Summary
A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.
Abstract
Vascularização insuficiente é considerada um dos principais fatores que limitam o sucesso clínico de construções de engenharia de tecidos. A fim de avaliar novas estratégias que visam melhorar a vascularização, métodos confiáveis são necessários para fazer o em-crescimento de novos vasos sanguíneos em andaimes bio-artificial visíveis e quantificar os resultados. Ao longo dos últimos dois anos, nosso grupo apresentou um modelo de defeito pele completa que permite a visualização direta dos vasos sanguíneos por transiluminação e oferece a possibilidade de quantificação através da segmentação digital. Neste modelo, uma cria cirurgicamente defeitos da pele cheio nas costas de camundongos e substitui-los com o material testado. Moléculas ou células de interesse, também pode ser incorporado em tais materiais para estudar o seu efeito potencial. Depois de um tempo de observação de uma de própria escolha, os materiais são explantada para avaliação. Feridas bilaterais oferecem a possibilidade de fazer comparações internas ªa minimizar artefactos entre indivíduos, bem como de diminuir o número de animais necessários para este estudo. Em comparação com outras abordagens, o nosso método oferece uma análise simples e eficaz, confiável e de custo. Nós implementamos este modelo como uma ferramenta de rotina para realizar a triagem de alta resolução ao testar a vascularização de diferentes biomateriais e abordagens bio-ativação.
Introduction
Em décadas recentes, a engenharia de tecidos, abriu uma nova opção terapêutica para substituir defeitos de tecidos com células do próprio corpo um. A fim de apoiar o processo fisiológico da regeneração de tecidos, andaimes são concebidos como uma estrutura biodegradável, que proporciona um cenário em que as células do leito da ferida pode crescer e restaurar o defeito de 2,3.
Vascularização insuficiente é considerada o principal obstáculo que impede o avanço clínico de andaimes Bioartificiais 4. Com o crescimento de células, a procura de nutrientes e de oxigénio e aumento da vascularização do material torna-se essencial. Vascularização insuficiente ou atrasada pode, portanto, levar à necrose central de produtos da engenharia de tecidos 5. Além disso, os vasos sanguíneos fornecem células imunocompetentes e remover os resíduos metabólicos na zona de regeneração. Altas taxas de infecção e baixa regeneração são apenasalgumas das consequências de perfusão sanguínea insuficiente observados na engenharia de tecidos, que são destinadas a ser evitada pelo aumento da vascularização dos andaimes 6,7.
Várias estratégias que visam melhorar a vascularização foco no papel fundamental da própria biomaterial ea microestrutura do andaime. Há esforços de pesquisa intensiva para desenvolver novas abordagens em mudar o processo de cicatrização de reparação para a regeneração, assim, (re) produzir um tecido com propriedades fisiológicas mais próximos o único a ser restaurados 8,9. Biomateriais que foram estudados e avaliados no que diz respeito ao seu potencial regenerativo incluído colágeno, fibrina, quitosana e alginato 10,11. Estes biomateriais podem ser usados e combinados como uma espinha dorsal para a construção de novos scaffolds utilizando diferentes estratégias como descelulação tecido, auto-montagem, prototipagem rápida e eletrofiação 12. A fim de ENHance própria capacidade regenerativa do corpo, andaimes podem ser bioactivado. A incorporação de crescimento angiogénico recombinante factores 13 ou genes vectores que codificam para factores tais 14 demonstrou melhorar a vascularização do andaime. A utilização de células estaminais tem sido amplamente demonstrado ser uma estratégia promissora para melhorar a vascularização, em que as células estromais mesenquimatosas e células progenitoras endoteliais ganharam mais atenção 15,16. Outras abordagens tentam construir estruturas que contêm redes de vasos pré-fabricadas antes do transplante 17. Apesar dos esforços intensivos em design de andaime e sua bio-ativação, nenhuma estratégia melhorou a vascularização em um nível clinicamente significativo e, com exceção de substituições dérmicas em queimaduras maciças, a tradução de materiais de bioengenharia na rotina clínica é só ocorrendo hesitante 18 .
Uma das razões pelas quais a vascularizaçãode construções de tecidos artificiais é ainda um problema não resolvido, é a dificuldade de avaliar o sucesso das novas tecnologias em abordagens in vivo. Embora experiências in vitro pode fornecer informações importantes sobre o potencial de vascularização de andaimes, modelos animais apropriados são necessários para estudar os parâmetros-chave, tais como a biocompatibilidade do material, a segurança ea eficácia do tratamento e, de particular importância, a vascularização do tecido construir. Portanto, ferramentas confiáveis para visualizar e quantificar redes de vasos sanguíneos in vivo são essenciais.
Neste estudo apresentamos um método simples e confiável que permite a visualização e quantificação da rede vascular no interior andaimes explante. Este método baseia-se no tecido de transiluminação e segmentação digital. Uma vez que este método é não-invasivo, que permite novas análises moleculares e histológicos do material alvo.
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Protocol
1 Preparação de andaimes
- Gerar amostras dos scaffolds usando 12 milímetros punções.
- Para introduzir moléculas bioativas ou células para o cadafalso, drenar os andaimes delicadamente apertando-os com uma gaze estéril. Em seguida, re-hidratar os andaimes por adição de 160 ul de uma solução contendo as moléculas bioactivas ou células de interesse. Confira o sucesso de bioactivação com células através de ensaios metabólicos, como MTT Ensaios.
- Se necessário, corrigir os compostos ou as células a serem testadas dentro do andaime, fornecendo-lhes, por exemplo, em uma solução de fibrina-trombina ou um hidrogel, de novo por meio de re-hidratação, conforme descrito no passo 1.2.
NOTA: Este passo pode ser útil quando os compostos ou as células não dão mecanicamente com o material. Pode-se também controlar a dinâmica de libertação dos compostos .. - Prepare as malhas titanizada, que serão colocados sob cada andaime em cada grupo experimental e controle, por cortandog pedaços em forma redonda, de aproximadamente 14 mm de diâmetro.
NOTA: A malha titanizada funciona como uma fronteira física necessária para delimitar o tecido regenerado a partir do leito da ferida.
2. Animais
- Antes da implementação do modelo apresentado, consultar as leis de proteção aos animais correspondentes e obter a permissão das autoridades locais. Neste trabalho, todos os experimentos foram realizados com camundongos, de acordo com a atual lei de protecção dos animais alemão e aprovado pelo Governo do Distrito da Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
- Escolha cuidadosamente o animal e tensão. Apesar de se ter estabelecido o modelo de ratos, que podem ser convertidos para outros animais comuns, tais como ratos, coelhos ou porcos.
- No caso de você estiver trabalhando com animais de pêlo, raspar a parte de trás dos animais antes da implantação dos andaimes.
NOTA: Este trabalho utiliza ratos de 6 a 8 semanas de idade, com peso corporal entre 20 ge 25 g, no entanto diferentes idades e bpesos ody também pode ser usado.
3 Anestesia
- Conduzir a operação em condições estéreis. A fim de manter a temperatura normal do corpo do animal, utilizar um tapete de aquecimento.
- Antes da anestesia por inalação os animais recebem buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea a cada 8 horas.
- Colocar o animal sob anestesia inalação (isoflurano) ou aplicar procedimentos padrões equivalentes. Confirme anestesia ou apertando suavemente os dedos do animal ou através de uma pitada de pele.
- Para evitar exsiccosis, injectar 0,5 ml de solução salina fisiológica por via subcutânea, no início da operação.
4. Excisão da Pele
- Colocar o animal em posição prona e marcar a linha média das costas do rato com uma ponta fina caneta permanente (Figura 1A).
- Definir a área da excisão. Coloque os defeitos na área mostrada na Figure 1C. Note-se que se os defeitos são colocados muito caudal, os animais são mais propensas a remover os curativos e os andaimes.
- Criar rodada defeitos bilaterais através de um 10 milímetros biópsia (Figura 1B). O perfurador deve ser cuidadosamente forçado contra a pele e não deve ser usada para cortar completamente através da pele, mas para delinear a área de excisão (Figuras 1C e 1E).
- Delicadamente levante a pele marcada com uma pinça e inciso ao longo do círculo marcado com tesouras cirúrgicas finas (Figura 1F). Em caso de hemorragia, comprimir cuidadosamente com gaze estéril. Uma descrição passo a passo da excisão é mostrado na Figura 1.
NOTA: O defeito é criado com um perfurador menor do que aquele para gerar os andaimes, para compensar o alargamento do defeito devido à elasticidade da pele.
5. andaime Implantação
- A fim de abrir espaço para a titazado malha, estender a separação da pele e do tecido subjacente nas fronteiras da ferida para 2-4 mm (Figura 2A).
- Coloque a titanizada engrenar no defeito directamente no leito da ferida e sob as bordas da ferida (Figuras 2A e B).
- Coloque andaimes diretamente sobre a malha.
- Suturar os andaimes para as bordas da ferida adjacente por 4 a 6 nós individuais, deixando os bordos ligeiramente ao longo do esqueleto (Figura 2C).
NOTA: Evite o uso de suturas biodegradáveis. - Suturar uma ferida curativo transparente acima dos defeitos para proteger a armação, enquanto que permite um controlo da área da ferida (Figura 2D).
6 Cuidados Pós-Operatórios
- Mantenha um rato por gaiola para evitar manipulação mútua do curativo e andaimes.
- Avaliar o estado geral do animal diariamente pela atividade observando motor, peso do corpo, sinais de dor, tolerânciaao molho e auto-mutilação. Também monitorizar a área da ferida para o sangramento, local e sintomas sistémicos de infecção e a posição do penso.
- A fim de minimizar a dor do animal, injecta-buprenorfina por dia numa dose de 0.05-0.1 mg / kg de peso corporal ou analgésicos equivalente.
- Se o rato elimina ou danifica o curativo, substituir ou recolocá-la sob anestesia.
7 Eutanásia e explantes do andaime
- Em intervalos de tempo desejados, sacrificar os animais por overdose de pentobarbital (150 mg / kg).
- Marque o local da excisão de pele com um marcador permanente, que deve incluir os andaimes e tanto o mouse de volta pele possível (Figura 3A).
- Faça uma incisão na pele ao longo das linhas marcadas com uma tesoura ou um bisturi. Retire toda a pele, incluindo os andaimes e malha titanizada, do tecido subjacente através de uma preparação sem corte (Fifigura 3B).
- Colocar o tecido explantado estendido sobre uma placa de Petri (Figura 3C e D)
8 visualização e quantificação da Rede Vascular
- Transiluminação:
- Configurar um dispositivo transillumination, com a montagem de uma placa de Petri sobre uma forte fonte de luz branca (100 Watt lâmpada padrão).
- Corrigir uma câmera digital acima da transilluminator obter fotos digitais.
- Colocar as amostras de cabeça para baixo na placa de Petri sobre o dispositivo transillumination.
- Tirar fotos dos andaimes completos em modo macro, bem como de áreas de igual tamanho de pele normal. Armazenar as imagens em um formato TIFF, para posterior análise digital.
- Salve o tecido para posterior análise bioquímica ou histológica.
- Segmentação Digital e quantificação:
- Baixe e instale o software VesSeg-Tool, que pode ser obtido free de carga em: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- Abra a imagem com o software VesSeg-Tool.
- Selecione a área da imagem coberta pelo andaime para análise digital (Imagem → Select).
- Para aumentar o contraste dos vasos use a opção "thresholding histerese" (Imagem → melhoria navio filtro → histerese limiar → Top-Hat transformação → melhoria navio Calcular).
- Prossiga com a segmentação do mapa navio (fronteiras Imagem → melhoria navio filtro → histerese limiar → limiar). Selecione o primeiro limiar ("cobertura de navio"), de modo que cada pixel, o que é mesmo remotamente navio-like, serão rotulados como vaso. Selecione o segundo limiar ("cobertura de Fundo"), para que apenas os pixels que são particularmente navio-como vai ser rotulado como vasos.
- Confira a proposta de segmentação automática manualmente para adicionar navios não capturados e eliminar estruturas falso-positivos comuns, que geralmente são estruturas longas e finas de navios-like, como cabelos ou suturas.
- Calcule o comprimento dos vasos e a área total coberta por navios (estatísticas Imagem → Imagem → estatísticas imagem binária).
NOTA: Para o cálculo dos comprimentos de navios, navios no mapa navio resultando sejam reduzidas a linhas com uma largura de um pixel 20.
- Analisar a área da pele nativa sob os mesmos parâmetros que os andaimes, a atribuição de um valor de 100% para o tecido nativo e relacionar o andaime para esse valor. Por exemplo, se a percentagem de pixels brancos é de 60% no tecido normal e de 30% no andaime, que representaria uma vascularização 50% do andaime. Nota: A cobertura branca vasos é atribuída à área de um quadrado em torno do andaime. Ajuste o número de pixels brancos consi coberturadering que a área do círculo é significativamente menor (π x R 2) do que o quadrado (4 x R 2).
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Representative Results
Um defeito da pele completa bilateral de confiança podem ser criados no ratinho (Figura 1), em que a pele pode ser substituído por um biomaterial sob estudo (Figura 2). Aqui, sem grandes complicações são observadas durante ou após o procedimento operatório, nem sinais macroscópicos de infecção ou reação de corpo estranho. Em casos raros, um andaime se perde quando um rato remove-lo. Contracção da ferida não foi observado (Figura 3). Transiluminação tecido permitiu melhor visualização das estruturas vasculares de até 30 mm de largura, de uma amostra de tecido inteiro, que incluiu tanto, o tecido nativo e andaimes implantados (Figura 4). Após a segmentação digital navios poderiam ser facilmente quantificado em tempos desejados após a implantação. Por exemplo, duas semanas após a implantação, foram observados níveis de vascularização de 62,28 ± 8,6% (média ± erro padrão da média, n = 8) 21. Ao todo, cerca de 25 min e# 160; por animal (2 scaffolds) são necessários para a implantação, a 5 minutos para a colheita de tecidos e retratar e 10 min para análise digital de uma amostra. Como ponto final, este método não afeta a qualidade do tecido enxertado para análise posterior. Por exemplo, as proteínas e os extractos de ARN pode ser facilmente obtido a partir da amostra através de métodos padrão.
Figura 1 defeito de pele completa. Linha média do dorso do rato é marcado com uma caneta de ponta fina e um soco biópsia é usado para marcar a área foram o defeito será criado (A, B, C e D). Uma vez que as áreas são definidas, a pele cheia é removida com tesoura cirúrgica padrão, como visto no close-up da preparação (E e F). Um final resultado do defeito é mostrado em (D) e ampliada em (G). Barras de escala representam 1 cm de ABCD e 5 mm de EFG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Implantação do andaime. Antes da implantação do andaime, uma tela é colocada dentro do defeito directamente no leito da ferida e nas bordas da ferida (A e B). Próximo andaimes são colocados ao longo da malha e suturados às bordas da ferida (C). Finalmente, uma compressa para feridas transparente é colocado e suturado à pele (D). A barra de escala representa a 5 mm (A, B, e C) umd 1 cm de (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Tissue explante. Para a análise do tecido da pele integral da parte de trás do animal é removido cirurgicamente (A e B) e estendido sobre uma placa de Petri (C). Para transillumination a pele é virada de cabeça para baixo e uma imagem digital é tirada (D). A remoção da pele próximo aos andaimes é necessário para a normalização dos dados de vascularização. Barras de escala representam um centímetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. transiluminação, segmentação digital e quantificação. Tecido da pele foi excisada e a rede vascular no interior foi visualizado por transiluminação (imagens superiores) de pele integral da parte traseira (A) e zonas de execução da pele nativa (B) e a escora (C ) são mostrados. As setas indicam as áreas ampliadas em (B) e (C). Cada uma das imagens inferiores mostram os resultados do processo de segmentação da imagem digital para localizado directamente acima. Barras de escala representam cinco milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma necessidade de se estabelecer abordagens bem sucedidas na melhoria da perfusão sanguínea em engenharia de tecidos construções, o que exige o desenvolvimento de novos métodos confiáveis para estudar os processos de vascularização dentro dos biomateriais. Os métodos mais comuns para fazer andaime vascularização ex vivo disponíveis incluem a utilização de microscopia, que proporciona uma ferramenta de alta-resolução. Na maioria dos casos, no entanto, este método é limitado à análise de pequenas áreas de tecido e tende a ser dispendiosa e demorada. Além disso, muitas vezes inclui a rotulagem elaborado e métodos de coloração, onde os vasos sanguíneos perfusão não podem ser distinguidos dos não-funcionais 22. Métodos em uso para avaliar a funcionalidade dos vasos são tomografia computadorizada, ressonância magnética e tomografia eletrônica de pósitrons. Estes métodos têm as desvantagens de equipamento extremamente dispendioso e de baixa resolução de energia 23. Outra estratégia utilizada para visualizar a vascularização é outilização de moldes vasculares seguido por corrosão química do tecido 24. Este método faz com que seja possível obter uma estrutura representativa 3D da rede vascular, mas os resultados variam fortemente, dependendo do nível de perfusão artificial e tecidos não pode ser utilizado em estudos bioquímicos, tais como a proteína ou análise de RNA. A membrana corioalantóica de frango (CAM), modelo 25 e o modelo de câmara de prega em roedores 26,27 demonstraram ser métodos eficazes para analisar a angiogénese, a perfusão capilar e fluxo sanguíneo. Recentemente, o modelo de câmara de dobras cutâneas também tem sido usado para aplicações de engenharia de tecidos que avaliam estratégias de vascularização baseados em MSC em andaimes de poliuretano poroso 28. Estes métodos têm vantagens importantes para a imagem in vivo e representam um alvo atractivo para o método descrito aqui.
O modelo aqui apresentado foi desenvolvido para superar as deficiências dos métodos mentioned acima. Aproveitando-se das características intrínsecas únicas da pele, defeitos completas são criados e usados para avaliar a vascularização dos biomateriais. A pele é um órgão externo, o que permite facilitar a visualização e manipulação do tecido. Devido à sua estrutura superficial e grande homogeneidade, múltiplos defeitos pode ser criado o que torna possível a comparação interna, enquanto que a diminuição do número de animais necessários para este estudo. Devido à simetria ântero-posterior do animal, defeitos bilaterais são sugeridos, no entanto; a influência dos efeitos sistémicos deve ser considerado quando os dois lados são comparados uns com os outros. Finalmente, a pele é um tecido razoavelmente transparente representando um órgão de escolha óptima para transiluminação. Apesar de o método aqui descrito é adequado para muitos tecidos nativos diferentes e vários biomateriais, este protocolo foi inicialmente criado para ser utilizado com uma estrutura de suporte à base de colagénio de camada dupla que é aprovado pelo FDA e clinicamente utilizados para dereparação rmal. Um pré-requisito importante para a implementação deste método é que o andaime tem que ser parcialmente transparente. Dependendo do material de andaime escolhido, alguma adaptação do protocolo poderia ser necessário. Anteriormente, o nosso grupo utilizou o modelo para mostrar como a aplicação de células mesenquimais humanas para andaimes aumenta a sua vascularização 29.
Uma câmara digital padrão e uma fonte de luz são suficientes para a visualização da rede vascular, que pode ser quantificada por meio de software livre. A segmentação das imagens semiautomática pelo VesSeg-ferramenta é constituída por dois degraus. Na primeira etapa, a imagem tirada da rede vascular é que leva a um mapa navio com contraste. Em seguida, o algoritmo de segmentação seleciona as áreas dos vasos e, finalmente, a proposta de segmentação é apresentado como uma imagem (Figura 4) 30. Num segundo passo de processamento, usando o facto de que os recipientes são ligados structures (o que significa que dos vasos pixels ficar juntos espacialmente), uma segunda segmentação é usado para selecionar a partir da primeira apenas os vasos verdadeiros pixels e todos os vasos pixels verdadeiros. Portanto, um rótulo final de "um" é concedido apenas aos vasos pixels de baixa confiança desde a primeira imagem que estão ligados através de uma rede de vizinhos para um pixel embarcação de alta confiança na segunda imagem.
Desde sem aditivos químicos são necessários, este método é também rentável. Análise digital mostra uma boa reprodutibilidade de determinar dimensões do reservatório, distâncias intravascular, o número de pontos de ramificação, área vascularizada e comprimento total de rede vascular. Já mostramos anteriormente que a rede de vasos sanguíneos podem ser melhor visualizados por transiluminação do que através de estudos de rádio-angiográfica 31. A presença da malha de titânio tem uma dupla função. Por um lado, impede que a contracção da ferida, o que é uma desvantagem comum de o uso de rato models; por outro lado, proporciona uma fronteira física entre a escora e o leito da ferida. Porque a maioria dos scaffolds são biodegradáveis, este último função é fundamental para delimitar fisicamente a fronteira entre o andaime e do leito da ferida durante a colheita dos andaimes. Entre os principais inconvenientes deste método é a necessidade de explante os andaimes e, por conseguinte, o de restringir a análise a um único ponto de tempo; assim, a observação dinâmica da vascularização não é possível com a configuração atual. Outro problema é que este método é limitado a biomateriais semi-transparente que permitem transiluminação. Finalmente, embora o processo de operação não requer habilidades especiais cirúrgicos, uma curva de aprendizagem de cerca de 6-12 animais operados tem que ser considerado para dominar o método adequadamente.
Nós introduzimos um tempo e custo abordagem eficaz que permite a visualização de alta resolução e quantificação das estruturas vasculares, representing um método ideal para comparar a vascularização em diferentes biomateriais ou diferentes estratégias de andaime-bioactivação. Este método é fácil de estabelecer e não requer equipamento especial. A principal característica deste modelo é que após a visualização do navio, os tecidos podem ser utilizadas para estudos como histológica ou análise molecular.
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Disclosures
Declaração de conflito de interesse:
Todos os autores: Nenhum
Divulgações financeiras:
Nenhum dos autores tem interesse financeiro em qualquer um dos produtos, dispositivos ou drogas mencionadas neste artigo.
Acknowledgments
Integra modelo regeneração dérmica foi gentilmente cedido pela Integra Life Sciences Corporation. Fontes de fundos de apoio à obra: Este trabalho foi parcialmente financiado pela CIRM-BMBF precoce Translational II Prêmio e do Centro FONDAP para a regulação do genoma, tanto para JTE (Nr 15090007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
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