Summary
Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.
Abstract
E 'sempre più evidente che recettori per i neurotrasmettitori, tra cui i recettori ionotropici GABA A (GABAAR), mostre traffico altamente dinamico e la mobilità di superficie delle cellule 1-7. Per studiare recettore cellulare localizzazione superficie e endocitosi, la tecnica qui descritta combina l'uso di fluorescente α-bungarotossina con cellule che esprimono costrutti contenenti un α-bungarotossina (Bgt) sito di legame (BBS). Le BBS (WRYYESSLEPYPD) è basato sulla subunità α del muscolo recettore nicotinico, che si lega con alta affinità Bgt 8,9. Incorporazione del sito BBS consente localizzazione superficie e misure di inserimento recettore o la rimozione con applicazione di fluorescente esogeno Bgt, come precedentemente descritto nel monitoraggio di GABAA e GABAB recettori metabotropici 2,10. Oltre al sito BBS, abbiamo inserito un GFP sensibile al pH (pHGFP 11) tra aminoacidi 4 e 5 del maturo GABAAR subunità da m normastrategie di biologia e clonazione PCR olecular (vedi figura 1) 12. Il BBS è 3 'del reporter GFP sensibile al pH, separati da un 13-amminoacido alanina / prolina linker. Per il traffico di studi descritti in questa pubblicazione che si basano su campioni fissati, il pHGFP serve come reporter del totale tagged GABAAR livelli della proteina subunità, che consente la normalizzazione della Bgt etichettato popolazione di recettori per la popolazione recettore totale. Questo minimizza cella a cella Bgt variabilità segnale colorazione risultante dalla maggiore o minore espressione basale delle subunità GABAAR contrassegnate. Inoltre, il tag pHGFP consente una facile identificazione di cellule che esprimono costrutto per esperimenti di imaging dal vivo o fissi.
Introduction
L'uso di fluorescenza accoppiato α-bungarotossina studiare localizzazione recettore e dinamiche è stato sperimentato in studi del acetilcolina recettore nicotinico 13-15, Obiettivo endogeno di una tossina. Successivamente, l'incorporazione del minimo peptide vincolante Bgt (BBS) è stato utilizzato per studiare il traffico di entrambi i canali ionici ligando-dipendenti eccitatori e inibitori e proteine G recettori accoppiati 2,10,16-21. Questa tecnica basata su BBS offre vantaggi ad altri approcci utilizzati per lo studio di traffico come i metodi biotinilazione superficie, l'etichettatura degli anticorpi di cellule vive con anticorpi verso epitopi extracellulari, e il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP). Durante superficie cellulare biotinilazione ammine libere sono covalentemente modificati, con il potenziale per influenzare l'attività cellulare. Studi basati anticorpo sono stati spesso ostacolati da antigene di superficie di clustering o tappatura, che possono alterare gli eventi di traffico. A causa del passaggio sbiancante per FRAP sTUDI, una preoccupazione importante sta danneggiando la struttura cellulare sottostante. Un ulteriore vantaggio è che BBS etichettato costrutti possono essere utilizzati anche per metodologie biochimiche con traffico biotina-recettore accoppiato bungarotoxin per valutare. Questa tecnica è facilmente applicabile a linee cellulari e cellule primarie. Per l'uso in cellule che esprimono nicotinico per l'acetilcolina (nAChR) recettori, l'antagonista tubocurarina nAChR deve essere utilizzato in tutto il protocollo, come indicato. Esecuzione di etichettatura Bgt semplice superficie (equivalente al punto di tempo T = 0 per il protocollo endocitosi) sulle cellule non trasfettate in assenza di tubocurarina fornirà la prova di endogeno nAChR.
Una considerazione importante per l'utilizzo di questa tecnica è opportuno inserimento del BBS in modo che sia presente in un extracellulari quando la proteina di interesse è trasportato alla membrana plasmatica. Ad esempio, i domini N-terminali delle subunità GABAAR risiedono nel lume vescicolari durante trafla tratta e diventare extracellulare dopo l'inserimento del recettore nella membrana plasmatica, consentendo un'etichettatura specifica di recettori di superficie delle cellule e la valutazione della loro rimozione dalla superficie cellulare da eventi endocitiche. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di GFP, myc, o BBS epitopi a questo dominio di subunità GABAAR è funzionalmente silenzioso. Controlli standard devono essere effettuate per garantire che la proteina marcata è espressa a livelli simili a un costrutto non etichettato, che opportunamente localizzato, e che non influenza la funzione del recettore. Questa caratterizzazione di costrutti trasfettate sarà anche un aiuto per la risoluzione di problemi iperespressione.
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Protocol
Tutti i protocolli descritti di seguito sono in conformità con la IACUC e IRB commissioni di revisione istituzionale dell'Università di Pittsburgh School of Medicine.
1. Preparazione delle Culture neuronale ippocampale in Tissue Culture Hood
Nota: utilizzare una tecnica sterile e reagenti per tutta protocollo 1.
- Preparare poli-D-lisina (0,1 mg / ml in H 2 O) vetrini rivestiti come substrato per la coltura neuronale.
- Mettere 4-5 vetrini tondi all'interno di ogni 3,5 centimetri di tessuto piatto di coltura.
- Spot 70 microlitri poli-D-lisina su ogni vetrino 12 millimetri. Nota: per l'imaging dal vivo, un fondo di vetro da 3,5 cm di tessuto piatto di coltura può essere utilizzato (posto 200 microlitri poli-D-lisina sul incorporato 14 millimetri coprioggetto di vetro).
- Lasciare i piatti preparati nel tessuto della cultura cofano O / N. Per ridurre al minimo poli-D-lisina evaporazione e mantenere le superfici sterili nella cappa coltura tissutale, chiudere il telaio della finestra e spegnere °e soffiante O / N. Nota: luci UV non vengono utilizzati durante l'incubazione O / N.
- La mattina seguente, lavare i piatti 3x con 2 ml di H 2 O.
- Dopo aver rimosso l'ultimo H 2 O lavaggio, aggiungere 2 ml di media per ogni piatto 3,5 centimetri e lasciare i piatti in incubatrice fino al momento piastra neuroni nella fase 1.4.
- Neuroni dell'ippocampo sono preparati dal giorno embrionale 18-19 (E18-19) ratti (modificati dalla Goslin 22).
- Transfettare neuroni appena dissociati il giorno della coltura con 1-4 mg di maxiprepped DNA costrutto.
Nota: tipicamente 3 pg di DNA viene transfettato in 1-2 milioni di neuroni, con una vitalità del 50% ed una efficienza di trasfezione del 60% (ad esempio partendo con 2 milioni di neuroni: ((2 x 10 6 neuroni x 0.5) 0.6) fornisce circa 1 milione di neuroni,.. 600.000 dei quali sono transfettate 1 diverse quantità di costrutto di DNA possono essere trasfettate durante la risoluzione dei potenziali problemi disovra-espressione, seguita da un'opportuna caratterizzazione della localizzazione e della funzione costrutto. - Piatto i neuroni trasfettati sui vetrini rivestiti di poli-D-lisina con una densità finale di circa 200.000 neuroni per 3,5 centimetri piatto. Nota: per un fondo di vetro piatto, piatto 40,000-50,000 neuroni sulla superficie vetrata 14 millimetri.
- Sostituire i media 4-24 ore dopo la preparazione di colture neuronali, poi permettono ai neuroni di svilupparsi in incubatrice fino a 14-17 giorni in vitro (DIV) o stadio desiderato.
2. Endocitosi Assay
ATTENZIONE: Nota sulla α-bungarotossina e dei rifiuti e la gestione tubocurarine:
- Manipolazione di tutte le neurotossine peptide è raccomandato entro le linee guida di protocolli di ricerca Biosafety Level-2 (BL-2). Tutti corretta attrezzatura di protezione personale devono essere indossati. Polveri tossina liofilizzato deve essere ricostituito secondo le istruzioni del produttore. Tossina shou rifiutild essere smaltita in conformità con le linee guida dell'ente in materia di salute ambientale e sicurezza sul lavoro.
- Per rimuovere eventuali aggregati peptidici che possono formarsi durante la conservazione, aliquote α-bungarotossina devono essere centrifugati brevemente prima dell'uso, e il supernatante dovrebbero essere utilizzati per l'esperimento.
- α-bungarotossina (Bgt) stock sono risospese ad una concentrazione di 1 mg / ml in H 2 O sterile e memorizzati in 10 microlitri aliquote a -20 ° C. Scorte Bgt fluorescente accoppiati vengono utilizzati a 3 mg / ml. Tubocurarina viene utilizzato ad una concentrazione finale di 150 mM.
- Set banco di blocco riscaldatore superiore a 16 ° C in camera fredda con sottile in alluminio o lamiera di acciaio inox sulla parte superiore. In alternativa, se disponibile, un dispositivo top di raffreddamento / riscaldamento banco può essere utilizzato per ogni passo richiede 16 ° C.
- Raffreddare extracellulare saline Hepes tamponata (HBS contenenti in mm: 135 NaCl, 4.7 KCl, 10 HEPES, 11 glucosio, 1.2 MgCl 2, e 2,5CaCl 2, pH 7,4) a 16 ° C in un bagno d'acqua.
- Trasferimento piatti neurone a lastra di alluminio a 16 ° C e raffreddare per 5 min.
- Rimuovere i supporti (mantenere mezzi condizionati e riserva in incubatrice per il passaggio 2.8, endocitosi punti di tempo saggio) e sostituirlo con 1 ml di 16 ° C HBS + tubocurarina (150 micron) per 2 minuti.
- Rimuovere HBS + tubocurarine di contenitore per rifiuti etichettati e sostituirlo con 1 ml di 16 ° C HBS + tubocurarina (150 micron) + α-bungarotossina Alexa 594 [3 mg / ml], incubando a 16 ° C per 15 min.
- Rimuovere HBS + tubocurarina + α-bungarotossina Alexa 594 per etichettato contenitore di rifiuti e lavare piatti 3x con 2 ml di 16 ° C HBS (i lavaggi possono essere raccolti tramite aspirazione in una beuta da vuoto contenente 50 ml di 50% candeggina).
- Per gli esperimenti di serie temporali di immagini dal vivo seguenti endocitosi con un fondo di vetro 3,5 centimetri piatto di coltura, eseguire i passaggi 2,1-2,6, quindi trasferire il piatto al palco riscaldato(Dispositivo di Peltier) sul microscopio, e iniziare imaging con una confocale o setup microscopio TIRF.
- Trasferimento T coprioggetto = 0 punto temporale in un piatto di RT paraformaldeide 4% / 4% di saccarosio per 20 minuti, continuando con altri coprioggetto al punto 2.9.
- Per gli altri punti temporali, sostituire HBS con condizionata equilibravano 37 ° C supporti (riservato nel passo 2.4) e tornare a incubatore per endocitosi a 37 ° C. Nota: suggerito punti aggiuntivi per il tempo di T = 15, 30, e 60.
- A intervalli di tempo necessario, prendere piatti da incubatrice, lavare rapidamente due volte con 2 ml di RT DPBS (DPBS senza calcio, magnesio), quindi fissare in paraformaldeide al 4% / 4% di saccarosio per 20 min.
- Dopo 20 minuti la fissazione, rimuovere paraformaldeide al 4% / 4% di saccarosio sprecare contenitore e lavare i piatti due volte con 2 ml di RT DPBS.
- Incubare coprioggetti a temperatura ambiente per 10 min in soluzione di blocco immunofluorescenza (soluzione blocco = siero di cavallo 5%, 0,5% BSA in DPBS) contenente 0,2% Triton X-100 di permeabilitàizzare i neuroni e abilitare immunostaining anti-GFP della piscina recettore intracellulare e / o l'etichettatura di altre proteine di interesse.
- Rimuovere blocco + 0,2% Triton X-100 e incubare coprioggetto in soluzione blocco immunofluorescenza senza Triton X-100 per 20-30 min.
- Eseguire incubazioni anticorpi primari di vetrini in blocco per diverse ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Nota: l'incubazione dei vetrini con primarie a 4 ° CO / N produce abitualmente risultati migliori immunofluorescenza.
- Lavare coprioggetto 3x con DPBS (5 min per ogni fase di lavaggio).
- Incubare coprioggetto con anticorpi secondari in soluzione blocco per 1 ora a RT.
- Lavare coprioggetto 3x con DPBS (5 min per ogni fase di lavaggio).
- Coprioggetti Mount, la manipolazione ogni vetrino singolarmente: rimuovere il liquido in eccesso dal retro del vetrino con il tessuto di laboratorio, quindi capovolgere coprioggetto su 4 ml di mezzo di montaggio su un vetrino.
- Consenti vetrini ad asciugare a temperatura ambiente coperto per 30 minuti poi vminerale a 4 ° C fino al momento dell'esecuzione microscopia.
- Acquisizione delle immagini e l'analisi di sperimentare con la microscopia confocale (ciechi a condizione sperimentale). 60X olio NA 1.49 obiettivo ad immersione con i seguenti laser: gas Argon 488 nm, 561 diodo, diodo 640.
- Utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione dell'immagine, acquisire immagini singole sezioni Z con il corpo cellulare neuronale e diversi processi dendritiche a fuoco.
- Quantificare α-bungarotossina segnale fluorescente Alexa e GFP immunostaining lungo 20 micron di 3-4 dendriti prossimali per neurone, utilizzando la stessa soglia per l'analisi di tutti i dati endocitosi.
- Analizzare i dati 10-12 neuroni per ogni punto temporale, ripetendo l'esperimento con diverse colture neuronali indipendenti.
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Representative Results
Caratterizzazione di un costrutto BBS targhetta include controlli importanti come determinare se la proteina espressa assembla correttamente (in particolare con i recettori composti da più subunità), traffici alla superficie cellulare e localizza appropriato. Sinapsi inibitorie sono composti da GABA A cluster di superficie recettore che colocalizza con l'inibitoria della proteina scaffold gephyrin e sono apposto ai terminali presinaptici inibitori, individuati dal vescicolare inibitorio trasportatore di aminoacidi che carica GABA e glicina in vescicole sinaptiche (VIAAT / VGAT). In figura 2 sono α2pHGFP + BBS esprimendo neuroni con GABAAR superficie marcato con Bgt, seguita da immunocolorazione per popolazione totale recettore con anticorpo anti-GFP e sia il postsinaptico inibitorio proteina scaffold gephyrin (Figura 2A) o VIAAT (Figura 2B).
La Figura 3 mostra la endocitosi di α2 contenente GABAAR in neuroni dell'ippocampo a 15 DIV. BGT misure di fluorescenza dei singoli processi dendritiche come mostrato nei pannelli (Figura 3A) sono normalizzati al livello di espressione costrutto tramite la colorazione anticorpale GFP. Confronto finale di punti temporali fatta dal normalizzazione della misura T = 0, come illustrato nella Figura 3B. Quantificazione di internalizzazione dei recettori nel corso di un periodo di 60 min (Figura 3B) da variazioni del segnale di fluorescenza nel tempo (media ± SEM: T0 = 100 ± 7.2, T15 = 74.7 ± 12.9, T30 = 44.7 ± 5.6, e T60 = 19.1 ± 3.4 min ) è meglio descritta da un singolo esponenziale (a 37 ° C: t 1/2 = 26 ± 4,8 min).
Un approccio alternativo, mostrato in figura 4, è di seguire endocitosi in un singolo neurone vivo imaging time-lapse microscopia confocale. La puntata e fluorescenza sovrapposizione di pHGFP superficie tagged GABAAR e Bgt l recettori abeled è visibile all'inizio dell'esperimento (T0). Nel corso del tempo, Bgt etichettato segnale AR GABA diminuisce, come recettori fagocitare, mentre il segnale pHGFP rimane alto grazie al nuovo inserimento recettore. La diminuzione minima del segnale phGFP è dovuto a cambiamenti della superficie cellulare di distribuzione dei recettori e photobleaching.
Figura 1. Schema di un BBS e pHGFP etichettato GABAAR subunità e il saggio endocitosi. Endocitosi viene misurata applicando prima una bungarotoxin fluorescente a neuroni o cellule, seguito da un breve lavaggio per rimuovere tossina non legato, poi la perdita di fluorescenza viene monitorata come recettori sono interiorizzato.
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Figura 2. Confocale di BBS e pHGFP tagged GABAAR mostra la localizzazione del caso, con i componenti sinaptiche inibitorie. Superficiale GABAAR in α2pHGFP + BBS esprimere i neuroni sono stati etichettati con α-bungarotossina Alexa 594 (rosso), seguito da immunostaining, allargamenti dendriti sono visualizzati a destra di ogni neurone. Pannello uniti (α-bungarotossina Alexa 594 in rosso, in verde GFP, gephyrin o VIAAT in blu). Superficie Bgt etichettato GABAAR spettacolo colocalizzazione con A) l'inibitoria impalcatura proteica gephyrin e B) apposizione post-sinaptica al marcatore VIAAT presinaptica. (Bar Scala, 10 micron).
Figura 3. Confocale di GABAAR endocitosi in 15 DIV neuroni ippocampali. A) B) Il grafico rappresenta il GABAAR superficie α-bungarotossina Alexa 594 perdita di fluorescenza nel tempo con endocitosi (normalizzata a T = 0) (10-12 neuroni per punto temporale, 4 processi analizzati ogni neurone; barre di errore rappresentano media ± SEM).
Figura 4. Vivi confocale di GABAAR endocitosi in 15 DIV neuroni dell'ippocampo. A) B3pHGFP + BBS contenenti GABAAR superficie in neuroni erano live-marcato con α-bungarotossina Alexa 594 (rosso), seguita dalla rimozione di breve non legato α-bungarotossina Alexa 594 mediante lavaggio. I neuroni sono stati ripresi tramite microscopia confocale a 37 ° C in HBS per 20 min a un intervallo di 1 min (Barre di scala, 10 micron). GABAARs bgt etichetta sono stati localizzati alla superficie cellulare a T0, visto da colocalizzazione con il segnale pHGFP a T0. Nel corso del tempo, Bgt etichettato segnale AR GABA diminuisce, come recettori fagocitare, nuovo pHGFP esprimono i recettori vengono continuamente inseriti, in modo che il segnale pHGFP rimane quasi costante.
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Discussion
Le tecniche fisse e live basati BBS qui descritti possono essere utilizzati per monitorare recettore o altra membrana plasmatica traffico di proteine in linee cellulari, neuroni e altre cellule primarie. Questo metodo è stato usato con successo per studiare l'inserimento e la rimozione della membrana dei canali ionici ligando-dipendenti e GPCR e valutare variazioni di traffico per la presenza di agonisti dei recettori e modulatori. Gli aspetti chiave includono la localizzazione appropriata del tag in una posizione extracellulare e l'esecuzione di controlli per garantire che l'aggiunta del BBS (di serie per altri giornalisti, come GFP) è funzionalmente silenzio. Per l'uso in cellule che esprimono nicotinico per l'acetilcolina (nAChR) recettori, l'antagonista tubocurarina nAChR deve essere utilizzato in tutto il protocollo, come indicato. Nel caso in cui non viene utilizzato il tag GFP supplementare, totale BBS etichettato livello proteina può essere determinata mediante colorazione con un ulteriore α-bungarotossina accoppiato ad un altro fluoroforo dopo fissazione e permeabilizzione. Scelta dei punti di tempo per misurare i tassi di endocitosi del recettore / proteina di interesse richiede di valutare le attuali conoscenze della tratta per il recettore / proteina, combinato con l'uso iniziale di più punti di tempo. Questa tecnica può anche essere facilmente impiegato con immunocolorazione convenzionale. Abbiamo anche descrivono un approccio alternativo per endocitosi inseguimento via esperimenti di imaging confocale dal vivo. Disponibilità di attrezzature, requisiti di tempo per esperimenti dal vivo, e altri vincoli sperimentali guideranno scelta del metodo, entrambe le tecniche praticabili e di essere pubblicati. Le future applicazioni delle tecniche BBS includono imaging dal vivo o fisso in combinazione con endosomali e lisosomiali marcatori di seguire il destino dei recettori, cioè mira al riciclaggio endosomi e riconsegna alla membrana plasmatica o la degradazione via lisosomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il sostegno è stato fornito da avvio-fondi del Dipartimento di Biologia Farmacologia e Chimica presso l'Università di Pittsburgh School of Medicine. Riconoscimento dei membri del laboratorio Giacobbe che hanno contribuito alla presentazione del video: Nicholas Graff.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| Mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
| Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
References
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