Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

Resumen

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Resumen

Se describe el uso de la interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones inhibidoras de ε subunidad con el complejo catalítico de Escherichia coli ATP sintasa. Bacteriana de tipo F ATP sintasa es el objetivo de un nuevo antibiótico, aprobado por la FDA para combatir la tuberculosis resistente a los medicamentos. La comprensión de bacterias específicas auto-inhibición de la ATP sintasa por el dominio C-terminal de la subunidad ε podría proporcionar un nuevo medio para orientar la enzima para el descubrimiento de fármacos antibacterianos. El dominio C-terminal de ε sufre un cambio conformacional dramática cuando las transiciones de la enzima entre los estados activos e inactivos, y ligandos de sitio catalítico pueden influir en cuál de conformaciones de ε es predominante. El ensayo mide la cinética de unión / disociación de ε con el complejo catalítico, e indirectamente meaSures el cambio de ε unido a la enzima hacia y desde la conformación inhibidor aparentemente nondissociable. La señal de interferometría Bio-capa no es excesivamente sensible a la composición de la solución, por lo que también se puede utilizar para vigilar los efectos alostéricos de ligandos de sitio catalítico sobre los cambios conformacionales de ε.

Introducción

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación ^1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada ^1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el s....

Protocolo

1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI

Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione "Experimento Nueva Cinética" en la ficha Asistente Experimento. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que se deben definir.

1.1. Placa Definición

Resultados

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de unión agregó. Un s.......

Discusión

Instrumentos disponibles en la actualidad para BLI permiten el rendimiento y una flexibilidad significativa en los ensayos para las interacciones biomoleculares. Varias muestras de solución se dispensan en los pocillos de una placa de microtitulación de negro, y un conjunto de sensores de BLI paralelas están programadas para moverse adelante y atrás entre las columnas de pozos en la placa. Las muestras se agitan por agitación orbital durante todo el ensayo. El sistema utilizado aquí tiene 8 sensores y utiliza una placa .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Octeto-RED96	Pall/Forté Bio	30-5048
Albúmina sérica bovina	Sigma	A6003-10G	Biosensor libre de ácidos
grasos/Estreptavidina	Pall/Forté Bio	18-5019	Bandeja de 96 sensores
Placa de microtitulación	Greiner Bio-one	655209	Black, Polipropileno
Software de adquisición de datos	Pall/Forté Bio	Versión 6.4	Versiones más recientes disponibles
Software de análisis de datos	Pall/Forté Bio	Versión 6.4	Versiones más nuevas disponibles