Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.
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Artigo de método
Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula
Neste artigo
Resumo
Resumo
Realizações microfluídicos da câmara Campenot têm atraído grande interesse da comunidade da neurociência. Estas plataformas de co-cultura interligados pode ser usado para investigar uma variedade de questões, abrangendo desenvolvimento neurobiologia e funcional para a infecção e propagação da doença. No entanto, os sistemas convencionais requerem entradas significativas celulares (muitos milhares por compartimento), inadequados para o estudo de células de baixa abundância, como nigra primário dopaminérgico substantia, gânglios espiral, e os neurônios melanogaster Drosophilia e impraticável para a experimentação de alto rendimento. As culturas densas são também altamente enredada localmente, com algumas excrescências (<10%) que interligam as duas culturas. Neste trabalho protocolos microfluídicos e padronização simples são descritos que enfrentar esses desafios: (i) um neurônio único microfluídicos método arraying, e (ii) um método de mascaramento de água para revestimentos de biomateriais padronização de plasma para register neurônios e promover crescimento entre os compartimentos. Minimalista neuronais co-culturas foram preparadas com de alto nível (> 85%) conectividade intercompartimental e pode ser usado para experimentos neurobiologia alto rendimento com precisão uma única célula.
Introdução
Tecido neuronal é altamente complexa; uma mistura heterogênea de celular que é espacialmente ordenados dentro camadas e compartimentos definidos e com conectividade de plástico através de contatos celulares e especialmente via axônio e dendrito excrescências. Novas técnicas são necessárias para conferir maior liberdade experimental para obter insights mais profundos e mecanismos centrais desvendar a doença, o desenvolvimento ea função saudável. A câmara Campenot 1,2 e, mais recentemente, microfabricados concretizações 3,4 pode ser usado para a preparação ex vivo de rede neuronal co-culturas com a capacidade de perturbar selectivam....
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Protocolo
Os protocolos são destinados para os neurocientistas, e estão resumidos na Figura 2. Como tal, é recomendável que microfabricação dos SU-8 mestres usados para replicação PDMS é terceirizada para instalações comerciais ou institucionais. Os dois projetos de máscara de camada estão disponíveis gratuitamente como informação suplementar (CEP) na Royal Society of Chemistry website 12. Importante, a primeira camada de SU-8 deve ser fabricado, a uma profundidade de 2,5-3,0 um, e a segunda a uma profundidade de 25-30 m. Estas são dimensões fundamentais necessários para arraying neurônio eficaz. O limite de altura de 3 mícron é também necessário ....
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Resultados
Exploits mascaramento Água tensão superficial. A tolerância de pressão na interface ar-líquido escalas inversamente com o raio de curvatura [ 
, Produzindo as interfaces altamente estáveis em dimensões de microfluidos. Os micropillars efetivamente ancorar a máscara de água no local. Formação máscara água é conduzida através de evaporação a partir das portas de microfluidos, com a taxa de aumento de aquecimento. Usando o calor de baixa .......
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Discussão
A técnica arraying microfluídica é o primeiro de seu tipo, que permite a manipulação de precisão único neurônio para o estabelecimento de culturas minimalistas. Juntamente com o método in situ padronização biomaterial, uma abordagem poderosa para alinhar os padrões celulares com estruturas microfluídicos, estas culturas minimalistas têm níveis de conectividade de alta intercompartimental com reduzida emaranhamento local. Estas características podem ser utilizadas para o estudo de eficiência de transmissão entre.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores são gratos a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricação e Maria Becker (ISAS) para SEM imagem. A pesquisa foi financiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), um Bundesministerium für Bildung und Forschung concessão (BMBF 0101-31P6541) e pelo Ministerium für Inovação, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf graças a Escola Internacional de Leibniz "Biologia de Sistemas Lab-on-a-Chip" de apoio financeiro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Lamínulas | VWR | 630-1590 | 130-160 mm de espessura |
| 3 mm punções de biópsia | Kai Medical | Lidar com cuidado - | |
| tubulação Tygon | Fisher Scientific | S-50-HL | 1,65 mm de diâmetro; 3,35 mm OD |
| Seringa de 1 ml ( Inkjekt e Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| Conector de tubulação de 4 vias | VWR ou Fisher Scientific | ||
| Regulador de fluxo | Harvard Apparatus | 722645 | |
| pinos de 0,5 mm | Departamentos | ||
| de costura PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | A estabilidade no armazenamento pode ser um problema |
| poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polilisina-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| Poliornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Microscópio fluorescente invertido | |||
| Exemplo de bomba de aspiração | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Dispositivo portátil de descarga corona | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | Pode não estar em conformidade com as normas de segurança do seu país |
| Forno de plasma Femto | Diener Dessecador ou | ||
Referências
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of....
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Reimpressões e permissões
