We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gereedschappen die het uitoefenen van mechanische krachten om cellen en weefsels of waarmee kan kwantificeren de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel dramatisch bijgedragen tot het begrijpen van fundamentele mechanobiology. Deze technieken zijn uitgebreid gebruikt om aan te tonen hoe het ontstaan en de progressie van verschillende ziekten sterk worden beïnvloed door mechanische signalen. Dit artikel presenteert een multi-functionele biaxiale (BAXS) platform dat mechanisch kunnen stimuleren enkele cellen of kwantificeren van de mechanische stijfheid van weefsels. De BAXS platform bestaat uit vier voice coil motoren die onafhankelijk kunnen worden bestuurd. Enkele cellen kunnen worden gekweekt op een flexibel substraat dat kan worden bevestigd aan de motor zodat men de cellen blootgesteld aan complexe, dynamische en ruimtelijk variërende spanning velden. Omgekeerd, doordat een kracht load cell, kan ook kwantificeren de mechanische eigenschappen van primaire weefsels ze worden blootgesteld aan deformatie cycli.In beide gevallen moet een goede set van klemmen worden ontworpen en gemonteerd aan de BAXS platform motoren om stevig vast te houden het flexibel substraat of het weefsel van belang. De BAXS platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd gelijktijdige doorvallend licht en / of fluorescentie beeldvorming uit te voeren om de structurele of biochemische reactie van het monster tijdens het spannen experimenten onderzoeken. Dit artikel geeft experimentele details van het ontwerp en het gebruik van de BAXS platform en presenteert de resultaten voor enkele cel en hele weefsel studies. De BAXS platform werd gebruikt om de vervorming van kernen in enkele muis myoblast cellen in reactie meten spanning substraat en de stijfheid van geïsoleerde muis aorta meten. De BAXS platform is een veelzijdig instrument dat kan worden gecombineerd met verschillende optische microscopie om nieuwe mechanobiologische inzichten op de sub-cellulair, cellulaire en hele weefsel niveaus bieden.
Inleiding
De mechanische micro speelt een belangrijke rol in vele celfuncties zoals proliferatie, migratie en differentiatie, die een grote invloed hebben op de ontwikkeling en homeostase van weefsels en ook ziekten 1-6. In de loop der jaren, hebben een veelheid van experimentele instrumenten gebruikt om mechanisch te stimuleren cellen of weefsels en meet mechanische eigenschappen van biologische weefsels met als doel het vergroten van ons begrip van de fundamentele mechanobiology en het bestuderen van het ontstaan en de progressie van ziekten 6-17. Men moet echter vaak afhankelijk van verschillende experimentele apparatuur om de doelstellingen van een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Mechanische vervorming van enkele cellen
- Fabricage van een PDMS Ondergrond met ingebouwde TL-Beads
Vóór vervaardiging van het substraat, worden fluorescente microsferen in water oplossing gesuspendeerd in isopropanol kraal menging te verbeteren op het PDMS vanwege de hydrofobe aard.- Pipetteer 500 ul van fluorescerende microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant en voeg 500 ul van isopropanol gevolgd door 5 min van vortexen. Plaats de flacon aan de kant 's nachts in het donker, zodat elke grote deeltjes aggregaten naar sediment.
- De v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cel Stretching
De BAXS platform werd gebruikt om de mechanische reactie van de kern in enkele muis myoblast cellen (C2C12) blootgesteld aan een substraat vervorming van 25% onderzocht. Myoblast cellen worden aangetroffen in het spierweefsel en worden voortdurend blootgesteld aan mechanische rek en compressie in vivo. De vorm en mechanische eigenschappen van de celkern blijkt een belangrijke rol spelen bij de regulatie van genexpressie en transcriptionele activiteit .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De BAXS platform gepresenteerde vergemakkelijkt talrijke experimenten in de studie van mechanobiology uit onderzoek van enkelvoudige cellen tot volledige weefsels. Bovendien, het platform is zeer flexibel en configureerbaar, waardoor talrijke mechanische stimulatie experimenten en multi-axiale trekproeven. Het platform maakt ook het onderhoud van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden en toelaten om gelijktijdig microscopie tijdens het spannen experimenten. De twee experimenten in de vorige paragrafen beschr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
DT werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche du Quebec-Nature et Technologies (FQRNT) en een MITACS Elevate Strategic Fellowship. CMC werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ) en de Ernest en Margaret Ford cardiologie begiftigd research fellowship van de Universiteit van Ottawa Heart Institute. EOB werd ondersteund door exploitatiesubsidies MOP80204 van het Canadese Institute for Health Research (CIHR) en T6335 van de Heart and Stroke Foundation van Ontario. De CIHR en Medtronic leveren collectief EOB met een peer-reviewed Research Chair (URC # 57093). AEP wordt gefi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | De verhouding basis tot cross-linker die in dit protocol wordt gebruikt, is 20:1. Meng in een laminare kap om te voorkomen dat stof je vervuilt |
| FluoSpheres fluorescente microspheres | Invitrogen | F8810 | Uit de buurt van licht houden. |
| Lineaire voicespoel | Moticont | LVCM-051-051-01 | De motor komt in twee delen (magneet en spoel). Het moet op een kogellagersysteem worden gemonteerd om functioneel te zijn. |
| Kogellagerschuif | Edmund Optics | NT37-360 | Miniatuur en kleine lineaire bewegingskogellagerschuiven |
| Lineaire positioneringsfase | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optische encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolutie | Reflectieve incrementele encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 met AMP-20440 | 4-assige controller met een 4-assige versterker |
| Belastingscel | Honeywell | 31 laag | Miniatuur belastingscel met een bereik van 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Roestvrijstalen pinnen die in een geopende driehoekige vorm zijn gebogen | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanente epoxy negatieve fotoresist. Uit de buurt van warmte en licht houden |
| Air-plasma behandelingssysteem | Glowresearch | Autoglow zuurstofplasma systeem | |
| Rat-tail collageen | Invitrogen | A10483-01 | Collageen I, rattenstaart 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specifieke fluorescerende kleurstof. In de koelkast bewaren. |
| Kapton (Polyimide Film) Geïsoleerde flexibele verwarmers | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexibele verwarmers; kan worden geleverd met een 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperatuur en Proces Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperatuurregelaar; voeding 24 V. |
| DMEM kweekmedium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Gemodificeerd 30 Eagle Medium. Bewaar bij 4 °C |
| Penicilline-Streptomycine | Hyclone | SV30010 | Voorraad bevroren houden. Werkoplossing bij 4 °C bewaren. |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Ingevroren bewaren. |
| Trypsine 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Ingevroren bewaren. Digestie van celaanhechtingseiwitten voor subcultivatie |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-gebufferde zout oplossing |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs fysiologische oplossing |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs fysiologische oplossing |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs fysiologische oplossing oxygenatie |
| Nocodazol | Sigma | M1404 | Microtubuli depolymerisatie agens |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actine filamenten depolymerisatie agens |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Gebruikt om gladde spiercelcontent te kleuren en te kwantificeren |
| Picrosirius rood kleurstof | Fluka | 43665 | Gebruikt om collageengehalte te kleuren en te kwantificeren |
Referenties
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
