Summary
We beschrijven een techniek voor de analyse van globale RNA synthese in hypoxie met beeldvorming. Instructies-chemische kenmerken van RNA niet eerder is uitgevoerd onder hypoxie en maakt visualisatie van globale RNA veranderingen op enkele cel. Deze aanpak vormt een aanvulling op de bestaande gemiddelde RNA-technieken, waardoor directe visualisatie van cel-naar-cel veranderingen in de wereldwijde RNA synthese.
Abstract
Hypoxie of verlaging van de beschikbaarheid van zuurstof is betrokken bij vele fysiologische en pathologische processen. Op moleculair niveau, cellen initiëren een bepaald transcriptieprogramma om een passende en gecoördineerde cellulaire respons te monteren. De cel bezit verscheidene zuurstofsensor enzymen die moleculaire zuurstof als cofactor nodig voor hun activiteit. Deze variëren van prolyl-hydroxylases te histondemethylases. De meeste studies die cellulaire responsen op hypoxie zijn gebaseerd op celpopulaties en gemiddelde studies en als zodanig single cell analyse van hypoxische cellen zelden uitgevoerd. Hier beschrijven we een analysemethode voor wereldwijde RNA-synthese bij de enkele cel niveau hypoxie door Click-iT RNA beeldverwerkingskits per zuurstof gecontroleerde werkstation, gevolgd door microscopie analyse en kwantificering. Met kankercellen blootgesteld aan hypoxie gedurende een langere tijd wordt RNA gelabeld en gemeten in elke cel. Deze analyse maaktde visualisatie van temporele en cel-cel veranderingen in de wereldwijde RNA-synthese na hypoxische stress.
Introduction
Hypoxie (laag zuurstofspanningen) treedt op wanneer de normale zuurstoftoevoer naar een weefsel wordt verstoord. Milieu zuurstof is zowel een nutriënt en een signalerende molecule, die belangrijke signalen voor vele celtypen. Veranderingen in het milieu zuurstof worden waargenomen door een groep dioxygenases die de activiteit van een essentiële transcriptiefactor familie bekend als de Hypoxie-induceerbare factor (HIFs) controleren. De HIFs zijn samengesteld uit twee subeenheden, α en β. Er zijn drie bekende isovormen van HIF-α (1, 2, en 3) en verschillende splice varianten van HIF-1β. HIF-1β wordt constitutief tot expressie gebracht en niet geregeld milieu zuurstofgehalte 1. Het HIF-α familieleden worden dynamisch geregeld door een klasse van prolyl-hydroxylases (PHD) en de Factor Verbieden HIF (FIH); beide vereisen zuurstof als co-factor voor de hydroxylering van HIF-α 2,3 katalyseren. In normoxia het HIF-α familieleden gehydroxyleerd en gelabeld voor proteosomal afbraak door de E3-ligase, von Hippel Lindau (VHL). In hypoxie de PHD en FIH zijn inactief of hebben een verminderde activiteit. De HIF-α isovormen worden gestabiliseerd, vormen een heterodimeer met HIF-1β, en invloed op de transcriptie van genen die de cellulaire respons op de hypoxische omgeving (figuur 1A) geven 4.
Huidige technieken voor RNA-analyse gericht op het kwantificeren van gemiddelde waarden over een bepaalde celpopulatie. Cellen reageren op een hypoxische stimulus door het initiëren van de transcriptie van een groot aantal genen die hen in staat stellen zich aan te passen aan hun vijandige omgeving 5. Echter, hypoxie vaak bestaat als een gradiënt, en cellen in een hypoxisch milieu niet aan een uniforme hypoxische stimulus. We beschrijven een implementatie van de Click-iT RNA imaging kits in een zuurstof gecontroleerde werkstation naar wereldwijde RNA synthese onderzoeken op het eencellige niveau in hypoxie.
Het RNA imaging kit maakt gebruik van een eenlkyne-gemodificeerde nucleoside, 5-ethynyl uridine (EU) en chemisch-ligatie detectie globale RNA synthese tijd en ruimte mogelijk in cellen en weefsels 6. In het kort worden cellen behandeld met hypoxie en gekweekt in aanwezigheid van EU. Ze worden vervolgens gefixeerd en gepermeabiliseerd en EU-integratie in ontluikende RNA wordt gedetecteerd door chemoselectieve ligatie van de EU met een azide met kleurstof. Een typische workflow voor deze reactie wordt getoond in figuur 1B. We gebruikten de RNA beeldverwerkingskit RNA synthese onderzoekt de enkele cel die uit de behandeling met hypoxie.
De kleine omvang van de alkyn tag maakt een efficiënte opname van het gemodificeerde nucleoside in RNA specifiek. De chemoselectieve ligatie of 'klik' reactie is zeer efficiënt, snel en specifieke 7-10. Alle reactiecomponenten zijn bioinert en het reactiemengsel vereist geen extreme temperaturen of oplosmiddelen. De click reactie ontkentde vereiste van conventionele radioactieve en maakt directe visualisatie van de resultaten aangezien de output licht. Daarnaast kan de detectie molecuul gemakkelijk doordringen complexe monsters waardoor multiplexanalyse waaronder antilichamen voor de detectie van RNA-interactieve eiwitten. Dit RNA beeldvorming assay is compatibel met organische kleurstoffen, waaronder Alexa Fluor en fluoresceïne (FITC).
Wij meten de verandering in RNA-synthese na behandeling van onze cellen middels een implementatie van de open microscopie omgeving voor remote objecten (OMERO). OMERO is open-source software, beschikbaar op http://openmicroscopy.org/ . Deze microscoop afbeelding visualisatie en analyse software maakt het mogelijk de toegang tot, en het gebruik van een breed scala van biologische gegevens, met inbegrip van het beheer van de multidimensionale, heterogene datasets. De client-applicatie stelt externe visualisatie en analyse van complexe biologische beeldgegevens 11;we gebruikten het om de visuele veranderingen in de wereldwijde en enkele cel RNA synthese te kwantificeren. Deze gegevens en de stappen die nodig zijn om onze RNA beeldvorming experiment analyseren met behulp van deze microscoop beeld visualisatie en analyse software worden hieronder weergegeven.
We hebben gekeken naar veranderingen in de wereldwijde RNA synthese na de behandeling van menselijke osteosarcoom (U2OS) cellen met hypoxie gedurende maximaal 24 uur. In alle omstandigheden gedetecteerd we cel-cel variaties in het niveau van RNA productie. Korte tijd van blootstelling hypoxie niet tot significante veranderingen in het niveau van ontluikende RNA in cellen. Echter, blootstelling aan 24 uur van hypoxie resulteerde in een significante toename van de hoeveelheid geproduceerde RNA in cellen. Het merendeel van de cellulaire responsen op hypoxie zijn gemeten na langere blootstelling, zoals 4 tot 24 uur. Echter, sommige mechanismen die veel eerder, bijvoorbeeld; NF-KB-activering plaatsvindt binnen 5-15 minuten van hypoxie blootstelling 12. Onderzoeken korter hypoXia belichtingstijden is daarom geboden en kon afleiden van meer gecompliceerde reacties zoals celcyclus en apoptose.
Protocol
1. Celkweek en behandeling
- Verzamel de in tabel 1 tot cultuur menselijke osteosarcoom (U2OS) cellen genoemd reagentia en apparatuur. Bereid alle reagentia en tevens alle weefselkweek technieken in de laminaire stroming kap om de steriliteit te waarborgen
- Bereid het kweekmedium als volgt: Voeg 50 ml FCS, 5 ml L-glutamine en 5 ml penicilline / streptomycine het DMEM tot eindconcentraties van 10% (FCS) verkrijgt, 2 mM (L-glutamine), 50 U / ml ( penicilline) en 50 U / ml (streptomycine). Verwarm het kweekmedium bij 37 ° C in een waterbad.
- Maak de cellen voor behandeling:
- Steriliseer verscheidene dekglaasjes in 70% ethanol, aan de lucht drogen en plaats een aan de onderzijde van zes 3,5 cm platen.
- Dompel de dekglaasjes in 2 ml warm compleet DMEM (37 ° C), drukken met het dekglaasje tang zodat ze blijven gehecht aan de bodem van de putjes.
- Maak de U2OS cellen uit hun weefsel cultUre plaat door eenmaal wassen met 3 ml PBS, toepassen 4 ml verwarmd 0,05% trypsine-EDTA (1%) en incubatie bij 37 ° C gedurende 7 minuten.
- Resuspendeer cellen in 6 ml verwarmd volledige DMEM de trypsine-EDTA inactiveren en tellen met een hemocytometer.
- Plaat 2 x 10 5 cellen aan elk van de 3,5 cm platen bereid in punt 1.3.1. Schud de plaat naar een nog celverdeling garanderen. Laat de cellen een nacht hechten voorafgaand aan de behandeling.
- Behandel de cellen door het plaatsen van vier 3,5 cm platen in de hypoxie werkstation en de andere twee 3,5 cm platen laten in de incubator bij 37 ° C onder normale zuurstofgehalte. Wees klaar om de RNA etikettering assay onder behandelde omstandigheden (in de hypoxie kamer voor hypoxie behandelde cellen) 1 uur aanvangen vóór de hypoxie behandeling eindigt.
- Expose cellen hypoxie gedurende 1 uur 15 min, 1 uur 30 minuten, 2 uur en 24 uur. Deze tijdstippen zijn flexibel en door de gebruiker bepaald.
- Gebruik een normoXic 3,5 cm plaat als de positieve controle en normoxische 3,5 cm plaat behandeld met Actinomycine D (10 ug / ml eindconcentratie) gedurende 4 uur als negatieve controle. Actinomycine D is een remmer van globale RNA synthese.
Waarschuwingen:
Hoechst 33342 is een bekend mutageen.
DMSO is bekend om de invoer van organische moleculen in weefsels te vergemakkelijken.
NaOH is corrosief.
HCl is bijtend.
Paraformaldehyde is zeer giftig voor alle dieren en kan de dood veroorzaken bij de mens.
Triton X-100 kan leiden tot huidirritatie na rechtstreeks contact.
Actinomycine D is giftig bij aanraking met de huid of ingeslikt.
Neem de nodige voorzorgsmaatregelen bij de omgang met alle gevaarlijke chemische stoffen.
2. Click-iT Assay
- Verzamel de volgende reagentia die nodig zijn in aanvulling op de Click-iT testkit: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2-7,6, 3,7% paraformaldehyde (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, gedeïoniseerd water (dH 2 O), dimethylsulfoxide (DMSO), 10 M natriumhydroxide (NaOH) en 37% zoutzuur (HCl); Optioneel - pH-indicator strips.
- Bereid een verse PFA voorraad oplossing voor het uitvoeren van de Click-iT reactie als volgt:
- Zet 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O en 10 ul van10 M NaOH in een 50 ml Falcon buis. Kook 300-400 ml H 2 O in een grote bak in de magnetron om een waterbad te maken en staan deze in een zuurkast.
- Plaats de 50 ml Falcon in het waterbad en schud er voorzichtig gedurende 10 minuten periodiek loslaten van het deksel totdat de PFA heeft opgelost.
- Spuit de PFA oplossing door een 0,2 urn filter in een 50 ml Falcon buis, wat resulteert in een 37% oplossing.
- Verdun deze 10x PBS voegen en de pH op 6,8 door ongeveer 12 pi geconcentreerd HCl. Optie: Bevestig de juiste pH met de indicator strips in de zuurkast.
- Onmiddellijk te gebruiken of op te slaan overnight bij 4 ° C.
- Bereid de voorraadoplossingen van RNA beeldverwerkingskit als volgt:
- Voeg 373 ul dH 2 O aan component A resulteert in een voorraad oplossing van 100 mM van de EU. Bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal een maand.
- Voeg 85 ul van DMSO aan component B (Alexa Fluor 594) en meng door pipetteren of vortexen. WINKEL zowel bij -20 ° C gedurende maximaal een jaar.
- Voeg 2 ml dH 2 O naar component E om een 10X oplossing van het RNA beeldverwerkingskit reactie buffer additief creëren. Bewaren bij -20 ° C gedurende maximaal een jaar, gooi als oplossing ontwikkelt een bruine kleur.
- Labeling van Cellen met de EU: Bereid een 2X werkende oplossing van de EU uit de 100 mM voorraad bereid in stap 2.3 in voorverwarmde compleet medium (37 ° C) Voer de rest van deze stap en stap 2.5 in de hypoxie kamer voor cellen behandeld met hypoxie. . Verdun tot 1X door toevoeging van een gelijk volume 2X deze werkoplossing voor de media containing cellen. Incubeer gedurende 1 uur onder behandeling celkweekomstandigheden.
- Cel Fixatie: Was elk putje eenmaal met PBS en voeg 1 ml van de 3,7% PFA voorraad bereid in stap 2.2 onder behandeling omstandigheden. Incubeer gedurende 15 min onder behandelingsomstandigheden. Het behandelde met hypoxie monsters kunnen worden verwijderd uit de kamer hypoxie op dit punt. Verwijder het fixatief en was elk putje een keer met PBS (Zorg voor de verwijdering van afval op verantwoorde PFA). Voer de volgende stappen bij kamertemperatuur.
- Permeabilisatie: Verwijder de wasoplossing en voeg 1 ml van 1% Triton X-100 in PBS aan elk putje. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de permeabilisatie buffer en was elk putje een keer met PBS.
- Gelabelde RNA detectie:
- Bereid een verse 1X werkende oplossing van RNA beeldverwerkingskit reactie buffer additief door verdunning van de 10X-oplossing (bereid in stap 2.3) 1:10 in dH 2 O.
- Bereid de RNA-imaging kitreactiecoctail volgens tabel 2 voor gebruik direct na bereiding.
- Verwijder de was-oplossing en voeg 500 ul van RNA beeldverwerkingskit reactie cocktail aan elk monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bescherming tegen licht.
- Verwijder de RNA beeldverwerkingskit reactie cocktail en een keer wassen met 1 ml van RNA beeldverwerkingskit reactie spoelbuffer (component F), verwijder vervolgens de RNA beeldverwerkingskit reactie spoelbuffer.
- Optioneel multiplex reactie: Voer extra antilichaam etikettering van de monsters op dit punt volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- DNA kleuring: Was monsters met PBS verwijder vervolgens de wasoplossing. Verdun de Hoechst 33342 (Component G) 1:1000 in PBS. Voeg 1 ml verdund Hoechst 33342 in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bescherming tegen licht. Verwijder de Hoechst 33342 oplossing en was de cellen tweemaal met PBS. Verwijder de was solution en ga verder met lichtmicroscopie.
3. Lichtmicroscopie
- Mount Dekglaasjes:
- Breng 10 pl montage medium in het midden van een standaard microscoopglaasje.
- Plaats het dekglaasje met cel-kant naar beneden op het midden van de microscoop dia om de hoeveelheid van montage medium dekking. Zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen in de montage medium te vermijden omdat dit latere beeld overname zal verduisteren.
- Plak de dekglaasje aan de microscoop dia door het toepassen van duidelijke nagellak aan de omtrek. Laten drogen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht. De monsters worden bewaard bij -20 ° C na montage.
- Beeldacquisitie: Acquire beelden met behulp van een wide-field microscoop die fluorescentie detectie. Ongeveer fluorescentie / excitatie emissiemaxima voor Alexa Fluor kleurstof en Hoechst 33342 gebonden aan DNA worden getoond in Tabel 3.
- Prestatiesm Beeldvorming met behulp van een 40X/1.30 NA olie-immersie lens en foto's maken met een gekoelde CCD-camera.
4. Data Analysis
- Deconvolutie van beelden met behulp van software voor beeldverwerking (zie Materialen tabel) voorafgaand aan het importeren naar de OMERO cliënt. Normaliseren rendering instellingen voor alle afbeeldingen in hetzelfde experiment in de microscoop beeld visualisatie en analyse software door het toepassen van de weergave-instellingen van controle normoxic cellen aan alle andere voorwaarden.
- Gebruik de regio van belang (ROI) instrument in de microscoop beeld visualisatie en analyse software (zie ook Materiaal tabel) kernen kiezen uit elk beeld. Verkrijgen gemiddelde intensiteiten voor elke ROI en bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elke voorwaarde door te kiezen voor de optie intensiteit analyse, waaronder een aantal tussen 30-50 cellen.
- Construct Spreidingsdiagrammen gebruik van een data grafische software (zie ook Materiaal tabel) door het uitzetten van alle individuele gemiddelde intensiteit waarden verkregen in stap 4.2 to reflecteren variabiliteit tussen cellen onder elke voorwaarde. Alternatief bouwen staafdiagrammen om de gemiddelde gemiddelde intensiteit plus standaarddeviatie van ontluikende RNA vertegenwoordigen.
Representative Results
Een schema van het RNA beeldverwerkingskit reactie wordt in figuur 1B. We gebruikten deze reactie om kwantitatief totaal RNA synthese in U2OS cellen na behandeling met hypoxie zowel op individueel (eencellige) en mondiaal niveau (populatie van cellen). De cellen werden behandeld met hypoxie en gekweekt in aanwezigheid van EU. Ze werden vervolgens gefixeerd en gepermeabiliseerd en goedkeuring door de EU werd gedetecteerd door chemoselectieve ligatie van de EU met een azide met kleurstof. Deze 'click' reactie resulteert in een fluorescentie-emissie die kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van fluorescentie lichtmicroscoop. Figuur 2A toont een typisch resultaat van dit experiment. Fluorescent gelabelde cellen worden rode pseudocolored en het beeld is in de open microscopie omgeving voor remote objecten (OMERO) geopend. Deze microscoop afbeelding visualisatie en analyse software heeft een ingebouwde ROI instrument dat kan worden gebruikt om individuele sub-cellulaire structuur te selecterenturen en kwantitatief te analyseren beeldintensiteit binnen de gekozen regio. Een typisch voorbeeld van de gegevensuitvoer na het gebruik van dit instrument in het clientprogramma is te zien in figuur 2B; individuele cel intensiteiten worden getoond naast een representatief beeld van het experiment, dat dient als een visuele controle op geldigheid gegevens te waarborgen.
De individuele cel fluorescentie intensiteiten kunnen worden uitgezet als een spreidingsdiagram de verdeling van de individuele cellulaire intensiteiten binnen de behandelde celpopulatie tonen. Een voorbeeld van een dergelijke grafiek is te zien in figuur 2C. Plotten intensiteit gegevens op deze manier is nuttig omdat hiermee een snelle vergelijking van behandelresultaten en duidelijk de opmerkelijke heterogeniteit binnen een behandeling celpopulatie die anders is bedekt met standaard gegevensweergave. De reactie heterogeniteit is interessant dit experiment want hoewel een uniforme hypoxische stimulus was eenpplied aan de cellen, is het duidelijk dat elke cel van dezelfde monolaag populatie reageert anders op deze stimulus.
Figuur 2D toont het totale resultaat van ons experiment. Fluorescentie-intensiteiten van alle cellen binnen een populatie in behandeling werden gemiddeld en vervolgens uitgezet in dit staafdiagram. Een student t-test werd gebruikt om de statistische waarschijnlijkheid van elke behandelingsgroep significant verschillend van de controlegroep berekend. Interessant is dat deze gegevens dat er een statistisch significante toename in de wereldwijde RNA-synthese in de tijd indien U2OS cellen worden behandeld met hypoxie (soms meer dan 1 uur 30 min * p <0,01;. ** P <0,05 en *** p <0,001 en n> 30). Deze gegevens tonen dat na langere hypoxie behandeling, de cel richt zijn inspanningen op de productie van RNA zelfs in deze vijandige hypoxische omgeving. Actinomycine D behandeling volledig ablates de fluorescentie-intensiteit zoals verwacht.
Figuur 1. A. Het HIF systeem reageert op veranderingen in cellulaire zuurstof. In deze vereenvoudigde schematische hypoxie stabiliseert de HIF heterodimeer door het voorkomen van HIF-α hydroxylatie (-OH) door de prolylhydroxylase enzymen (PHD) en de latere polyubquitination door von Hippel-Lindau eiwit (VHL). HIF stabilisatie leidt tot activering van vele genen die de cel reageren cellulaire hypoxie B. RNA-synthese kan worden gedetecteerd met de Click-IT assay helpen.; cellen zijn gelabeld met de EU na de behandeling het Click reactie RNA synthese, die kan worden gekwantificeerd door fluorescentie-intensiteit en lichtmicroscopie detecteert. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.
Figuur 2. A. Screenshot van OMERO typische microscopische uitgang weer te geven volgende RNA etikettering. Deze microscoop afbeelding visualisatie en analyse software kan snel halen intensiteit gegevens op individueel celniveau met behulp van de ingebouwde ROI macro. Een screenshot van de uitvoer van deze opdracht wordt weergegeven in B. Global RNA synthese kan worden afgeleid uit individuele cel intensiteit, kan het bereik van die te zien is in puntgrafiek C. Een formele vertegenwoordiging van deze geaggregeerde gegevens kunnen worden gezien D. * p <0.01; ** P <0.05 en *** p <0,001 en n> 30. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Celcultuurreagentia |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2-7,6 |
| Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) |
| Foetaal kalfsserum (FCS) filter gesteriliseerd |
| Penicilline / streptomycine |
| L-glutamine |
| 0,05% trypsine-EDTA (1%) |
| 70% ethanol |
| Actinomycine D (1 ug / ul voorraad) |
| Cell Culture Equipment |
| Steriel pasteurpipetten |
| Een reeks van cel-cultuur behandeld kunststofmateriaal geschikt voor het onderhoud en de behandeling van cellen in cultuur |
| Waterbad van 37 ° C |
| Laminaire luchtstroom kap |
| Incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 |
| Hypoxie Workstation ingesteld op 37 ° C, 5% CO2, 1% O2 |
| Dekglaasjes |
| precisie pincet |
| Hemocytometer |
Tabel 1. Reagentia en apparatuur die voor het kweken van cellen U2OS.
| Reactiecomponenten | Aantal Dekglaasjes | |||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 10 | |
| Click-iT RNA reactie buffer (Component C) | 428 pl | 856 pl | 1.7 ml | 2.1 ml | 2.58 ml | 4.3 ml |
| CUSO4 (component D) | 20 gl | 40 gl | 80 pl | 100 pl | 120 pl | 200 gl |
| Alexa Fluor Azide (bereid in stap 2.3) | 1.8 pl | 3.7 pl | 7.4 pl | 9.3 pl | 11.28 pi | 18.8 pi |
| Click-iT reactie buffer additief (opgesteld in stap 2.3) | 50 gl | 100 pl | 200 gl | 250 gl | 300 pi | 500 pi |
| Geschatte Totaal Volume | 500 pi | 1 ml | 2 ml | 2,5 ml | 1.5 ml | 5 ml |
. Tabel 2 RNA beeldverwerkingskit reactie cocktails: Referentietabel detaillering verhouding van master mix componenten voor RNA beeldverwerkingskit reactie volgens het aantal dekglaasjes te worden gemerkt.
| Fluorofoor | Excitatie (nm) | Emissie (nm) |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 |
| Hoechst 33342, gebonden aan DNA | 350 | 461 |
. Tabel 3 Fluorescentie / excitatie emissie maxima: Geschatte fluorescentie / excitatie-emissie maximaal voor Alexa Fluor kleurstof en Hoechst 33342 gebonden aan DNA.
Discussion
Wij hebben ons gebruik van een RNA beeldverwerkingskit de effecten van hypoxie op RNA synthese in osteosarcoom (U2OS) cellen onderzoeken beschreven. Deze techniek is relatief eenvoudig en levert gegevens over de opwarming van de transcriptie bij een enkele cel niveau. We pasten de conventionele protocol voor deze kit om etikettering op te nemen in een hypoxie kamer. Bij ons weten is dit het eerste verslag van het gebruik van deze techniek om veranderingen in RNA synthese in hypoxie te meten. Het RNA beeldverwerkingskit we gebruikt is geschikt voor experimenten in hypoxie, omdat het vereist geen radioactieve isotopen en technisch compatibel is met de beperkingen van het werken in een gecontroleerde atmosfeer werkstation. Veel voorkomende problemen met deze techniek zorg efficiënt fixatie en etikettering van het monster. Het is uiterst belangrijk dat de PFA gebruikt om vast te stellen van het monster is vers en de wassen stappen die de 'click' reactie volgt worden uitgevoerd zoals beschreven bij lage achtergrond kleuring van de steekproef te waarborgen. Als background fluorescentie wordt een probleem is het raadzaam om nog eens na stap 2.7.4 wassen met 1 ml RNA beeldverwerkingskit reactie spoelbuffer.
De hier genoemde RNA beeldverwerkingskit vertegenwoordigt een significante vooruitgang in RNA imaging technologie op het gebied van gebruiksgemak en specificiteit en reactiesnelheid. Deze techniek wordt voornamelijk beperkt door de tijd die nodig is om het monster te labelen. Het RNA beeldverwerkingskit vereist een 1 uur etikettering periode dat het onderzoek van de snelle veranderingen in de wereldwijde RNA die gewoonlijk zou plaatsvinden binnen deze periode voorkomt. Het is daarom onze eerste keer is beperkt tot 1 uur en 15 minuten. De techniek is geassocieerd met weinig andere beperkingen die grotendeels betrekking compatibiliteit reagens met andere fluorescente merkers, bijvoorbeeld, dit RNA beeldverwerkingskit is niet compatibel met phalloidin kleuring.
Alle bestaande benaderingen bestuderen RNA-synthese in cellen zijn gebaseerd op opname van gemodificeerde nucleosiden in deontluikende RNA en de detectie van labels opgenomen door verschillende middelen. Het baanbrekende benadering was gebaseerd op het gebruik van radioactief gelabeld RNA precursoren gevolgd door detectie met autoradiografie. Deze methode leidde tot een ontdekking van celcyclus podia en andere belangrijke bevindingen; echter, het heeft veel nadelen, zoals de omslachtige radioactiviteit werk, lange belichtingstijden en lage resolutie afbeeldingen van autoradiografie 6. Aan de vooruitgang op het gebied geëxploiteerd middel immunochemische de noodzaak van radioactiviteit te elimineren. RNA werd gemerkt door incorporatie van Bru gevolgd door immunochemische detectie. Het efficiënt antilichaambinding vereist nucleïnezuur denaturatie toegang aan DNA of RNA dat het verlies van celmorfologie veroorzaakt en beschadigde de epitopen van verschillende proteïnen, de verdere detectie voorkomen met fluorescent gelabelde antilichamen 13 te verbeteren. De introductie van 'click chemie' technologie vereenvoudigde de detectie stap en tHij procedure vergeleken met autoradiografie en immunochemie. De technologie is gebaseerd op azide-alkyn Huisgen cycloadditiereactie waar eindstandige alkyn van 5-ethyniluridine bindt met azide geconjugeerd met het fluorofoor in aanwezigheid van Cu (I). De reactie is specifiek, snel, geen extra stappen nodig, en is gemakkelijk verenigbaar met immunochemische detectie van andere celbestanddelen.
Met dit RNA weergavetechnologie we aangetoond dat cellen in dezelfde monolaag bevolking, verschillende RNA-synthese niveaus als reactie op hypoxie. Wij beperken ons experiment om het effect van slechts RNA productie onderzoeken; echter volstrekt mogelijk met deze RNA beeldverwerkingskit tot gewijzigde aanvullende multiplex reacties die zorgen voor een meer complexe analyse van RNA productie voeren. Bijvoorbeeld, secundaire kleuring met een antilichaam specifiek voor markers van actieve transcriptie zoals niveaus van gefosforyleerd RNA polymerase II of zelfs onderdelen van de vertalingentie machines om een indicatie van het bedrag van dit nieuw geproduceerd RNA dat wordt omgezet in eiwitten geven zijn mogelijk. Bijkomende proteïnen, zoals actine, een eiwit dat niet significant zou veranderen hypoxie, getest kan worden als extra controle. Bovendien kan verschillende celtypen getest, omdat het zeer aannemelijk dat verschillende cellen verschillende RNA-synthese prijzen en zelfs verschillende responsen op hypoxie hebben.
Gebruik van dit RNA beeldverwerkingskit een zeer eenvoudige voorwaarde stappen worden uitgevoerd zoals beschreven. Kritische stappen in het protocol te betrekken cel plating, cel fixatie en kleuring en beeldopname. Het is belangrijk om de cellen plaat bij de beschreven dichtheid boven of onder samenvloeiing voorkomen bij experimenten waarbij het resultaat significant zullen beïnvloeden. Het is ook belangrijk om verse fixeermiddel te gebruiken, zodat de beste "snapshot" van de cel wordt genomen en voorzichtig zijn bij het wassen van de cellen na kleuring met de bac verminderenkground tot een niveau dat aanvaardbaar is voor een efficiënte analyse. Ten slotte is de methode van het beeld overname is van vitaal belang om beelden die zijn van een voldoende kwaliteit voor verdere analyse te bereiken. Wij raden het gebruik van de beste lichtmicroscoop beschikbaar om monsters optisch zoals de microscoop gebruikt in dit protocol dat beschikbaar is op de meeste research intensieve centra wereldwijd is te onderzoeken.
Disclosures
JRS is oprichter van Glencoe Software, Inc, een open-source VS gevestigde commercieel bedrijf dat bijdraagt aan OMERO.
Acknowledgments
JB is een CRUK klinische collega, AS is een Wellcome Trust promovendus, de SR lab wordt gefinancierd door een CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Dit werk werd ondersteund door twee Wellcome Trust Strategische Awards (097945/B/11/Z en 095931/Z/11/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| FCS | Gibco | 10270106 | |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-603E | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | |
| Hypoxia chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | |
| Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | |
| pFA | Sigma | 76240 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| 10 M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 37% HCl | VWR | 20252.335 | |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Actinomycin D | Sigma | A9415 | |
| Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | |
| softWoRx | Applied Precision | N/A | Referred to in text as image processing software. |
| CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | |
| Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) | OME | N/A | Referred to in text as microscope image visualization and analysis software. |
| SigmaPlot v12.0 | Systat Software Inc. | N/A | Referred to in text as data graphing software. |
References
- Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
- Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
- Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
- Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
- Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
- Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
- Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
- Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
- Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).
