Summary
Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l'analisi di piccole molecole è descritto.
Abstract
La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l'omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio 1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all'interno fette intatto di campioni di tessuti biologici 1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l'acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l'analisi e l'identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.
Introduction
Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling 4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro 11. MALDI-MSI consente per l'analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi 12,13 e perfino singole cellule 14,15.
La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzione di immagini spettrali di massa riproducibili e affidabili. La qualità delle immagini dipende molto da fattori come il tessuto mezzo di inclusione, spessore di strato, matrice MALDI e tecnica di applicazione matrice. Per applicazioni di imaging, spessore della sezione ideale è la larghezza di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di campione). MALDI richiede deposizione di un organico, crystallinpreparato a matrice e, tipicamente un acido debole, sul campione per assistere l'ablazione analita e ionizzazione. 16 differenti matrici forniscono diverse intensità di segnale, ioni interferenti, e l'efficienza di ionizzazione di diverse classi di composti.
La tecnica di applicazione matrice gioca anche un ruolo nella qualità delle immagini di spettri di massa e tecniche diverse è adatto per diverse classi di analiti. Tre modalità applicative matrice vengono presentati in questo protocollo: aerografo, spruzzatore automatico, e la sublimazione. Applicazione matrice aerografo è stato ampiamente utilizzato nella diagnostica per immagini MALDI. Il vantaggio dell'applicazione matrice aerografo è che è relativamente semplice e veloce. Tuttavia, la qualità dell'applicazione matrice aerografo dipende fortemente dall'abilità dell'utilizzatore e tende ad essere meno riproducibile e provocare la diffusione di analiti, in particolare piccole molecole 17. Sistemi di spruzzatore automatici devono meccanici simili a aerografo applicazione della matrice, ma have sviluppato per rimuovere la variabilità visto con applicazione aerografo manuale, rendendo lo spray più riproducibile. Questo metodo può essere a volte più in termini di tempo di applicazione matrice aerografo tradizionale. Sia aerografo manuale e sistemi di spruzzatore automatici sono metodi di applicazione della matrice a base di solventi. Sublimazione è una tecnica di applicazione matrice secca che sta diventando sempre più popolare per l'imaging spettrale di massa dei metaboliti e piccole molecole perché riduce analita diffusione, tuttavia, manca la necessaria solvente per estrarre e osservare composti massa superiore 18.
Individuazione Fiducioso di metaboliti in genere richiede misurazioni di massa accurata avere identificazioni putativi seguiti da massa tandem (MS / MS) esperimenti di convalida con MS / MS spettri di essere rispetto agli standard, la letteratura, o spettri teorici. In questo protocollo alta risoluzione (massa potenza di 60.000 m / z 400 risoluzione), cromatografia liquida (LC)-MS è accoppiato MALDI-MSI per ottenere sia informazioni spaziali e identificazioni sicure di metaboliti endogeni, utilizzando Medicago truncatula radici e noduli radicali come il sistema biologico. Esperimenti MS / MS possono essere eseguite direttamente sul tessuto con MALDI-MSI o su estratti di tessuto con LC-MS e utilizzati per la validazione delle identificazioni dei metaboliti.
Questo protocollo fornisce un metodo semplice per mappare metaboliti endogeni in M. truncatula, che può essere adattato e applicato al MSI di piccole molecole in vari tipi di tessuto e sistemi biologici.
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Protocol
1. Strumentazione
- MALDI-TOF/TOF MSI. Utilizzare uno spettrometro di massa equipaggiati con una sorgente MALDI per l'analisi di piccole molecole (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Effettuare acquisizioni in modalità ione positivo o negativo a seconda degli analiti di interesse. Specificare un intervallo di massa di interesse e raccogliere 500 colpi laser / spot a 50 micron intervalli in entrambe le dimensioni X e Y attraverso la superficie del campione per generare immagini di ioni. La larghezza raster e numero di colpi laser possono essere regolati per ottenere rispettivamente maggiore risoluzione spaziale e l'intensità del segnale massimo. Utilizzare picchi matrice DHB o standard interni applicati alla slitta o direttamente al tessuto per calibrare gli spettri di massa.
- Alta Risoluzione LC-MS. (Vedi Tabella dei materiali / attrezzature) estratti del campione eseguito con LC-MS utilizzando fase inversa (RP) LC con una colonna C-18, o fase normale (NP), con una colonna HILIC a seconda delle analiti di interesse. Usa fasi mobili esfumature come appropriati per il tipo di campione specifico. Effettuare acquisizioni in modalità ioni positivi o negativi a seconda del tipo di campione.
2. Tissue Preparazione
- Tagliare il nodulo della radice della pianta, lasciando 3-4 mm di radice collegati al nodulo.
- Subito dopo la dissezione, utilizzare pinze per posizionare il tessuto in una tazza criostato e coprire con gelatina (100 mg / ml in acqua deionizzata). E 'essenziale per il tessuto da attaccata al fondo della tazza con bolle d'aria.
- Flash congelare il tessuto posizionando la coppa in un bagno di ghiaccio / etanolo secco finché la gelatina si indurisce e diventa opaca. Conservare i campioni a -80 ° C fino all'utilizzo.
- Rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, tagliare via la coppa criostato plastica e tagliare via l'eccesso di gelatina. Montare il tessuto incorporato per il mandrino criostato con una monetina piccola quantità di temperatura di taglio ottimale (OCT) i media, pur non lasciando l'ottobre toccare il tessuto. Mettere in criostatobox fino a quando i solidifica ottobre.
- Lasciare il mandrino e gelatina equilibrare nella casella criostato (insieme a -20 o -25 ° C) per circa 15 min.
- Utilizzare il criostato (vedi TABELLA MATERIALI / Equipment) alla sezione di tessuto circa lo spessore di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di tessuto) e disgelo montare ogni fetta sul vetro ITO rivestite riscaldando la parte posteriore (non-ITO lato) di un vetrino ITO rivestito sul dorso della mano rivestita. Posizionare il lato ITO rivestito del vetrino riscaldato vicino alla fetta di tessuto congelato e lasciare la fetta di bastone sul vetrino. Posizionamento delle sezioni vicine sulla diapositiva fornirà un migliore allineamento durante MSI.
3. Matrix Applicazione
- Airbrush Applicazione di MALDI Matrix
- Tutte le procedure aerografo devono essere eseguite in una cappa aspirante.
- Pulire accuratamente il contenitore della soluzione aerografo e ugello (vedi Tabella dei materiali / attrezzature) con metanolo eriempire il contenitore della soluzione con soluzione di matrice DHB (150 mg / ml nel 50% methanol/0.1% TFA v / v).
- Tenere l'aerografo di circa 35 cm dal campione e applicare 10-15 strati di matrice sulla superficie del vetrino con una durata di 10 sec spray e 30 sec tempo di asciugatura tra ogni cappotto.
- Pulire accuratamente l'aerografo nuovo con metanolo al termine per evitare di intasare dalla soluzione matrice.
- Spruzzatore automatico Applicazione di MALDI Matrix
- Seguire le istruzioni di start-up forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico.
- Per MSI di metaboliti in noduli radicali utilizzando 40 mg / ml (50% in methanol/0.1% TFA v / v) DHB come matrice, impostare la temperatura a ~ 80 ° C, velocità a 1250 mm / min, portata a 50 microlitri / min, e il numero di passaggi a 24. Per copertura ottimale, si raccomanda di ruotare l'ugello 90 ° e / o compensare l'ugello 1,5 millimetri tra ogni passata. Avviare il metodo spruzzatore.
Come SIde nota, il particolare sistema di spruzzatore utilizzato qui riscalda l'ugello per un'evaporazione più rapida del solvente. Come solvente evapora, la concentrazione della matrice aumenta rapidamente. La matrice applicata al campione con l'aerografo e lo spruzzatore automatico hanno concentrazioni confrontabili. - Seguire le istruzioni sullo spegnimento forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico.
- Sublimazione Applicazione di MALDI Matrix
- Pesare 300 mg DHB nella parte inferiore della camera di sublimazione (vedi Tabella dei Materiali / Equipment).
- Stick il vetrino al dito freddo (porzione superiore della camera di sublimazione) con le sezioni di tessuto rivolto verso il basso con biadesivo, nastro conduttivo. Coprire tutta la parte posteriore della diapositiva con il nastro biadesivo anche per conducibilità, producendo anche deposizione di matrice.
- Bloccare le metà superiore e inferiore della camera di sublimazione insieme al C-clamp. Collegare il vuoto e add ghiaccio e acqua fredda al serbatoio superiore.
- Posizionare camera di sublimazione in un mantello riscaldante che è a temperatura ambiente.
- Accendere la pompa a vuoto. Attendere 15 minuti e accendere il mantello di riscaldamento. Il mantello riscaldante dovrebbe raggiungere 120 ° C nel corso di 10 min.
- Dopo 10 min, spegnere il fuoco, chiudere la valvola a vuoto (quindi l'interno della camera rimane sotto vuoto) e spegnere la pompa a vuoto.
- Lasciare la camera per venire a temperatura ambiente, aprire la valvola rilasciando la pressione del vuoto e rimuovere il campione. Le dimensioni della camera di sublimazione determinerà la quantità di matrice sublimato al vetrino. Le grandi camere di sublimazione (delle dimensioni di un bicchiere da 400 ml) utilizzerà circa 300 mg di DHB mentre le camere più piccole (la dimensione di un bicchiere da 150 ml) utilizzerà circa 100 mg di DHB e richiederanno tagliare il vetrino in modo che si inserisce nella camera.
4. Acquisizione Immagine
- <li> Mark un modello + su ogni angolo del campione con una penna correttore liquido WiteOut per essere usato come "insegnare punti". Posizionare il vetrino nella piastra di adattamento scorrevole MALDI e prendere un'immagine ottica del campione utilizzando uno scanner.
- Impostare un file di acquisizione immagine utilizzando il software fornito dalla società strumento con un passo raster di 50 micron e un diametro laser uguale o inferiore alla dimensione del passo raster. Su questo particolare strumento, l'impostazione minima laser spedisce un diametro laser di impostazione laser circa 10 micron e piccolo ha un diametro di 40-50 micron.
- Caricare l'immagine ottica nel software e allineare la piastra con l'immagine ottica.
- Calibrare lo strumento prima di iniziare l'acquisizione utilizzando ioni comuni matrici di cluster, standard interni, o un mix di calibrazione.
- Specificano le aree di tessuto da analizzare con MSI, compreso un punto di pura matrice sul vetrino per essere utilizzato come "bianco".
- Inizia acquisizione.
5. Generazione Immagine
- Aprire il file di immagini nel software disponibile in commercio fornito dal venditore e estrarre le immagini di ioni. Altri software open-source è disponibile per MSI elaborazione dei dati 19.
6. Identificazione di Metaboliti
- Selezionare uno specifico m / z di interesse da parte lo spettro di massa utilizzando il software specifico del fornitore (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Un analita può essere distinto da uno ione matrice quando un picco analita viene scelto dal spettro di massa e immagini ioni sono generati specificamente localizzata nella sezione di tessuto.
- Generare un elenco di analiti di interesse e di effettuare esperimenti di MS / MS. Vedi Tabella 1 e Tabella 2 Risultati rappresentativi per le liste di campionamento di analiti.
- Eseguire mirata analisi LC-MS su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (o alta risoluzione MALDI-MS se disponibile) per ottenere accuratemisure di massa degli analiti di interesse e anche effettuare LC-MS/MS degli analiti bersaglio per ottenere modelli caratteristici di frammentazione.
- Eseguire database di ricerca per determinare le identificazioni putativi per gli analiti mirati. Esempi di database metaboliti comprendono: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, e HMDB.
- Per confermare le identificazioni putativi di accurata ricerca nei database di massa, far corrispondere la MS / MS da parte degli analiti mirati per MS / MS spettri di standard, letteratura, e / o software di previsione frammentazione.
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Representative Results
Una panoramica sperimentale di MSI è mostrato in Figura 1. All'inizio dell'esperimento, preparazione del campione è un passaggio fondamentale. I noduli vengono tagliati dalla radice vegetale e incorporati in gelatina. Il tessuto deve essere appiattita contro la tazza criostato, in assenza di bolle, mentre viene congelato; questo garantirà allineamento facile e corretto del tessuto mentre viene sezionato. Quando il tessuto viene affettato, è importante tagliare il tessuto allo spessore adeguato; troppo sottile di sezioni si strappa, rovinando l'integrità del tessuto, mentre troppo spessa delle sezioni ridurrà il numero di analiti estratti e rilevati dal tessuto. Selezione di matrice e tecnica di applicazione determinerà i tipi di analiti identificati. Utilizzando una combinazione di matrici potrebbe fornire risultati complementari. Tre tecniche di applicazione matrice vengono presentati in questo lavoro. La tecnica aerografo è veloce, ma tipicamente non adatto per MSI di piccole molecole esserecausa di analita diffusione. Sistemi di spruzzatore automatici e sublimazione offrono piccoli cristalli matrice, migliore riproducibilità, e meno diffusione dell'analita. Figura 2 mostra un'immagine ottica di una sezione principale nodulo Medicago truncatula. Figura 3 mostra un esempio di immagine ottico delle dimensioni copertura matrice e cristallo con aerografo, automatico spruzzatore, e sublimazione, rispettivamente.
Matrici convenzionali, come DHB, producono molti ioni nell'intervallo minore massa (m / z 100-400) 20. Questi ioni della matrice possono interferire con il rilevamento di metaboliti in questo intervallo. Figura 4 mostra MS spettri di appena matrice DHB rispetto al tessuto radice nodulo rivestita con matrice DHB. Picchi di matrice DHB sono indicate in tessuto rosso e il nodulo della radice coperto con DHB è mostrata in blu. Matrici innovative come le nanoparticelle di TiO2 21, 1,5-diaminonapthalene (DAN) 22, 2,3,4,5-Tetrakis (3 ', 4'-dihydroxylphenyl) tiofene (DHPT) 23, e 1,8-bis (dimetil-amino) naftalene (DMAN) 24,25 sono stati segnalati che riducono l'interferenza di ioni di matrice nella gamma bassa massa, e anche migliorare l'individuazione di alcune classi dei metaboliti 5. Picchi di Matrix possono essere distinte da metaboliti reali utilizzando le immagini MS. Quando un picco viene cliccato, l'immagine di ioni viene estratto e visualizzato sovrapponendo l'immagine ottica. Quei picchi che generano immagini con localizzazione distinto al tessuto, e che non sono presenti nella matrice unica area ripreso, sono considerati metaboliti. Figura 5a mostra diverse immagini rappresentative di ioni di metaboliti presenti nel tessuto radice nodulo, mentre la Figura 5b mostra esempi di immagini MS corrispondente alla matrice picchi relativi. In figura 5a mostra l'immagine localizzazione distinta al tessuto radice nodulo e una mancanza di segnale nella matrice unica area che viene ripreso. In Figura 5b M. truncatula radice nodulo tessuto è riportata nella Tabella 1 (modalità positiva) e Tabella 2 (modalità negativa) 4.
L'obiettivo finale degli esperimenti di metabolomica non mirati è quello di identificare i composti che sono stati rilevati. Quando si esegue MSI su uno strumento di risoluzione media (MRM), come per esempio un TOF / TOF, è necessario avere massa accurata in modo diverso. Questo può essere fatto con un approccio poliedrico MS in cui i risultati MALDI-MSI sono confrontati ad alta risoluzione dei dati LC-MS utilizzando estratti di tessuto. Ci sono molti possibili protocolli di estrazione del tessuto da scegliere a seconda delle analiti di interesse. MS ad alta risoluzione (HRMS) può essere eseguita in mo ionizzazione positiva o negativades e con normale o invertita LC fase a seconda delle analiti di interesse. Una volta che una massa accurata è ottenuta con alta risoluzione LC-MS, la massa risultante può essere cercato con diversi database, elencati in precedenza, per ottenere una identificazione putativo. Avanti dati MS / MS viene raccolto e il modello caratteristico frammentazione dell'analita di interesse può essere paragonato agli standard, spettri letteratura, o modelli teorici frammentazione. Figura 6 mostra un esempio di uno dei metaboliti identificati con MSI e LC-MS. Questo metabolita è stato identificato come eme basato sullo spettro MS / MS raccolti con alta risoluzione LC-MS. Questi dati MS / MS è stato confrontato con la MS / MS spettri precedentemente pubblicato da Shimma e Setou 26. La MS / MS spettri partita a due, quindi l'identità di m / z 616,2 stato fiduciosamente assegnato come eme basato sul accurato database di ricerca di massa e dati MS / MS rispetto alla letteratura dati MS / MS.
Figura 1. Panoramica di MSI flusso di lavoro. Noduli radicali vengono tagliati dalla pianta, incorporato in gelatina, sezionato con il criostato e montate su un vetrino ITO rivestite. Matrix viene applicato alla presentazione seguendo uno dei tre tecniche applicative matrice. Acquisizione MSI viene eseguita con uno spettrometro di massa MALDI-TOF/TOF e spettri MS vengono compilati in immagini con il software MSI.
Figura 2. Campione di tessuto ottico di immagine. Ottico di immagine rappresentativa di una sezione di tessuto radice nodulo truncatula Medicago.
Figura 3. Deposizioni matrice esempio. Immagini rappresentative che mostrano le diverse consistenze di deposizione di matrice con a) aerografo, b) spruzzatore automatico, e c) le tecniche di sublimazione. Il metodo di applicazione aerografo genera grandi e piccoli cristalli, mentre il metodo di spruzzatore automatico produce piccoli cristalli di dimensioni uguali. Sublimazione produce uno strato uniforme di matrice. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. MS spettro di plain DHB matrice vs tessuto radice nodulo coperto con DHB. picchi di matrice DHB sono indicate in rosso e tessuto radice nodulo coperto con DHB sono mostrati in blu. Picchi di Matrix possono essere distinte da metaboliti reali utilizzando le immagini MS. Quando un picco viene cliccato, l'immagine di ioni viene estratto e visualizzato sovrapponendo l'immagine ottica. Quei picchi che generano immagini con localizzazione distinto al tessuto, e non sono presenti nella matrice unica area ripreso, sono considerati metaboliti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Immagini MS di M. noduli radicali truncatula. a) immagini di ioni rappresentativi di metaboliti found in wild-type M. noduli radicali truncatula. b) immagini di ioni rappresentativi di specie di matrice che non sarebbero considerati metaboliti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Dati di esempio MS / MS per l'identificazione del metabolita. MS / MS spettro di m / z 616,2, identificata come eme [M +]. La struttura chimica è mostrata e strutture di frammentazione vengono assegnati. Il sperimentale dati MS / MS viene confrontato con lo spettro MS / MS dell'eme riportato in letteratura da Shimma e Setou 26.
Tabella 1. Analiti di interesse -. Modalità positiva elenco Campione di analytes di interesse da M. truncatula radice nodulo di tessuto in modalità ioni positivi 4.
| Nome del metabolita | Teorica [M + H] + | MRMs misurati [M + H] + | HRMS misurati [M + H] + | Δm (MDA) |
| γ-aminobutirrico un | 104.0706 | 104,1 | 104.0706 | 0 |
| colina a, * | 104.1070 > | 104,1 | 104.1071 | 0.01 |
| prolina | 116.0706 | 116,07 | 116.0706 | 0 |
| valina | 118.0863 | 118.09 | 118.0865 | 0.02 |
| leucina un | 132.1019 | 132.1 | 132.1022 | 0.03 |
| asparagina un | h: 79px; "> 133,0608133.06 | 133.0602 | -0.06 | |
| adenina un | 136.0618 | 136,07 | NA | NA |
| proling betaina un | 144.1019 | 144,1 | 144.1024 | 0.05 |
| glutammina un | 147.0764 | 147,09 | 147.0768 | 0.04 |
| 156.0768 | 156,06 | 156.0771 | 0.03 | |
| arginina un | 175.1190 | 175,13 | 175.1167 | -0.23 |
| saccarosio + K | 381.0794 | 381,05 | 381.0791 | -0.03 |
| eme a, * | 616.1768 | 616,15 | NA | NA |
| ht = stile "25" = "height: 26px; width: 173px;"> NAD una | 664.1164 | 664,1 | NA | NA |
| formononetina un | 269.0808 | 269,08 | 269.0803 | 0.05 |
| chrysoseriol GLCA un | 477.1028 | 477,1 | 477.1008 | 0.2 |
| formononetina MalGlc un | 517.1341 | 517,13 | 517.1337 | idth: 64px; "> 0.04|
| aformosin MalGlc un | 547.1446 | 547,16 | 547.1427 | 0.19 |
* [M +]
un MS / MS eseguita per l'identificazione.
Tabella 2. Analiti di interesse -. Modalità negativa elenco di esempio di analiti di interesse da M. truncatula radice nodulo di tessuto in modalità ioni negativi 4.
| Nome del metabolita | Teorica [MH] - | MRMs misurati [MH] - < / Sup> | HRMS misurati [MH] - | Δm (MDA) |
| acido piruvico | 87,0077 | 87 | NA | NA |
| alanina una | 88,0393 | 88.01 | 88,0374 | -0.19 |
| acido lattico una | 89,0233 | 89.01 | 89,0296 | 0.63 |
| acido fosforico | 96,9685 | 96.96 | 96,9625 | -0.6 |
| Acido 2-ketobutyric | 101.0233 | 101.02 | 101.0191 | -0.42 |
| 102,055 | 102,04 | 102.0528 | -0.22 | |
| serina | 104.0342 | 104,02 | 104.0228 | -1.14 |
| maleica / acido fumarico un | 115.0026 | 115,03 | 115 | -0.26 |
| acido succinico un | 117.0182 | 117,01 | 117.0125 | -0.57 |
| treonina | 118.0499 | 118,04 | 118.0456 | -0.43 |
| L'acido ossalacetico | 130.9975 | 131,03 | 130,991 | -0.65 |
| acido aspartico un | 132.0291 | 132,03 | 132.0256 | -0.35 |
| acido malico una | 133.0132 | 133.02 | 133.0221 | 0.89 |
| L'acido salicilico | 137.0233 | 137,02 | 137.0349 | 1.16 |
| α-chetoglutarico acido | 145.0132 | 145.02 | 145.0063 | -0.69 |
| acido glutammico un | 146.0448 | 146,01 | 146.0408 | -0.4 |
| pentose | 149.0445 | 149.04 | 149.0414 | -0.31 | </ Tr>
| L'acido aconitico un | 173.0081 | 173,03 | 173.0057 | -0.24 |
| acido ascorbico un | 175.0237 | 175,05 | 175.0341 | 1.04 |
| esoso | 179,055 | 179,05 | 179.0484 | -0.66 |
| citrico / acido isocitrico un | 191.0186 | 191,02 | 191.0166 | -0.2 |
| acido palmitico | 255.2319 | 255,22 | 255.2246 | -0,73 |
| esoso-6-fosfato a | 259.0213 | 259,04 | 259,014 | -0,73 |
| acido stearico | 283.2632 | 283,26 | 283.2552 | -0.8 |
| saccarosio una | 341.1078 | 341,07 | 341.0972 | -1,06 |
un MS / MS eseguita per l'identificazione.
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Discussion
Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l'integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risultati. Usando una combinazione di matrici o tecniche di applicazione potrebbe fornire risultati complementari.
Questo metodo è stato progettato specificamente per non mirati MSI di metaboliti endogeni in M. truncatula radice nodulo di tessuto, ma può essere facilmente adattato ad altri tipi di tessuto e domande biologiche. I metodi di applicazione matrice consigliati per piccola molecola MSI sono sublimazione e spruzzatore automatico. Aumentando la quantità di solvente depositato sulla tissue, regolando il metodo spruzzatore automatico, aumenterà l'estrazione di analiti e consentire la rilevazione di composti di massa più elevati si dovrebbe scegliere di eseguire MSI di lipidi, peptidi, ecc. Quando si utilizzano altri tipi di tessuto, la regolazione principale sarà lo spessore della sezione. Idealmente il tessuto deve essere affettato allo spessore di una cellula; pertanto sezioni più spesse forse appropriato per tessuto vegetale e sezioni sottili appropriate per tessuti animali. Se si verifica piegatura o lacerazione, tipicamente un tempo di equilibrio è più necessario prima del taglio o una taglia sezione più spessa potrebbe essere necessario. Quando si esegue LC-MS per ottenere masse precisi, il protocollo di estrazione dei tessuti, solventi fase mobile e di pendenza, colonna fase stazionaria, e la modalità di ionizzazione MS possono essere regolati e ottimizzato per gli analiti di interesse.
Il vantaggio principale di MALDI-MSI è la sua capacità di fornire non solo informazioni di massa, ma anche informazioni spaziali per un dato campionesenza la necessità di una preventiva conoscenza degli analiti bersaglio. Altre tecniche di imaging richiedono l'uso di derivatizations o tag 5. Come discusso in precedenza, una limitazione di questa tecnica è l'abbondanza di picchi di interferenza di ioni matrice. Matrici nuovi sono stati segnalati per affrontare questa limitazione. In alternativa, la spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS)-MSI è un'opzione immagine priva-matrice, tuttavia, ha meno sensibilità di MALDI-MSI 3. Un altro limite di questa tecnica è la risoluzione di massa inferiore di strumenti MALDI-TOF/TOF. A causa della bassa potenza massa risoluzione, è necessario effettuare anche alta risoluzione MS avere masse accurate per l'identificazione metabolita, che significa più esperimenti e più tempo. Questo problema potrebbe essere risolto eseguendo MALDI-MSI su una piattaforma strumentale alta risoluzione come la MALDI-Orbitrap. La limitazione finale di eseguire esperimenti di MSI è la mancanza di strumenti software disponibili per l'analisi dei dati di MSI, although alcuni recenti progressi nel software MSI sono stati fatti 27,28. Tipicamente lo spettro MS per ogni regione d'immagine deve essere analizzata manualmente e immagini ioni estratto a mano. Esperimenti MSI producono un'abbondanza di dati e possono essere incredibilmente tempo per analizzare. Nel complesso, MALDI-MSI offre vantaggi unici per ottenere informazioni spaziali di molti composti simultaneamente in un singolo esperimento che può essere estremamente utile per l'analisi non mirati di piccole molecole e di altri composti con molte applicazioni biologiche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Jean-Michel Ané presso il Dipartimento di Agronomia a UW-Madison per la fornitura di campioni truncatula Medicago. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (NSF) concessione CHE-0957784, l'Università del Wisconsin Graduate School e la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) e il programma Romnes Ricerca Faculty Fellowship (LL). EG riconosce un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.256.259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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