Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.
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Articolo metodologico
Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex
In questo articolo
Sommario
Abstract
Anche se di breve durata, mitosi è un processo multi-step complesso e dinamico fondamentale per lo sviluppo di organi compreso il cervello. Nella corteccia cerebrale di sviluppo, mitosi anormale di progenitori neurali può causare difetti di dimensioni e funzione cerebrale. Quindi, vi è una necessità critica per strumenti per comprendere i meccanismi di neurale progenitore mitosi. Sviluppo corticale nei roditori è un modello eccezionale per lo studio di questo processo. Progenitrici neurali mitosi è comunemente esaminati nelle sezioni di cervello fissi. Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per l'imaging dal vivo della mitosi in ex vivo fettine di cervello embrionali. Noi descrivere i passaggi critici per questa procedura, che includono: l'estrazione del cervello, l'incorporamento del cervello, vibratome sezionamento di fette di cervello, colorazione e coltura di fette, e time-lapse imaging. Abbiamo poi dimostrare e descrivere in dettaglio come eseguire un'analisi post-acquisizione della mitosi. Includiamo risultati rappresentativi from questo test utilizzando il colorante vitale Syto11, topi transgenici (istone H2B-EGFP e centrin-EGFP), e in utero elettroporazione (mCherry-α-tubulina). Discuteremo di come questa procedura può essere meglio ottimizzato e come può essere modificato per lo studio della regolazione genetica della mitosi. Vivo imaging di mitosi in fettine cerebrali è un approccio flessibile per valutare l'impatto dell'età, anatomia, e perturbazione genetica in un ambiente controllato, e per generare una grande quantità di dati ad alta risoluzione temporale e spaziale. Quindi questo protocollo integrerà gli strumenti esistenti per l'analisi dei neurali progenitrici mitosi.
Introduzione
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere come eseguire l'imaging dal vivo di progenitori neurali mitosi in fettine di cervello embrionali. Utilizzo di immagini dal vivo di fette di cervello nella cultura, questo protocollo fornisce un metodo semplice per saggiare molteplici aspetti della mitosi nei progenitori neurali in un ambiente altamente simile ad un ambiente in vivo. Esso può essere applicato a cervello di animali e / o cervelli mutanti che sono state manipolate con elettroporazione in utero) 1-5. Questa tecnica è ideale anche per testare l'effetto di agenti farmacologici su mitosi precursori neur....
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Protocollo
1. Preparazione dei supporti (figura 1, Punto 1)
- Fetta Cultura Media
- 25 ml di fetta di terreno di coltura è sufficiente per preparare piatti peggiori 5 in vetro con 2 fette per bene.
- In una provetta da 50 ml, aggiungere 250 ml di una soluzione di N2 100x e 500 microlitri di una soluzione 50x B27 senza vitamina A. Aggiungere DMEM/F12 ad un volume di 22,5 ml.
- Filtro sterilizzare soluzione e successivamente aggiungere 1,25 ml di siero di cavallo inattivato calore e 1,25 ml di siero fetale bovino.
- Incubare soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C per tutta la durata della preparazione delle fette.
- Aggiungere f....
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Risultati
Il successo di questo test e l'osservazione di più celle mitotiche durante una sessione di imaging in tempo reale dipendono in gran parte sia l'integrità e livello anatomico della fetta in cui sono fatti acquisizioni. Come discusso in seguito, il livello anatomico di una fetta è un fattore importante. Figura 3A mostra rostro-caudale e medio-laterale località dove abbiamo avuto più successo. Per ulteriori discussioni di questo tema si veda Noctor 26. L'integrità della fetta può var.......
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Discussione
Il principale vantaggio del protocollo abbiamo descritto è che fornisce una risoluzione temporale dinamica della mitosi di progenitori neurali. In genere, saggi di visualizzare mitosi nel cervello in via di sviluppo vengono eseguite utilizzando immunofluorescenza di sezioni di tessuto fissate. Ma questo approccio fornisce solo un'istantanea di mitosi a un certo punto volta.
Ci sono diversi passaggi che sono più critici per l'imaging mitosi in fettine di cervello: 1) Le fette di cerve.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono finanziamento dal NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (sia per DLS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | per terreno di coltura |
| 50X B27 senza vitamina A | Life technologies | 12587010 | per terreno di coltura |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | per terreno di coltura |
| Siero di cavallo inattivato a caldo | Sigma Aldrich | H1138-500ml | per terreno di coltura |
| Siero di vitello inattivato a caldo | Sigma Aldrich | F4135-500ML | per terreno di coltura |
| FGF | R& D Sytems | 3139-FB-025 | per terreno di coltura |
| EGF | per terreno di coltura | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | per la dissezione degli embrioni |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | diluito a 1 M (pH 7,4) |
| 2,5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | per la dissezione degli embrioni |
| 0,9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | per la dissezione degli embrioni |
| Agarosio a basso punto di fusione | Fisher | BP165-25 | per la generazione di fette |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µ l aliquote |
| 3 mg/ml di collagene di tipo I | Life technologies | A1048301 | per la coltura di fette |
| Piatto con fondo in vetro | MatTek | P35G-1.5-14-C | per la coltura di fette |
| Piastre | per la dissezione degli embrioni | ||
| Termometro | per misurare la temperatura dell'agarosio | ||
| Spatola | per cervelli di trasferimento | ||
| Pennello | alternativo ai cervelli di trasferimento | ||
| Vibratomo | Leica | VT1000 | per la generazione di fette Microscopio |
| dissezione | dissezione di embrioni | ||
| Microscopio | È necessario un microscopio confocale, che deve essere dotato di una camera di incubazione |
Riferimenti
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F.
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Ristampe e permessi
