatto di metafase perpendicolarmente (Figura 2B). Questo è l'angolo alfa.
    8. Registrare questi angoli per tutti i punti temporali metafase della cella di interesse. L'angolo di rotazione tra i punti di tempo (t) e (t-1) è uguale al valore assoluto della differenza tra un angolo a (t) e tale angolo a (t-1).
  3. Misurare l'orientamento della fenditura Piano
    1. 3D ricostruire una cella di interesse a un certo punto durante l'anafase seguendo le istruzioni descritte per la ricostruzione 3D di piastre in metafase.
    2. Ruotare la ricostruzione fino ai bordi delle due lastre formate dai cromosomi segreganti sono visibili.
    3. Utilizzare lo strumento angolo per misurare l'angolo tra l'orizzontale (bordo ventricolare) e una linea parallela alle due piastre formate dai cromosomi segreganti. Questo è l'angolo del piano di clivaggio (Figura 2C).
  4. Generazione di Film
    1. Come le cellule si muovono spesso in diversi Z-aerei, identificare i z piani occupati dalla cellula durante la sessione di imaging dal vivo. Generare una "proiezione massima intensità" di questi z-piani utilizzando il comando "Immagine / Pile / Z progetto ...". Salvare lo stack risultante come file ". TIF".
    2. Aprire questo file nella versione 1.45 di ImageJ come Fiji non include un plugin stabile per la generazione di ". Mov" o file ". Avi".
    3. Usare il "File / Salva con nome / ..." il comando di ImageJ per generare un filmato in un formato compatibile con le applicazioni a valle.

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Representative Results

Il successo di questo test e l'osservazione di più celle mitotiche durante una sessione di imaging in tempo reale dipendono in gran parte sia l'integrità e livello anatomico della fetta in cui sono fatti acquisizioni. Come discusso in seguito, il livello anatomico di una fetta è un fattore importante. Figura 3A mostra rostro-caudale e medio-laterale località dove abbiamo avuto più successo. Per ulteriori discussioni di questo tema si veda Noctor 26. L'integrità della fetta può variare in diverse regioni della fetta. Questo può essere determinato prima dell'inizio del time-lapse (utilizzando l'imaging dell'intero fetta come al punto 7.6). In una buona zona di un cervello E13.5 possono essere effettuate le seguenti osservazioni: molte cellule mitotiche si trovano al confine ventricolo, i nuclei interfase saranno ellittica anziché rotonda e nuclei interfase appariranno rispetto colonnare al confine ventricolo . In una regione meno desiderabile del cervello, lanuclei cercherà arrotondate e un po 'disorganizzato (Confronta figure 3B e 3C, e vedi Figura 3D per una foto di una fetta ben montato).

Quando si ottengono le condizioni ideali, questo test consentirà l'identificazione qualitativa delle diverse fasi della mitosi. Questi possono essere rilevate mediante l'analisi del modello di DNA (vedere Figura 3E per esempi di apicalmente dividendo le cellule in ogni fase della mitosi). Durante la profase, condensazione del DNA avrà l'aspetto di DNA scarsamente marcato (ricco di DNA e regioni di DNA-mediocre nel nucleo). Durante metafase, i cromosomi formano un piano all'equatore del corpo cellulare. A seconda dell'orientamento del piano, il modello DNA è (i) una linea spessa (Figura 3E, immagine 1) o (ii) una "rosetta" con una regione di DNA-povero nel mezzo (Figura 3E, immagine 2) . Durante l'anafase quando i cromosomi si separano, sembrano "mani"; che migrano in direzioni opposte. Questa fase può essere difficile identificare quando il piano di clivaggio è in X - Y piano di acquisizione. Durante la telofase, il DNA si rilassa e assume una forma ellissoidale, come le riforme dell'involucro nucleare. Punti temporali individuali possono essere raccolti per visualizzarne la mitosi nel tempo (vedi Figura 3F).

Oltre all'imaging mitosi dei progenitori apicalmente divisorie, questo test può essere utilizzato per immagine basally divisione delle cellule come ORG o INP, l'ultima delle quali è più probabile rappresentata in Figura 3G. Tali cellule sono identificabili dalla loro posizione per divisione nella SVZ strato. Tuttavia per marcare veramente queste cellule è meglio coppia all'analisi con l'espressione di un marcatore fluorescente che contrassegna il processo cella o destino (vedi Figure 4B-D). INP avrà né un processo apicale né basale, ORG avrà un processo basale con il loro corpo cellulare si trova negli strati esterni, e RGC avrà un baprocesso sal con il loro corpo cellulare si trova nello strato VZ.

La mitosi dei progenitori può essere visualizzato con metodi alternativi. Figura 4A illustrato l'utilizzo della istone H2B-EGFP topo transgenico per etichettare i cromosomi di tutte le cellule in divisione. Questo segna cellule in un modello simile a Syto11. Figura 4B illustra l'imaging eseguita con cervelli in utero elettroporate con EGFP-α-tubulina e istone H2B-mCherry. Come dimostrato, questo permette di visualizzare sia i microtubuli e dei cromosomi, e inoltre il corpo cellulare e il processo basale. Figura 4C rappresenta l'imaging eseguito con il cervello da un mouse Centrin-EGFP, in utero elettroporate con mCherry-a-tubulina e istone H2B-EGFP . Come dimostrato, ciò consente di cromosomi immagine e centrioli nel canale verde e il mitotico mandrino e cellula corpo / processo nel canale rosso. Figura 4D illustra l'imaging eseguito con cervellos in utero elettroporate con CMV-Cre scarsamente e CALNL-EGFP 28. Questa tecnica permette di scarsamente etichette progenitori divisione, rendendo l'analisi di singole cellule in divisione più facile. Quando si utilizza elettroporazione tuttavia, tenere presente che questo metodo si rivolge a un gruppo abbastanza sincronizzata delle cellule ciclabili 2,12. Ciò significa che i tempi di vivo dell'imaging relativi alla elettroporazione deve essere regolata, in modo che il gruppo di cellule elettroporate avvicina mitosi all'inizio della sessione di imaging. Se non, successo dell'esperimento nell'identificare eventuali cellule mitotiche può essere compromessa in una sessione di imaging breve termine.

Quando si ottengono le condizioni ideali, caratteristiche chiave di mitosi possono essere misurati quantitativamente compresa la durata complessiva mitosi, durata delle singole fasi, la rotazione del piano di metafase e orientamento del piano di clivaggio. Nelle condizioni descritte, abbiamo osservato una durata media mitotica complessiva di 1h30 min a giorni embrionali (E) 13.5 e 14.5. Come descritto in precedenza, la rotazione del piano metafase DNA può essere misurata in un punto temporale individuo o cumulativamente per la durata di un intero metafase 2,6,9,10. Ciò può essere ottenuto utilizzando ricostruzione 3D del piano metafase di una cella ad ogni tempo e la misurazione degli angoli di DNA rispetto al ventricolo. Abbiamo applicato con successo il metodo in questo documento per seguire celle per almeno 3 ore.

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione schematica di passaggi protocollo. Tempo necessario per ogni fase viene indicata in ciascuna delle fasi. Dettagli per ciascuna di queste fasi sono descritte nella sezione "protocollo". Si prega di notare che il punto 7 può essere esclusa quando l'imaging fette di hiembrioni pietra H2B-EGFP, o fette di cervelli che sono stati elettroporate con plasmidi che esprimono marcatori per mitosi.

Figura 2
Figura 2. Analisi post-acquisizione di time-lapse dataset video microscopia a Figi (ImageJ). A) Posizione dei diversi strumenti utilizzati per l'analisi in Fiji. B) diverse fasi coinvolte nella ricostruzione 3D di una cellula in metafase. Dettagli per ognuno di questi passaggi sono descritti nella sezione "protocollo". C) Misurazione della scissione orientamento del piano in un 3D ricostruito cella anafase. Notare che i numeri in B Fase 6 e C mostrano la sequenza seguita per misurare l'angolo. D) I dati rappresentativi che mostrano la distribution durata metafase in un gruppo di cellule mitotiche osservato alla frontiera ventricolare in E13.5 fettine di cervello (n = 35). E) i dati rappresentativi che mostrano la rotazione cumulativo di piastre in metafase nelle cellule in mitosi E13.5 al confine del ventricolo . Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Esempi di dati rappresentativi di analisi immagini dal vivo. A) lungo l'asse dorso-ventrale, mitosi è più facilmente ripreso in regioni dorsali di sezioni di cervello, perché il processo basale di RGC è più breve e quindi meno probabile che siano separabili da vibratome. Lungo l'asse rostro-caudale, fette nelle regioni caudale della corteccia dorsale dannorisultati più coerenti nelle nostre mani contesto. B e C) sono mostrati di una buona regione (B) ed una regione cattivo (C) per l'imaging. In una buona regione, nuclei sono ellitticamente forma (regioni cerchiate) e molte cellule mitotiche si osservano al confine del ventricolo prima di time-lapse imaging (frecce). In una regione male, molto poche cellule in mitosi sono osservati al confine del ventricolo (singola freccia) e nuclei sono rotondi (regioni cerchiate). D) Esempio di una buona fetta osservato con un microscopio a basso ingrandimento prima di vivere imaging. E) Esempi di Syto11 etichettati cellule in diverse fasi della mitosi, come notato F) Montaggio di una regione al confine del ventricolo dove due progenitori neurali passare attraverso le diverse fasi della mitosi, segnato in diversi colori (tempo, hh:. mm). G) Montaggio di una regione evidenziata in (B), dove un progenitore neuronale si divide in lontano dal confine ventricolare. In montaggi (D) e (E), ceLLS sono stati pseudo colorati con Photoshop per evidenziare le diverse fasi mitotiche. (barre Scala: B, C, F: 10 micron; D: 1 mm, E, G: 5 micron).

Figura 4
Figura 4. Esempi di strumenti alternativi per visualizzare mitosi dei progenitori neurali. A) Montaggio di una regione al confine del ventricolo in una fetta cervello da un embrione transgenico istone H2B-EGFP a E13.5. Un progenitore è osservato come si procede attraverso le diverse fasi della mitosi. B) in sequenza di un VZ a E14.5 nella fetta di un cervello che è stato elettroporate a E13.5 con vettori esprimenti EGFP-a-tubulina e H2B-mCherry. EGFP-a-tubulina permette la visualizzazione di dinamica dei microtubuli durante la mitosi (B 1-B 2) C) in sequenza di una regione ventricolare in unn E15.5 cervello da un embrione transgenico Centrin-EGFP che è stato elettroporate a E14.5 con plasmidi esprimenti mCherry-a-tubulina e H2B-EGFP. Centrin-EGFP permette la visualizzazione di centrioli dinamiche durante la mitosi (C 1 e C 2). D) Montaggio di una regione che indichi l'IZ di una fetta cervello E14.5 dove le cellule sono state scarsamente etichettati dalla elettroporazione a E13.5 con un basso concentrazione di un plasmide che esprime Cre e una concentrazione standard di un plasmide esprimente EGFP dopo ricombinazione Cre 28. La cella dividendo in questo montaggio ha la morfologia di un RGosvz con un lungo processo basale (frecce rosa) e nessun processo apicale 9. L'obiettivo utilizzata per l'imaging in tempo reale della (A) e (B) esempi è un obiettivo 60X olio siliconico, olio obiettivo 100X ad esempio (C), e 10X obiettivo aria ad esempio D. La risoluzione temporale utilizzato per l'immagine (A) , (B), (C) e (D) sono esempi 4 min, 4 min, 30 sec, e 5 min, rispettivamente. VZ: ventricolare Zuno, IZ: zona intermedia, RGosvz: zona subventricolare radiale esterna delle cellule gliali-like. (barre Scala: A: 15 micron, B, C, D: 5 micron, C 1, C 2: 2.5 micron) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Il principale vantaggio del protocollo abbiamo descritto è che fornisce una risoluzione temporale dinamica della mitosi di progenitori neurali. In genere, saggi di visualizzare mitosi nel cervello in via di sviluppo vengono eseguite utilizzando immunofluorescenza di sezioni di tessuto fissate. Ma questo approccio fornisce solo un'istantanea di mitosi a un certo punto volta.

Ci sono diversi passaggi che sono più critici per l'imaging mitosi in fettine di cervello: 1) Le fette di cervello dovrebbero rimanere attaccati alla agarosio, per preservare l'integrità delle sezioni del cervello durante il trasferimento e il montaggio. 2) Per la generazione e l'imaging di fette, controllo dei livelli rostro-caudale è importante. Fettine cerebrali caudali sono in genere migliori, perché in queste fette, i processi basali del RGC saranno mantenuti intatti, che è sano per le cellule. 3) Per l'imaging in tempo reale, l'uso di un microscopio confocale filatura disco con un obiettivo 60X è migliore sia per alta risoluzione ed evitare photobleaching di samples, che possono verificarsi con Syto11 colorante. 4) Per l'imaging dal vivo, i parametri temporali di acquisizione sono critici. A seconda dell'apparecchiatura microscopio utilizzato, ripresa temporizzata può essere eseguita vanno da ogni min per ogni 10 min. Maggiore di 10 min è in genere troppo lungo per raggiungere la dinamica ad alta risoluzione della mitosi.

Questo protocollo ha alcune limitazioni. L'esperimento viene eseguito con ex vivo tessuto. È concepibile che osservazioni fatte in fettine cerebrali potrebbero essere diversi in vivo. Quindi, quando si effettua il confronto tra esperimenti effettuati in giorni diversi o utilizzando diversi campioni, i seguenti parametri devono essere mantenuti costanti: uso del rostro-caudale e dorso-laterale simili livelli, i contenuti dei media, l'uso di microscopio e di parametri di acquisizione. Inoltre, fototossicità è possibile con l'imaging a lungo termine. Pertanto esperimenti multipli dovrebbero essere effettuate prima di trarre conclusioni. Inoltre, Syto11 si poteva potenteinfluenzare buona resa eventi mitotici, soprattutto in uno sfondo mutante. Pertanto si raccomanda che quando uno fa conclusioni circa mitosi basato su Syto11, anche confermano i risultati utilizzando saggi indipendenti, come marcatori descritti in Figura 4.

Come descritto nel protocollo, mitosi può essere ripreso dopo aver segnato cromosomi e il citoscheletro in vari modi. Altri coloranti Syto possono essere utilizzati per visualizzare mitosi in altri canali fluorescenti. Invece di utilizzare Syto11 colorazione per visualizzare il DNA, fette possono essere generati da linee transgeniche fluorescenti. Ad esempio, come dimostrato, linee transgeniche istone H2B-EGFP possono essere utilizzati 29. L'uso di istone H2B-EGFP è particolarmente utile e consigliato per confermare il fenotipo osservato con il trattamento Syto11. Inoltre, potrebbe essere utile anche per superare le sfide associate alla photobleaching con Syto11. L'uso di altre linee transgeniche, come centrin-EGFP 30, puòessere usato per visualizzare centrioli, i componenti di centrosomi. Anche se questi da soli non basterebbero per visualizzare mitosi, funzionano bene in combinazione con altri marcatori di cromosomi o microtubuli. Tali marcatori possono essere introdotte da elettroporazione in utero 4,5,10,31,32. Come dimostrato, espressione di proteine ​​di fusione un giorno prima della dissezione può essere utile per questo approccio. Nella nostra esperienza, esprimendo costrutti sotto un promotore CAG può spesso produrre robusta espressione entro un giorno. Per esempio abbiamo introdotto α-tubulina e istone H2B-EGFP in cervelli embrionali usando questo approccio.

Una volta che questa tecnica è padroneggiata ci sono ulteriori modifiche che possono essere fatte per esperimenti futuri. Elettroporazione in utero può anche essere usato per manipolare l'espressione genica. Ad esempio, l'introduzione di shRNA o cDNA può essere utile per determinare l'impatto della perdita-di-funzione o sovra-espressione di un gene di interesse sul prog neuraleenitor mitosi 33. Inoltre, fette possono essere trattati con farmaci chimici o piccole molecole per misurare l'impatto di inibire vie di segnalazione o molecole su mitosi 34,35.

Nella nostra procedura che descriviamo di imaging eseguita utilizzando un confocale disco rotante. Il principale vantaggio di un microscopio confocale disco rotante è la velocità di acquisizione. Ciò consente l'imaging di posizioni multiple di diverse sezioni di cervello in una sessione di imaging in tempo reale con un'alta risoluzione temporale, e una qualità dell'immagine ragionevole. Altre configurazioni come per esempio un microscopio confocale a scansione laser multi-fotone offrono la possibilità di acquisire immagini di alta qualità in profondità nel tessuto, dove le cellule gliali radiali sono meno probabilità di essere tagliato a livello del processo basale. Questo sarà quindi aumentare la probabilità di immagine progenitori neurali sane. Tuttavia, questo è solitamente associato un sacrificio della velocità di acquisizione. Questo a sua volta limiterà il numeromero di posizioni che possono essere esposte durante una sessione di imaging in tempo reale, nonché la risoluzione temporale. Imaging della mitosi può anche essere eseguita su un microscopio a campo ampio. Tuttavia, in questo caso è meglio di immagine cellule scarsamente etichettati, al contrario di istone H2B-EGFP o Syto11, come la luminosità complessiva di questi reagenti renderebbe immagini molto più difficile. Inoltre, il protocollo qui descritto utilizza un microscopio invertito. I principali vantaggi di un microscopio invertito sono la possibilità di utilizzare obiettivi olio ad alta risoluzione e la libertà di movimento quando il microscopio è accoppiato con uno stadio motorizzato. In conclusione, lo sperimentatore deve trovare un equilibrio tra i vantaggi e gli svantaggi di un particolare set-up e lo scopo di un esperimento.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono finanziamento dal NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (sia per DLS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

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References

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Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

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