Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.
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Articolo metodologico
L'utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico
In questo articolo
Sommario
Abstract
E 'sempre più evidente che recettori per i neurotrasmettitori, tra cui i recettori ionotropici GABA A (GABAAR), mostre traffico altamente dinamico e la mobilità di superficie delle cellule 1-7. Per studiare recettore cellulare localizzazione superficie e endocitosi, la tecnica qui descritta combina l'uso di fluorescente α-bungarotossina con cellule che esprimono costrutti contenenti un α-bungarotossina (Bgt) sito di legame (BBS). Le BBS (WRYYESSLEPYPD) è basato sulla subunità α del muscolo recettore nicotinico, che si lega con alta affinità Bgt 8,9. Incorporazione del sito BBS consente localizzazione superficie e misure di inserimento recettore o la rimozione con applicazione di fluorescente esogeno Bgt, come precedentemente descritto nel monitoraggio di GABAA e GABAB recettori metabotropici 2,10. Oltre al sito BBS, abbiamo inserito un GFP sensibile al pH (pHGFP 11) tra aminoacidi 4 e 5 del maturo GABAAR subunità da m normastrategie di biologia e clonazione PCR olecular (vedi figura 1) 12. Il BBS è 3 'del reporter GFP sensibile al pH, separati da un 13-amminoacido alanina / prolina linker. Per il traffico di studi descritti in questa pubblicazione che si basano su campioni fissati, il pHGFP serve come reporter del totale tagged GABAAR livelli della proteina subunità, che consente la normalizzazione della Bgt etichettato popolazione di recettori per la popolazione recettore totale. Questo minimizza cella a cella Bgt variabilità segnale colorazione risultante dalla maggiore o minore espressione basale delle subunità GABAAR contrassegnate. Inoltre, il tag pHGFP consente una facile identificazione di cellule che esprimono costrutto per esperimenti di imaging dal vivo o fissi.
Introduzione
L'uso di fluorescenza accoppiato α-bungarotossina studiare localizzazione recettore e dinamiche è stato sperimentato in studi del acetilcolina recettore nicotinico 13-15, Obiettivo endogeno di una tossina. Successivamente, l'incorporazione del minimo peptide vincolante Bgt (BBS) è stato utilizzato per studiare il traffico di entrambi i canali ionici ligando-dipendenti eccitatori e inibitori e proteine G recettori accoppiati 2,10,16-21. Questa tecnica basata su BBS offre vantaggi ad altri approcci utilizzati per lo studio di traffico come i metodi biotinilazione superficie, l'etichettatura degli anticorpi di cellule vive con anticor....
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Protocollo
Tutti i protocolli descritti di seguito sono in conformità con la IACUC e IRB commissioni di revisione istituzionale dell'Università di Pittsburgh School of Medicine.
1. Preparazione delle Culture neuronale ippocampale in Tissue Culture Hood
Nota: utilizzare una tecnica sterile e reagenti per tutta protocollo 1.
- Preparare poli-D-lisina (0,1 mg / ml in H 2 O) vetrini rivestiti come substrato per la coltura neuronale.
- Mettere 4-5 vetrini tondi all'interno di ogni 3,5 centimetri di tessuto piatto di coltura.
- Spot 70 microlitri poli-D-lisina su ogni vetrino 12 millimetri. Nota: per l....
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Risultati
Caratterizzazione di un costrutto BBS targhetta include controlli importanti come determinare se la proteina espressa assembla correttamente (in particolare con i recettori composti da più subunità), traffici alla superficie cellulare e localizza appropriato. Sinapsi inibitorie sono composti da GABA A cluster di superficie recettore che colocalizza con l'inibitoria della proteina scaffold gephyrin e sono apposto ai terminali presinaptici inibitori, individuati dal vescicolare inibitorio trasportatore di aminoacidi c.......
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Discussione
Le tecniche fisse e live basati BBS qui descritti possono essere utilizzati per monitorare recettore o altra membrana plasmatica traffico di proteine in linee cellulari, neuroni e altre cellule primarie. Questo metodo è stato usato con successo per studiare l'inserimento e la rimozione della membrana dei canali ionici ligando-dipendenti e GPCR e valutare variazioni di traffico per la presenza di agonisti dei recettori e modulatori. Gli aspetti chiave includono la localizzazione appropriata del tag in una posizione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il sostegno è stato fornito da avvio-fondi del Dipartimento di Biologia Farmacologia e Chimica presso l'Università di Pittsburgh School of Medicine. Riconoscimento dei membri del laboratorio Giacobbe che hanno contribuito alla presentazione del video: Nicholas Graff.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit P3 Cella Primaria 4D | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-Bungarotossina, Alexa Fluor 647 | sonde molecolari | B35450 | |
| α-Bungarotossina, Alexa Fluor 488 sonde | molecolari | B13422 | |
| α-Bungarotossina, Alexa Fluor 594 sonde | molecolari | coniugate B13423 | |
| (+)-Cloruro di tubocurarina | Tocris | 2820 | |
| Supporto di montaggio | DAKO | cS703 | |
| DPBS senza calcio, magnesio | Invitrogen | 14190-136 | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P6407 | |
| Anticorpo Gephyrin | Synaptic Systems | 147 011 | :300 |
| Anticorpo VIAAT/VGAT | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1.000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2.000 |
| Piatto per coltura tissutale con fondo in vetro | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
| Vetrini coprioggetti (vetro di copertura rotondo), spessore #1, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
Riferimenti
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. E....
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Ristampe e permessi
