Summary
प्रत्यक्ष वंश reprogramming के लिए मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं को लक्षित मस्तिष्क की मरम्मत के लिए नए दृष्टिकोण प्रदान करता है. यहाँ हम वयस्क मानव मस्तिष्क प्रांतस्था से मस्तिष्क निवासी pericytes के लिए समृद्ध संस्कृतियों को तैयार करने और Sox2 और Ascl1 कारकों प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित न्यूरॉन्स में इन परिवर्तित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएनएस) में गैर neuronal कोशिकाओं के प्रत्यक्ष वंश reprogramming न्यूरोजेनेसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और इन विट्रो मॉडलिंग या रोगग्रस्त मस्तिष्क की मरम्मत के लिए नई रणनीति के लिए सक्षम हो सकता है. INS में प्रत्यक्ष रूपांतरण करने के लिए उत्तरदायी पहचान मस्तिष्क वासी गैर neuronal सेल प्रकार क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक के भीतर यानी, बगल में इस तरह के एक दृष्टिकोण शुरू करने के लिए अनुमति दे सकते हैं. यहाँ हम इस आधार है कि पूरा वयस्क मानव मस्तिष्क से निकाली गई कोशिकाओं की पहचान करने की कोशिश में विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल शामिल है: वयस्क मानव मस्तिष्क की बायोप्सी से प्राप्त सेरेब्रल कॉर्टेक्स से मानव कोशिकाओं की (1) संवर्धन; (2) इन विट्रो (लगभग 2-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है) विस्तार और immunocytochemistry द्वारा संस्कृति के लक्षण वर्णन और प्रवाह cytometry; (3) विरोधी PDGF रिसेप्टर β और विरोधी CD146 एंटीबॉडी का उपयोग छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा संवर्धन;(4) तंत्रिकाजन्य प्रतिलेखन साथ रेट्रोवायरस की मध्यस्थता पारगमन Sox2 और ascl1 कारकों; (5) और अंत में immunocytochemistry द्वारा परिणामी pericyte व्युत्पन्न प्रेरित न्यूरॉन्स (PdiNs) का लक्षण वर्णन (8 सप्ताह के लिए 14 दिनों के रेट्रोवायरल पारगमन के बाद). इस स्तर पर, आईएनएस पैच दबाना रिकॉर्डिंग से उनके बिजली के गुणों के लिए जांच की जा सकती. इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक मानव INS में मस्तिष्क निवासी pericytes की इन विट्रो वंश रूपांतरण के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की प्रक्रिया में हैं.
Introduction
बदले में भेदभाव क्षमता की अधिकता के साथ संपन्न हो जो प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में दैहिक कोशिकाओं (iPSCs), के reprogramming के लिए विरोध के रूप में, प्रत्यक्ष reprogramming दूसरे में एक विशेष सेल प्रकार के सीधे रूपांतरण के लिए करना है. रोग मॉडलिंग और संभावित सेल आधारित चिकित्सा के संदर्भ में उनके आवेदन के संबंध में, दोनों reprogramming दृष्टिकोण विशिष्ट फायदे और नुकसान है. IPSCs (मैं) में Reprogramming कोशिकाओं का एक लगभग अनंत स्रोत प्रदान करता है; (Ii) जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए अनुमति देता है; (Iii) एक लगभग असीमित भेदभाव की क्षमता के साथ endows. इन कोशिकाओं सेल आधारित चिकित्सा के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं हालांकि, अगर iPSCs के बड़े नुकसान undifferentiated कोशिकाओं (vivo में teratoma गठन) की tumorigenicity और पूर्व vivo खेती और बाद प्रत्यारोपण के लिए जरूरत के जोखिम शामिल. इसके विपरीत, प्रत्यक्ष वंश reprogramming वांछित कोशिकाओं की कम उपज के द्वारा प्रतिबंधित हैशुरू करने से जनसंख्या के लक्षित कोशिकाओं की संख्या के साथ सीधे संबद्ध है, लेकिन वंश reprogrammed कोशिकाओं के प्रत्यारोपण 1,2 पर कोई tumorigenic जोखिम प्रदर्शन करने के लिए दिखाई देते हैं कि लाभ के पास जो; इसके अलावा, प्रत्यक्ष reprogramming भी यानी इन कोशिकाओं को इस प्रकार के प्रत्यारोपण की जरूरत से परहेज की आवश्यकता होगी जहां अंग के भीतर, बगल में प्राप्त किया जा सकता है.
इसे ध्यान में रखते, हमारी प्रयोगशाला neurodegenerative रोगों के सेल आधारित चिकित्सा की दिशा में एक उपन्यास दृष्टिकोण के रूप में भारतीय नौसेना पोत में वंश reprogramming मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं की संभावना का प्रयास किया है. संभावित वंश reprogramming के लिए सेलुलर लक्ष्य के रूप में माना जा सकता है कि ब्रेन निवासी कोशिकाओं अलग macroglia के प्रकार (astrocytes, NG2 कोशिकाओं और oligodendrocytes), microglia, और microvessel जुड़े कोशिकाओं (endothelial कोशिकाओं और pericytes) शामिल हैं. हम बड़े पैमाने पर मस्तिष्क भ्रष्टाचार के अस्थिकणिका की इन विट्रो reprogramming क्षमता का अध्ययन किया हैजल्दी प्रसव के बाद चूहों में 3-5 की टेक्स. वयस्क मानव मस्तिष्क में प्रत्यक्ष वंश reprogramming के लिए इसी तरह उपयुक्त सेल के सूत्रों की खोज में, हम सफलतापूर्वक आईएनएस और pericytes की प्रदर्शनी पहचान में reprogrammed किया जा सकता है कि एक सेल की आबादी का सामना करना पड़ा. यहाँ हम विस्तार और इन विट्रो में इन कोशिकाओं को समृद्ध, और अंततः सफलतापूर्वक में (25-30% की सीमा में) इन में इन विट्रो विस्तार कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा reprogram करने के लिए, वयस्क मानव मस्तिष्क की बायोप्सी से इन कोशिकाओं फसल के लिए की एक प्रोटोकॉल का वर्णन इन. Reprogramming दो प्रतिलेखन कारक, Sox2 और ascl1 के एक साथ रेट्रोवायरस की मध्यस्थता सह अभिव्यक्ति के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. ये PdiNs दोहराव कार्रवाई संभावित फायरिंग की क्षमता हासिल करने के लिए और तंत्रिका नेटवर्क में एकीकृत करने की उनकी क्षमता का संकेत अन्य न्यूरॉन्स के लिए के रूप में synaptic लक्ष्य की सेवा के लिए पाए गए. हमारे प्रोटोकॉल INS में वयस्क मानव मस्तिष्क pericytes का अलगाव और वंश रूपांतरण के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रदान करता है.
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Protocol
1. अलगाव और वयस्क मानव मस्तिष्क की कोशिकाओं के संवर्धन
मानव ऊतक से जुड़े प्रयोगों अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मानव सामग्री के उपयोग के संबंध में सभी संबंधित सरकारी और संस्थागत नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए. वर्तमान प्रोटोकॉल LMU म्यूनिख के मेडिकल संकाय की नैतिक समिति और सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति से अनुमोदन के अनुसार विकसित किया गया था.
मानव वयस्क सेरेब्रल कॉर्टेक्स की तैयारी संस्कृतियों के इस प्रोटोकॉल का टेम्पोरल लोब मिर्गी या अन्य गहरे बैठा गैर दर्दनाक, गैर घातक घावों से पीड़ित दोनों लिंगों के रोगियों का नमूना का उपयोग कर स्थापित किया गया है. इसलिए मस्तिष्क घाव करने के लिए उपयोग चैनल विशेष रूप से शामिल शल्य कक्ष से प्राप्त की है और ऊतक स्वस्थ माना जाता है. रोगियों की आयु सीमा 19-70 साल थी.
- गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम जोड़कर विकास मध्यम तैयारGlutaMAX साथ DMEM उच्च ग्लूकोज (एफसीएस) 20% FCS के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. 500 मिलीलीटर मध्यम विकास के कुल 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें. यह और एक उपयुक्त लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता के बाद के सभी चरणों को पूरा करें.
- 2 CaCl और प्रसंस्करण तक बर्फ पर HEPES (10 मिमी अंतिम एकाग्रता) सहित 2 MgCl (HBSS) मध्यम के साथ हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल में शल्य कक्ष से प्राप्त वयस्क मानव मस्तिष्क की बायोप्सी रखें. जितनी जल्दी हो सके प्रसंस्करण शुरू करो.
- एक 65 मिमी पेट्री डिश में ऊतक स्थानांतरण और दो बाँझ एकल उपयोग नलियां का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में कीमा, एकल कक्षों में हदबंदी शुरू करने के लिए. Enzymatic पाचन के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 3-6 मिलीलीटर TrypLE का उपयोग करें और एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं.
- हदबंदी की सुविधा के लिए prewarmed मध्यम विकास के 1 मात्रा जोड़ें और धीरे पहले का उपयोग करके ऊपर और नीचे ऊतक टुकड़े युक्त समाधान triturateसेल निलंबन के homogenization तक एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर के बाद एक 5 मिलीलीटर डिस्पोजेबल पिपेट,. आमतौर पर, ज्यादातर सफेद पदार्थ से मिलकर कुछ अवशिष्ट ऊतक टुकड़े, निलंबन में रहेगा.
- 5 मिनट के लिए 157 XG पर स्पिन और मध्यम विकास की उचित राशि (uncoated T75 संस्कृति फ्लास्क प्रति 10 मिलीलीटर) में गोली resuspend. आकार में 5-10 मिमी व्यास की एक बायोप्सी के लिए एक T75 संस्कृति कुप्पी का प्रयोग करें और बड़ा नमूनों के मामले में इस से एक्सट्रपलेशन.
- 5% सीओ 2 और 5% 2 हे के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखें.
- कोशिकाओं confluency तक पहुँच चुके हैं, जब तक हर 3-4 दिनों मध्यम के आधे की जगह. यह आमतौर पर (बीतने 0 [P0] के रूप में) दो सप्ताह तक लग जाते हैं.
वयस्क मानव मस्तिष्क की कोशिकाओं के 2. इन विट्रो विस्तार और विशेषता
- इन विट्रो विस्तार में:
- संस्कृति के माध्यम Aspirate और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोने, कक्ष टी में रखाemperature, 3 मिलीग्राम TrypLE जोड़ने से पहले.
- कक्षों की सबसे अलग जब तक 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. धीरे कोशिकाओं के उठाने की सुविधा के लिए बोतल नल; मध्यम विकास के 3 खंडों के अलावा के बाद, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 157 XG पर नीचे स्पिन और मध्यम विकास की उचित मात्रा में कोशिकाओं resuspend.
- बीतने नई T75 सेल संस्कृति बोतल में इष्टतम उपज के लिए 01:03 के अनुपात में कोशिकाओं.
नोट: हम कम reprogramming दक्षता के किसी भी लक्षण के बिना P5 जब तक इन कोशिकाओं passaged है. संस्कृति endothelial कोशिकाओं के एक काफी अंश (CD34 अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन के रूप में) शामिल P0 में हालांकि, बाद के मार्ग पर उनकी संख्या नगण्य हो जाता है.
- वयस्क मानव मस्तिष्क संस्कृतियों की विशेषता:
- Immunocytochemistry:
- पाली डी lysine लेपित गिलास को कवर पर कोशिकाओं, बीज ~ 60,000 कोशिकाओं की विशेषता के 500 μl ताजा वृद्धि mediu में निकल जाता है24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में एम और 5% सीओ 2 और 5% 2 हे के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- सुसंस्कृत मानव मस्तिष्क की कोशिकाओं के Immunocytochemical विश्लेषण के लिए मध्यम हटाने और पीबीएस के 1 एमएल के साथ 3x धो लो.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 500 μl जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें.
- गिलास को कवर एक उपयुक्त humidified धुंधला चैम्बर में चले जाते स्थानांतरण और 80 μl पीबीएस कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम albumin (BSA) और 0.5% ट्राइटन X-100 को रोकने के साथ ब्लॉक.
- एक ही समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने कारकों विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस या 1 घंटे में रातोंरात सेते हैं.
नोट: संवर्धन के इस स्तर पर कोशिकाओं का एक बड़ा लेकिन अलग अंश (PDGFRβ) प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर β के लिए immunoreactive हैं, भेदभाव 146 (CD146), NG2 chondroitin सल्फेट Proteo के क्लस्टरglycan, और चिकनी पेशी actin (SMA), microvessel जुड़े pericytes की विशेषता यानी मार्करों. केवल एक अल्पसंख्यक (<1%) astroglial मार्कर glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और S100β व्यक्त करते हैं. इसके अलावा, इस स्तर पर संस्कृति neuronal मार्कर βIII ट्यूबिलिन व्यक्त किसी भी कोशिकाओं से रहित होना चाहिए. विभिन्न मार्करों के सह लेबलिंग के लिए कई प्राथमिक एंटीबॉडी संयोजनों का प्रयोग करें. Glial, neuronal, endothelial और pericyte मार्करों की अभिव्यक्ति के आगे की पुष्टि रिवर्स प्रतिलेखन और (इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं) मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. - साथ ऊष्मायन के बाद प्राथमिक एंटीबॉडी 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धोने और धुंधला समाधान करने के लिए (उपयुक्त dilutions में) इसी माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3X धो लें. यदि आवश्यक हो, पूर्व बढ़ते करने के लिए कमरे में 5 मिनट के लिए DAPI के साथ धुंधला हो जाना शामिलतापमान.
- बढ़ते मध्यम antifading का प्रयोग करें और एक epifluorescence माइक्रोस्कोप या एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर कवर फिसल जाता है विश्लेषण.
- प्रवाह cytometry:
- प्रवाह cytometry का उपयोग सतह मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए, uncoated T25 या T75 सेल संस्कृति बोतल में confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित.
- पीबीएस + 0.5% बीएसए से मिलकर धुंधला समाधान में पहले और resuspend के रूप में वर्णित TrypLE का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग. धुंधला प्रतिक्रिया प्रति, धुंधला समाधान के 100 μl में 100,000-200,000 कोशिकाओं resuspend. (CD146-FITC, CD140b पीई, CD34-APC, CD13-FITC, संबंधित निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी) का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी प्रति एक धुंधला प्रतिक्रियाओं को तैयार है.
- सीधे सेल निलंबन में (dilutions विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें) प्रत्येक धुंधला समाधान के लिए fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- 500 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और प्रत्येक के बीच नीचे स्पिन5 मिनट के लिए 157 XG पर धोने कदम.
- FACS ट्यूबों के लिए एक सेल झरनी (70 माइक्रोन) के माध्यम से 0.5-1 एमएल धुंधला समाधान और स्थानांतरण की कोशिकाओं में सेल गोली Resuspend. प्रकाश के संपर्क से नमूना सुरक्षित रखें.
- पूर्व FACS साधन में उन्हें रखने के लिए भंवर नमूने.
- जीवित कोशिकाओं का विश्लेषण और मलबे और सेल समुच्चय, FSC-A के लिए गेट और एसएससी एक बाहर करने के लिए. सेल duplets विशेष रूप से FSC एक और FSC-W से बाहर gated हैं. संबंधित fluorochrome संयुग्मित निर्धारण से मिलान एंटीबॉडी नियंत्रण के साथ फाटकों सेट कोशिका की सतह मार्करों के लिए सही gating की स्थिति निर्धारित करने के लिए. तब प्रतिरक्षी बाध्य कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण.
- Immunocytochemistry:
छंटनी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए 3. संवर्धन
- FACS एक 70 माइक्रोन नोक का उपयोग छँटाई के माध्यम से पिछले पारगमन के लिए (मध्यम विकास में resuspended) pericyte सेल आबादी शुद्ध. सी के साथ संयोजन में CD34-एपीसी का प्रयोग करेंD140b पीई और CD146-FITC pericytes के लिए चयन करने के लिए. CD34 नकारात्मक, CD140b, और CD146 पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए क्रमबद्ध.
- 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में निकल जाता पाली डी lysine लेपित गिलास को कवर पर मध्यम विकास और थाली में हल कोशिकाओं लीजिए और 5% सीओ 2 और 5% 2 हे के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- छंटाई के बाद 48 घंटे ताजा मध्यम विकास के साथ मध्यम जगह और प्रोटोकॉल 4 में वर्णित के रूप में पारगमन करते हैं.
4. रेट्रोवायरल pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के पारगमन और प्रेरित न्यूरॉन्स में Reprogramming
नोट: रेट्रोवायरल कणों से निपटने जब स्थानीय जैव सुरक्षा दिशा निर्देशों को देखें. जर्मनी में यहां कार्यरत रेट्रोवायरस का उपयोग जैव सुरक्षा स्तर 2 की आवश्यकता होती है. रेट्रोवायरल कणों का उत्पादन प्रोटोकॉल 6 का संदर्भ लें. Reprogramming के लिए इस्तेमाल किया रेट्रोवायरल निर्माणों के लिए, Karow एट अल का संदर्भ लें. (2012). रेट्रोवायरस VSV जी (vesicular stomatitis वायरस glyco साथ छद्म थेप्रोटीन) 5. उत्पादन के लिए Gavrilescu एट अल 6 को देखें.
- पूर्व पाली डी lysine लेपित गिलास को कवर पर रेट्रोवायरल पारगमन बीज ~ 60,000 कोशिकाओं को 24 घंटे 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में 500 μl ताजा मध्यम विकास में निकल जाता है और 5% सीओ 2 और 5% 2 हे के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते .
- अगले दिन, 500 μl ताजा, prewarmed मध्यम विकास के साथ मध्यम विकास की जगह और रेट्रोवायरल कणों (नियंत्रण के लिए pCAG-IRES-dsred, विशेष रूप से प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान), pCAG-ascl1 युक्त संबंधित केंद्रित supernatants की 1 μl जोड़ने pCAG-Sox2-IRES GFP,-IRES-dsred.
- एक दिन बाद, कोशिकाओं से वायरल कणों सहित मध्यम हटाने और ताजा 1 मिलीलीटर जोड़ने, GlutaMAX साथ 49 मिलीलीटर DMEM उच्च ग्लूकोज और 1 मिलीलीटर B27 सीरम मुक्त पूरक की रचना की, B27-भेदभाव मध्यम prewarmed. 5 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने% सीओ 2 और आईएनएस परिपक्व के रूप में दोहराव मध्यम परिवर्तन हानिकारक हो जाते हैं मध्यम बदलने के बिना 4-8 सप्ताह के लिए 5% 2 हे.
Immunocytochemistry से प्रेरित न्यूरॉन्स की 5. विशेषता
- Transduced कोशिकाओं के सेलुलर पहचान निर्धारित करने के लिए, एक neuronal phenotype के अधिग्रहण को प्रदर्शित करने के लिए विशेष रूप से, विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें, एंटीबॉडी और उनके संबंधित dilutions के लिए (जैसे bIII ट्यूबिलिन, MAP2, और NeuN के रूप में neuronal एंटीजन के खिलाफ immunocytochemistry प्रदर्शन और उपकरण, 2.2.1 में संकेत के रूप में) एक ही प्रक्रिया का पालन करें.
- E14 माउस मस्तिष्क cortices से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के साथ PdiNs, सह संस्कृति इन कोशिकाओं की परिपक्वता में सुधार लाने के लिए. यह अंत करने, प्रमस्तिष्क प्रांतस्था काटना और एक आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक के साथ यंत्रवत् ऊतक अलग कर देना. Sox2 और ascl1 एन्कोडिंग फिर से साथ पारगमन निम्नलिखित pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं 2-3 सप्ताह की संस्कृतियों के लिए 10,000-50,000 murine न्यूरॉन्स जोड़ेंtroviruses और संवर्धन जारी है. Transduced कोशिकाओं लाइव epifluorescence द्वारा या GFP और dsRed के लिए immunocytochemistry निम्नलिखित, या तो उनके रिपोर्टर (GFP और dsRed) अभिव्यक्ति द्वारा murine न्यूरॉन्स से प्रतिष्ठित किया जा सकता.
- , Murine न्यूरॉन्स द्वारा PdiNs पर synapses के गठन का आकलन इस तरह vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (vGluT1) के रूप में vesicular neurotransmitter रिसेप्टर्स के खिलाफ immunocytochemistry प्रदर्शन करने के लिए.
- उनके बिजली के गुणों (कार्रवाई क्षमता पैदा करने की यानी क्षमता) और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा कार्यात्मक synapses की स्थापना के लिए transduced कोशिकाओं जांच. प्रक्रिया की जानकारी के लिए हेनरिक एट अल. (2011).
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के बाद सफलतापूर्वक मानव वयस्क सेरेब्रल कॉर्टेक्स के एक नमूना से एक संस्कृति की स्थापना के पहले परिणाम संस्कृति के सेलुलर संरचना की पहचान करने में शामिल है. सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन के लिए Immunocytochemistry विभिन्न रोगियों (चित्रा 1 ए) के नमूना से व्युत्पन्न संस्कृतियों के बीच विविधता का एक काफी डिग्री का पता चलता है. प्रवाह द्वारा मात्रा के रूप में cytometry (औसतन ~ 75%, 30 से 99% को लेकर) PDGFRβ व्यक्त कि कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा हमेशा वहाँ है; ऐसे CD146, NG2 और CD13 के रूप में pericytes के अन्य मार्करों आम तौर पर एक कम रेंज (चित्रा 1 बी) में व्यक्त कर रहे हैं. Immunocytochemistry (चित्रा 1 ए) द्वारा निर्धारित रूप में इसी तरह SMA, संवर्धित कोशिकाओं की एक नाबालिग subpopulation में व्यक्त किया जाता है. पारित होने के 0 (P0) में, <आमतौर पर CD34 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं के 10% कर रहे हैं, और उनकी संख्या आगे passaging के साथ पता लगाने के नीचे गिरावट आती है. इसी तरह, astrocytतों पहले अंश में केवल एक नगण्य संदूषण शामिल. इसके अलावा, तंत्रिका स्टेम सेल, neuronal, या oligodendrocyte मार्करों के लिए दाग नहीं है कि कोशिकाओं को आम तौर पर कर रहे हैं. Immunocytochemical और डेटा प्रवाह cytometry पूरी तरह से मात्रात्मक RT-पीसीआर 7 से मंडित कर रहे हैं. संक्षेप में, संस्कृति के भीतर सबसे बड़ा अंश प्रोटीन और pericytes की mRNAs विशेषता व्यक्त करता है. Pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए एक और संवर्धन इस स्तर पर FACS द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. PDGFRβ अभिव्यक्ति के स्तर से परिलक्षित के रूप में संस्कृति की पवित्रता स्पेक्ट्रम के निचले सिरे पर है जब यह विशेष रूप से प्रासंगिक है. कारकों के आधार पर क्रमबद्ध विशेष रूप से pericytes (चित्रा 1C) के लिए, किसी भी CD34 पॉजिटिव contaminants को छोड़कर इस प्रकार, जबकि हम PDGFRβ के खिलाफ एक एंटीबॉडी (CD140b) अकेले या एक विरोधी CD146 एंटीबॉडी के साथ संयोजन में उपयोग किया है.
केवल एक पत्रकार जीन एन्कोडिंग नियंत्रण वायरस के साथ इन संस्कृतियों transducing, उनके मार्कर अभिव्यक्ति पी में परिवर्तन नहीं करताrofile इन कोशिकाओं pericyte वंश में रहना यह दर्शाता है कि (पारगमन निम्नलिखित 3-4 सप्ताह में मूल्यांकन). इसी तरह, अकेले Sox2 की रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति आकारिकी में किसी भी प्रकट परिवर्तन में परिणाम और न ही अकेले Sox2 एक भाग्य रूपांतरण के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं है, सुझाव है कि bIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति लाती नहीं है. इसके विपरीत, कोशिकाओं की एक कम प्रतिशत (लगभग 10%) हालांकि एक neuronal आकारिकी प्राप्त करने के बिना, एक ascl1 एन्कोडिंग रेट्रोवायरस अकेले प्रदर्शनी βIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति के साथ transduced. आश्चर्यजनक ढंग से, सभी Sox2 और ascl1-cotransduced कोशिकाओं का लगभग 50% βIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति दिखाने के लिए और भी अधिक महत्वपूर्ण बात, (उनके डबल संवाददाता अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना) इन डबल transduced कोशिकाओं का एक तिहाई भी चित्रा (2) neuronal प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. Neuronal सुविधाओं के अधिग्रहण के साथ साथ, PDGFRβ की अभिव्यक्ति 7 नीचे विनियमित है. संस्कृति में आगे परिपक्वता के साथ, Sox2 और ascl1-coexpressing कोशिकाओं को भी Immun बन(मुख्य रूप से neuronal सेल निकायों धुंधला) अधिक परिपक्व neuronal मार्कर (वृक्ष के समान प्रक्रियाओं धुंधला) MAP2 और NeuN लिए oreactive. मार्कर अभिव्यक्ति में इन परिवर्तनों से नीचे के रूप में चर्चा भी न्यूरॉन्स की electrophysiological पहचान के अधिग्रहण के साथ सहसंबंधी. संक्षेप में, इन आंकड़ों PdiNs के रूप में भेजा INS में pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रत्यक्ष भाग्य रूपांतरण, के लिए सबूत प्रदान करते हैं. ये PdiNs भ्रूण माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के न्यूरॉन्स के साथ coculture प्रयोगों में पता चला कार्यात्मक postsynaptic डिब्बों की स्थापना के लिए क्षमता के अधिकारी. इस क्षमता synaptic आदानों की उपस्थिति (नीचे चर्चा देखें) के रूप में अच्छी तरह से (vesicular neurotransmitter ट्रांसपोर्टरों, जैसे vGluT1 immunoreactivity के समूहों द्वारा विशेषता) सह सुसंस्कृत न्यूरॉन्स से व्युत्पन्न presynaptic टर्मिनलों के साथ PdiNs के वृक्ष के समान प्रक्रियाओं की सजावट में electrophysiologically का प्रदर्शन किया जा सकता है. इन आंकड़ों आगे neuronal ग में एकीकृत करने PdiNs की क्षमता का संकेतircuits.
चित्रा 1. वयस्क मानव मस्तिष्क प्रांतस्था से व्युत्पन्न संस्कृतियों में pericyte मार्कर की विषम अभिव्यक्ति. ए) immunocytochemistry से पता चला pericyte मार्कर (PDGFRb, SMA, CD146) की विषम अभिव्यक्ति illustrating फ्लोरोसेंट micrographs. स्केल बार = 50 माइक्रोन. बी) हिस्टोग्राम अलग रोगी व्युत्पन्न संस्कृतियों का फ्लो द्वारा निर्धारित रूप में pericyte मार्करों PDGFRβ (CD140b), CD13, और CD146 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के सापेक्ष संख्या का सार. CD34 endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है. बाद reprogramming के लिए लाल बॉक्स से प्रकाश डाला डबल सकारात्मक pericytes () की छंटाई के लिए निर्धारण नियंत्रण और CD146 / CD140b से सना हुआ मानव कोशिकाओं चित्रण सी) FACS डॉट भूखंडों. उच्च PDGFRβ अभिव्यक्ति की दर और नोटइस विशेष संस्कृति में CD146 अभिव्यक्ति के संबंध में विविधता.
. प्रयोगात्मक सेट अप:. INS शीर्ष में वयस्क मानव pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के चित्रा 2 Reprogramming. नीचे: retrovirus एन्कोडिंग Sox2-IRES-GFP और ascl1-IRES-DsRed साथ transduced कोशिकाओं चित्रण फ्लोरोसेंट micrographs. केवल डबल transduced कोशिकाओं (तीर) bIII ट्यूबिलिन (सही पैनल) व्यक्त और neuronal आकारिकी है कि प्रदर्शन के नोट.
| कोशिका विभाजन [%] | कोशिका मृत्यु [%] | bIII ट्यूबिलिन + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
निरंतर रहते इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन के रूप में PdiNs में रूपांतरण के दौर से गुजर pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं की तालिका 1. व्यवहार. Sox2 और Ascl1 कोशिकाओं बाहर निकलने सेल चक्र सह व्यक्त ध्यान दें. इसके अलावा, Ascl1 या Sox2 और Ascl1-Coexpression निम्नलिखित कोशिका मृत्यु की उच्च दर को ध्यान दें. खाते में इन विशिष्ट सेलुलर घटनाओं ले रहा है, सब सह transduced कोशिकाओं का लगभग 25% भारतीय नौसेना पोत बन जाते हैं.
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में इन विट्रो विस्तार और संवर्धन pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के वयस्क मानव मस्तिष्क प्रांतस्था से अलगाव के बाद और तंत्रिकाजन्य प्रतिलेखन के रेट्रोवायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति द्वारा आईएनएस में बाद में रूपांतरण Sox2 और Ascl1 कारकों का वर्णन करता है. इस तरह के प्रोटोकॉल अंततः वयस्क मस्तिष्क के vivo सेटिंग में इस प्रत्यक्ष रूपांतरण दृष्टिकोण अनुवाद करने के लिए मन में लक्ष्य के साथ, संभावित भी glia न्यूरॉन्स में मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं के वंश रूपांतरण और अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक प्रयोगात्मक प्रदान करता है.
तकनीकी कारणों से
हमारे अध्ययन में हम दोनों लिंगों से, 19 और 70 वर्ष के बीच आयु वर्ग के रोगियों से मानव मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग किया. हम लिंग या उम्र 7 के आधार पर reprogramming दक्षता में एक खुला अंतर नोटिस नहीं किया था. यह फिर भी अधिक सूक्ष्म अंतर फिर भी हो सकता है के रूप में इस जानकारी दस्तावेज़ की सिफारिश की हैहमारे ध्यान से बच कि मनाया.
यह आगे प्रयोगशाला में ऊतक के नमूने का स्थानांतरण निम्नलिखित के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रोसेसिंग शुरू करने की सिफारिश की है. ऊतक प्रयोगवादी करने के लिए स्थानांतरण करने से पहले शल्य चिकित्सा कक्ष में बनी हुई है कितनी देर के लिए जरूरी कुछ अज्ञात हो जाएगा. हम संवर्धन प्रक्रिया के शुरू करने के लिए रोगी के मस्तिष्क से हटाने के बीच का समय 7 हमारे अध्ययन में नमूने बर्फ पर हर समय रखा जा रहा है, के साथ 2-6 के बीच घंटा लेकर अनुमान है कि. बाद के प्रसंस्करण और न ही किसी भी प्रतिकूल परिणाम के आराम में कोई प्रकट अंतर इस समय खिड़की के भीतर देखा गया.
किसी भी प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण मूल्यांकन अपनी सादगी, reproducibility, और दक्षता का सवाल है. वर्तमान प्रोटोकॉल एक पहले चरण में कोशिकाओं के दौरान उस में सीधा है दो प्रतिलेखन एफए केवल का उपयोग सेल reprogramming के एक दूसरे चरण के बाद आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, जो एक सस्ता माध्यम है, में विस्तार कर रहे हैंएक परिभाषित माध्यम में ctors और संवर्धन.
Reproducibility के बारे में, हम रेट्रोवायरस तैयारी की गुणवत्ता अक्सर reprogramming की विफलता में जिसके परिणामस्वरूप उच्च टिटर वायरस के संक्रामक कणों की संख्या से मिलान करने के dilutions पर इस्तेमाल कम अनुमापांक वायरस तैयारी के साथ, अत्यंत महत्व का है कि मनाया. वास्तव में हम उच्च टिटर वायरस का उपयोग करते समय reprogramming पहले से विफल रहा था जिसमें एक ही pericyte संस्कृति सफलतापूर्वक INS में परिवर्तित किया जा सकता है उल्लेख किया.
रूपांतरण की क्षमता के बारे में, हम निरंतर रहते इमेजिंग का उपयोग Sox2 और ascl1-cotransduced कोशिकाओं से व्युत्पन्न βIII ट्यूबिलिन पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या का आकलन किया है. लाइव इमेजिंग उत्पन्न इन की संख्या केवल प्रयोग के अंत बिंदु पर निर्धारित किया जाता है, जब इस तरह की जानकारी की कमी है, जबकि रूपांतरण की प्रक्रिया के दौरान कोशिका विभाजन या कोशिका मृत्यु से गुजरना है कि कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. वास्तव में समय व्यतीत हो वीडियो माइक्रो का उपयोगनकल यह untransduced और एकल कारक transduced कोशिकाओं Sox2 और ascl1-cotransduced कोशिकाओं के तेजी से सेल चक्र से बाहर निकलें, जबकि proliferating जारी रखने देखा गया है कि (प्रक्रिया के लिए ओर्टेगा ई टी अल. 8 को देखें). इसके अलावा, बाद आबादी का एक महत्वपूर्ण अंश कोशिका मृत्यु आए. रेट्रोवायरस विषाक्तता औपचारिक रूप से हमारे अध्ययन 7 में प्राप्त आंकड़ों से बाहर नहीं जा सकता है ascl1 (लड़का या Sox2 साथ संयोजन में) व्यक्त की गई थी, केवल जब बढ़ कोशिका मृत्यु तथ्य यह है कि मनाया गया, हम सेल भाग्य की एक भयावह संघर्ष के लिए सबूत के रूप में इस व्याख्या . खाते में इन दो घटनाओं ले रहा है, हम सब Sox2 और ascl1-cotransduced कोशिकाओं के 25% bIII ट्यूबिलिन सकारात्मक इन्स (1 टेबल) में परिवर्तित कि अनुमान है.
सह पारगमन बिल्कुल सफल reprogramming के लिए आवश्यक है के रूप में, एक ही समय में दोनों कारकों व्यक्त कोशिकाओं की राशि का अनुकूलन करने के लिए एक वायरल वेक्टर एन्कोडिंग दोनों जीनों काम पर विचार कर सकते हैंसमय.
हाल ही में, Ladewig एट अल. ग्लाइकोजन सिंथेज़ kinase पर 3β के छोटे अणु आधारित निषेध का उपयोग और SMAD 9 संकेत से 200% की उपज प्राप्त करने के लिए भारतीय नौसेना पोत में fibroblasts के कुशल रूपांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है. यह हमारे प्रोटोकॉल के लिए इन Add-ons PdiN उत्पादन की उपज में सुधार के लिए कि क्या यह निर्धारित करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा.
Reprogramming प्रक्रिया का लाइव इमेजिंग के एक और दिलचस्प परिणाम INS में वयस्क मानव pericytes का रूपांतरण माउस मूल 4 के विभिन्न दैहिक कोशिकाओं की संस्कृतियों में समान reprogramming प्रोटोकॉल की तुलना में एक अपेक्षाकृत धीमी गति पर होता है कि इस तथ्य से संबंधित है. यह मानव न्यूरॉन्स 10 की विशेषता धीमी परिपक्वता के साथ संगत है.
हम व्यवस्थित PdiN उत्पादन की उपज पर ऑक्सीजन तनाव के प्रभाव का विश्लेषण नहीं किया है, हम उल्लेख किया है कि आम तौर पर कम ऑक्सीजन की स्थिति (5%) में ऊष्मायनnormoxic शर्तों (21%) में संवर्धन कोशिकाओं की तुलना में बेहतर परिणाम दे दी है. हाल ही में, Davila एट अल. मानव fibroblasts 11 से भारतीय नौसेना पोत के शामिल होने के लिए कम ऑक्सीजन तनाव से एक समान बढ़ाने के प्रभाव का वर्णन किया.
अन्य प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रोटोकॉल inducible lentiviral वैक्टर 1, 12, 13 कार्यरत है, जबकि हमारे प्रोटोकॉल Sox2 और ascl1 की रेट्रोवायरल वितरण पर आधारित है. हाल ही में हम भी सफलतापूर्वक Sox2 और Ascl1 अभिव्यक्ति का एक अपेक्षाकृत कम नाड़ी (10 दिन) pericyte करने वाली न्यूरॉन रूपांतरण के कारण पर्याप्त संकेत है कि, Sox2 और ascl1 एन्कोडिंग डॉक्सीसाइक्लिन-inducible lentiviral निर्माणों आवेदन किया है. हमारे अध्ययन 7 में इस्तेमाल किया रेट्रोवायरस कम 5 मुंह बंद करने के लिए डिजाइन किए गए थे. तदनुसार, हम पत्रकार जीन अभिव्यक्ति से रहित न्यूरॉन्स की उपस्थिति ध्यान नहीं दिया. हालांकि, संभावना है कि transgene दोनों के समग्र अभिव्यक्ति के स्तरसमय खत्म हो चुका है और रिपोर्टर परिवर्तन से बहिष्कृत नहीं किया जा सकता. (सेंडाइ वायरस का उपयोग) एकता से मुक्त दृष्टिकोण हाल ही में प्रेरित तंत्रिका progenitors 14 की पीढ़ी के मामले में नियोजित किया गया है, लेकिन यह वर्तमान में इस या भी वायरस मुक्त reprogramming रणनीतियों को सफलतापूर्वक मानव pericytes कन्वर्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है कि क्या ज्ञात नहीं है. अंत में, अन्य ऊतकों से निकाली गई pericytes प्रेरित तंत्रिका प्रकार की कोशिकाओं में रूपांतरण से गुजरना कर सकते हैं कि क्या परीक्षण किया जाना बना रहता है.
वैचारिक विचार
INS में दैहिक कोशिकाओं के reprogramming का एक महत्वपूर्ण परिणाम उनकी कार्यक्षमता 15 से संबंधित है. हम reprogramming प्रक्रिया की शुरुआत को निम्नलिखित अलग समय बिंदुओं पर PdiNs के electrophysiological गुणों का आकलन किया है. बहुत ही प्रारंभिक अवस्था में, रेट्रोवायरल पारगमन निम्नलिखित यानी 2 सप्ताह, इस स्तर पर βIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति के बावजूद बिजली के excitability के PdiNs प्रदर्शनी मुश्किल से संकेत,. इस प्रकार, का सबसेelectrophysiological विश्लेषण Sox2 और ascl1 साथ पारगमन निम्नलिखित 4-8 सप्ताह का आयोजन किया गया. Karow एट अल. में वर्णित के रूप में उच्च इनपुट resistances और कार्रवाई संभावित गोलीबारी के एक कम आवृत्ति से परिलक्षित के रूप में, PdiNs काफी अपरिपक्वता की विशेषता है. इसके अलावा परिपक्वता माउस E14 सेरेब्रल कॉर्टेक्स से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के साथ सह संवर्धन PdiNs द्वारा पदोन्नत किया जा सकता है. इन शर्तों के तहत, PdiNs उच्च कार्य क्षमता आवृत्तियों और बढ़ सोडियम धाराओं 7 दिखा रहे हैं. इसके अलावा, coculturing माउस न्यूरॉन्स से कार्यात्मक synaptic इनपुट प्राप्त करने के लिए PdiNs की क्षमता का पता चलता है. संक्षेप में, PdiNs आगे अन्य न्यूरॉन्स के साथ coculturing पर बढ़ाया जा सकता है कार्यात्मक neuronal संपत्तियों के अधिग्रहण. हालांकि, यह PdiNs भी कार्यात्मक presynaptic डिब्बों स्थापित कर सकते हैं कि क्या दिखाया जाना बना रहता है. मस्तिष्क में PdiNs रोपाई आगे पढ़ाई पूरी परिपक्वता और कार्यक्षमता तक पहुंचने के लिए अपनी क्षमता प्रकट करने के लिए आवश्यक हैं.
यूहम परिणामस्वरूप PdiNs GABAergic न्यूरॉन्स 7 की सुविधाओं के अधिग्रहण उल्लेखनीय है कि reprogramming कारकों के रूप में Sox2 और ascl1 गाते हैं. दिलचस्प है, अन्य समूहों के विकास के लिए भारतीय नौसेना पोत एक ऐसी glutamatergic, डोपामिनर्जिक, और cholinergic फेनोटाइप 1, 16-18 के रूप में अलग neurotransmitter विनिर्देश हासिल कर ली है कि परिणाम के साथ अलग प्रतिलेखन कारक और / या microRNA संयोजनों के उपयोग से भारतीय नौसेना पोत में fibroblasts कन्वर्ट करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है. यह fibroblasts में इस्तेमाल किया कारक संयोजन PdiNs में यही ट्रांसमीटर पहचान प्रेरित है कि क्या परीक्षण किया जाना बना रहता है. इसके अलावा, हाल ही में काम तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 19, 20 या glial, विशेष oligodendrocytes में 21, 22 उत्पन्न करने के लिए न्यूरोजेनेसिस परे रूपांतरण स्पेक्ट्रम का विस्तार किया गया. इन reprogramming प्रोटोकॉल वयस्क मानव मस्तिष्क pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं में एक समान परिणाम बटोर हैं, यह बहुत इस आयात के आवेदनों की चित्रमाला चौड़ा होगाचींटी मस्तिष्क निवासी सेल प्रकार.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उसे इनपुट के लिए डॉ. मागदालेना Götz के लिए आभारी हैं. हम उदारता Sox2 कोडन अनुक्रम के साथ हमें प्रदान करने के लिए डा. मरियस Wernig (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी वायरस उत्पादन के लिए डॉ. एलेक्जेंड्रा Lepier के लिए बहुत आभारी हैं. यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 इ) और BMBF (01GN1009A) बी बी के लिए, और विज्ञान के Bavarian राज्य मंत्रालय, अनुसंधान और एम.के. और BBCs को कला Binational SYSTHER से प्राप्त धन का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया INREMOS वर्चुअल संस्थान (शिक्षा और अनुसंधान के जर्मन और स्लोवेनियाई संघीय मंत्रालयों) और DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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