تتوفر العديد من الطرق لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا ولكن القليل جدا منها يسمح بالقياس المتزامن لدرجة الحموضة السيتوبلازمية والعضوية. هنا ، نصف بالتفصيل منهجية سريعة ودقيقة لقياس الأس الهيدروجيني السيتوبلازمي والحويصلي في وقت واحد عن طريق التصوير النسبي للخلايا الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم تنظيم الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا بإحكام وتم الإبلاغ عن اختلافات في الأس الهيدروجيني بين السيتوبلازم والعضيات1. يعد تنظيم درجة الحموضة الخلوية أمرا بالغ الأهمية للتحكم في التماثل في العمليات الفسيولوجية التي تشمل: تخليق البروتين والحمض النووي الريبي والاتجار الحويصلي ونمو الخلايا وانقسام الخلايا. يمكن أن تؤدي التغيرات في توازن الأس الهيدروجيني الخلوي إلى تغيرات وظيفية ضارة وتعزز تطور الأمراض المختلفة2. تتوفر طرق مختلفة لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا ولكن القليل جدا منها يسمح بقياس الأس الهيدروجيني في السيتوبلازم وفي العضيات. هنا ، نصف بالتفصيل طريقة سريعة ودقيقة للقياس المتزامن لدرجة الحموضة السيتوبلازمية والعضوية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر على الخلايا الحية3. يتم تحقيق هذا الهدف باستخدام أصباغ نسبية متشعرة بدرجة الحموضة تمتلك تقسيما انتقائيا للحجرة الخلوية. على سبيل المثال ، يتم تقسيم SNARF-1 داخل السيتوبلازم بينما يتم تقسيم HPTS داخل العضيات الداخلية / الليزوزومية. على الرغم من أن HPTS يستخدم بشكل شائع كمؤشر للأس الهيدروجيني السيتوبلازمي ، إلا أن هذه الصبغة يمكنها تسمية الحويصلات على وجه التحديد على طول المسار الاحتجازي الداخلي بعد تناولها بواسطة كثرة الخلاياالصنوبرية 3،4. باستخدام مجسات استشعار الأس الهيدروجيني هذه ، من الممكن قياس الأس الهيدروجيني في وقت واحد داخل المقصورات الداخلية والسيتوبلازمية. يختلف الطول الموجي الأمثل للإثارة ل HPTS اعتمادا على الرقم الهيدروجيني بينما بالنسبة ل SNARF-1 ، فإن الطول الموجي الأمثل للانبعاث هو الذي يختلف. بعد التحميل باستخدام SNARF-1 و HPTS ، يتم زراعة الخلايا في محاليل مختلفة معايرة الأس الهيدروجيني لإنشاء منحنى قياسي للأس الهيدروجيني لكل مسبار. يسمح التصوير الخلوي عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بالقضاء على القطع الأثرية وضوضاء الخلفية. نظرا للخصائص الطيفية ل HPTS ، فإن هذا المسبار مناسب بشكل أفضل لقياس الحيز الداخلي الحمضي المعتدل أو لإثبات قلوية العضيات الداخلية / الليزوزومية. تعمل هذه الطريقة على تبسيط تحليل البيانات ، وتحسين دقة قياسات الأس الهيدروجيني ويمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة الأساسية المتعلقة بتعديل الأس الهيدروجيني أثناء استجابات الخلية للتحديات الخارجية.
البروتوكول
1. إعداد حلول لالخلوية درجة الحموضة المعايرة
- إضافة مركبات التالية لخمسة أنابيب 50 مل المخروطية منفصلة لإعداد 5 حلول لاستخدامها في معايرة:
- كلوريد الصوديوم (1 مل من كلوريد الصوديوم M 1) (1 M كلوريد الصوديوم = 0.58 غ في 10 مل H 2 0)
- بوكل (6.75 مل من 1 M بوكل) (1 M بوكل = 0.75 غ في 10 مل H 2 0)
- الجلوكوز (1 مل من 1 M D-جلوكوز)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقياس درجة الحموضة في وقت واحد في كل من داخل الخلايا والمقصورات الخلية endosomal / الليزوزومية، استخدمت الفلورسنت تحقيقات الحموضة الاستشعار ratiometric SNARF-1 وHPTS. SNARF-1 يقتصر على مقصورة عصاري خلوي في حين يسمح HPTS قياس درجة الحموضة ratiometric من المقصورة endosomal / الليزوزومية. تحميل الخلية مع HPTS لمدة 16 ساعة يسمح توطين انتقائية في الإندوسومات / 4 الجسيمات الحالة. ويرد مثال نموذجي من مضان سجلت من الخلايا HT 1080 محملة تحقيقات الحموضة الاستشعار عن بعد في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك حاجة إلى قياس درجة الحموضة الكمي في مجال التصوير الخلية الحية من مقصورات الخلوية المختلفة لقياس درجة الحموضة بدقة الاختلافات في استجابات الخلايا إلى التحديات الخارجية. ومع ذلك، واحدة من العقبات الرئيسية التي لا يزال هو بسهولة وتحديدا استهداف مقصورات الخلوية. في هذا الصدد، أبرزت عدد قليل من الدراسات استخدام HPTS كمؤشر درجة الحموضة داخل الخلايا التي أدخلت الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي أو حقن مكروي 8-10. هذه التقنيات تعاني من عيوب خطيرة، وهي تسبب أضرارا واسعة النط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور جيل دوبوي على القراءة النقدية للمخطوطة.
التمويل
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية ، المنحة # MOP-126173. C.M.D عضو في مركز البحوث في البحوث والثقافة (FRSQ) الممول من مركز البحوث في المدرسة الثانوية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حلول للمعايرة | |||
| كلوريد الصوديوم | فيشر | L-11621 | |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر | M-12445 | |
| D-جلوكوز (سكر العنب) | فيشر | D16-1 | |
| كبريتات المغنيسيوم | فيشر | M65-500 | |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H3375 | |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | فيشر | M-1612 | |
| ماء منزوع الأيونات | N / A | N / A | |
| NIGERICIN | CALBIOCHEM | 481990 | سام عن طريق الاستنشاق أو ملامسة للجلد |
| ثقافة C فارغة ؛ 35 مم | BD Biosciences | 354456 | |
| مجسات | |||
| 8-هيدروكسي بيرين -1،3،6-حمض تريسلفونيك (HPTS) | تقنيات الحياة | H-348 | الابتعاد عن الضوء في درجة حرارة الغرفة |
| 5- (و -6) - Carboxy SNARF & reg ؛ -1 ، Acetoxymethyl Ester ، تقنيات Acetate | Life | C-1271 | الابتعاد عن الضوء والرطوبة عند -20 درجة ؛ سي |
| ثنائي ميثيل سوفوكسيد (DMSO) | فيشر | BP231-1 ؛ | مضر |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 100X | |||
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر | M-12445 | 20 جم |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | فيشر | S369-1 | 115 جم |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | جي تي بيكر | 3246-01 | 20 جم |
| ماء منزوع الأيونات | غير | أحضر إلى 1 لتر | |
| الأوتوكلاف واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 | |||
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N / A | N / A | 50 مل |
| كلوريد الصوديوم | فيشر | L-11621 | 40.5 جم |
| ماء منزوع السماد | N / A | N / A | أحضر إلى 5 لتر |
| معدلات | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5- (N-إيثيل-N-isopropyl) أميلوريد (EIPA) | سيجما ألدريتش | A3085 | |
| كلوريد الأمونيوم | فيشر | A649-500 |
المراجع
- Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
- Hinton, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
