Summary
Mikroflödes bestyckningen mot en dropp gränssnitt membranet ger ett tillförlitligt sätt att generera vesiklar med kontroll över membranet asymmetri, inkorporering av transmembranproteiner, och inkapsling av material. Denna teknik kan tillämpas för att studera en mängd olika biologiska system där compartmentalized biomolekyler önskas.
Abstract
Bottom-up syntetisk biologi presenterar en ny metod för att undersöka och beredning biokemiska system och, potentiellt, minimala organismer. Detta framväxande området engagerar ingenjörer, kemister, biologer och fysiker att konstruera och sätta ihop grundläggande biologiska komponenter i komplexa, fungerande system från botten upp. Sådana bottom-up-system kan leda till utveckling av konstgjorda celler för grundläggande biologiska undersökningar och innovativa terapier 1,2. Giant enlamellvesiklar (GUVs) kan tjäna som modell plattform för syntetisk biologi på grund av sin cell-liknande membranstruktur och storlek. Microfluidic bestyckningen eller microjetting, är en teknik som gör det möjligt för alstringen av GUVs med kontrollerad storlek, membranets sammansättning, transmembranprotein inkorporering, och inkapsling 3. Den grundläggande principen för denna metod är användning av multipla, högfrekventa fluidpulser som genereras av en piezo-manövrerad bläckstråleanordning för att deformera en upphängd lIPID dubbelskikt i en GUV. Processen är som att blåsa såpbubblor från en tvålfilm. Genom att variera sammansättningen av bubbel lösningen, sammansättningen av den omfattande lösningen, och / eller de komponenter som ingår i dubbelskiktet, kan forskare använda denna teknik för att skapa anpassade blåsor. Detta dokument beskriver proceduren för att skapa enkla vesiklar från en dropp gränssnitt dubbelskikt genom microjetting.
Introduction
Det har blivit allt tydligare att cellbiologi är ett problem med flera skala som innebär att integrera vår förståelse från molekyler till celler. Därför att veta exakt hur molekyler fungerar individuellt är inte tillräckligt för att förstå komplexa cellulära beteenden. Detta beror delvis på att det finns emergenta beteenden av flerkomponentsystem, som exemplifieras av beredning av aktin interaktion nätverk med lipiddubbelskikts blåsor 4, mitotiska spindeln församling i Xenopus extrakt 5, och rumslig dynamik bakteriella celldelnings maskinerier 6. Ett sätt att komplettera den reduktionistiska synsätt för att dissekera de molekylära processerna i levande system är att ta det motsatta synsätt beredning cellulära beteenden med hjälp av en minimal uppsättning av biologiska komponenter. En viktig del av denna strategi innebär tillförlitlig inkapsling av biomolekyler i en begränsad volym, en viktig del av en cell.
e_content "> Flera strategier finns för inkapsling av biomolekyler för att studera biomimetiska system. Den mest biologiskt relevant systemet är lipidbiskiktmembraner, som efterliknar de biokemiska och fysiska begränsningar som cellens plasmamembran. Bildning av jätte enlamellvesiklar (GUVs) med electroformation 7, en av de mest använda teknikerna för GUV generation 14, har typiskt en dålig inkapslings avkastning på grund av dess oförenlighet med buffert med hög salthalt 8. Electroformation också kräver stora provvolymer (> 100 ^ il), som kan vara ett problem för att arbeta med renade proteiner och ineffektivt inkorporerar stora molekyler på grund av svårigheten att diffusion mellan tätt placerade lipidskikt. Flera microfluidic tillvägagångssätt för generering av lipidvesiklar har utvecklats. De dubbla emulsionsmetoder, vilka passerar komponenter via två gränssnitt mellan skikten vatten-olja-vatten (V / O / W), förlitar sig på förångningen av en volatile lösningsmedel för att driva lipiddubbelskikt bildning 9. Andra har använt en mikroflödesmonteringslinje, som producerar en kontinuerlig ström av lipiddubbelskikt vesiklar 10 eller i två oberoende steg 11. Vi har utvecklat en alternativ teknik baserad på snabbt tillämpa vätske pulser mot en dropp gränssnitt dubbelskikt 12 för att producera GUVs av kontrollerad storlek, sammansättning, och inkapsling. Vår strategi, som kallas mikroflödes bestyckningen, erbjuder de kombinerade fördelarna från flera befintliga vesikler generationens teknik, som ger en metod för att skapa funktionella biomolekylära system för att undersöka en rad olika biologiska problem.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Horisont avdelningen Fabrication
- Utforma oändlighet kammaren (uppkallad efter dess form) med hjälp av en datorstödd konstruktion (CAD), och spara filen så att den är kompatibel med en laserskärare. För att skapa den här formen, separata två cirklar med diametern 0,183 in med ett centrum-till-centrum avstånd av 0,15 tum Skär kammaren från 1/8- 3/16 i klar akryl med laserskärare. Infinity formen underlättar dropp gränssnitt dubbelskiktsbildning och stabilitet.
- Borra ett 1/16 i hålet genom kanten av den akrylkammaren till oändlighet formade väl. Upprepa på motsatt sida. Skär en liten rektangel ur ett 0,2 mm akrylskiva med en sax eller en laserskärare för att tjäna som en botten till brunnarna.
- Applicera ett tunt men komplett skikt av snabbtorkande bindemedel på en sida av 0,2 mm akryl och limma den mot botten av kammaren. Håll 0,2 mm akryl tätt på plats mot bottnen av kammaren och dispenseralimmet vid gränsytan för att tillåta limmet att skapa en tätning men undvika att täcka visningsområdet. Passa akryl så att dess kant är i jämnhöjd med kanten på kammarväggen och den helt täcker oändlighet kammar cutout. Detta kommer att möjliggöra tillräcklig jet penetration och förhindra läckage av brunnen.
- Skär två små bitar av naturligt gummi för att täcka de borrade hålen. Applicera snabbtorkande vidhäftningsmedel runt hålet. Placera gummi över hålet och tryck på alla områden med en pincett för att säkra. Upprepa för båda borrade hål. Kontrollera att alla limmade anslutningar är kompletta tätningar för att förhindra läckage.
- Med hjälp av en 23 G, 1 i nålen, peta ett hål i naturligt gummi på båda sidor av kammaren för att underlätta införande av det piezoelektriska bläckstråle dricks.
2. Experimentellt Framställning
Butiks lager lipidlösningen i kloroform i en -20 ° C frys. För denna studie, antingen 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPhPC) eller 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) användes. 2 ml av 25 mg / ml lipid lösningen framställs typiskt i detta protokoll och kommer att pågå i två månader vid förvaring vid -20 ° C.
- För att suspendera lipid i n-dekan, först överföra den från en förrådsflaska vid en liten glasburk, och försiktigt torr under argon eller kväve. Håll burken i en vinkel under torkningen för att exponera mer ytarea för gasen, vilket tillåter lipid för att torka snabbare.
- Med locket på burken endast något skruvas på, låt den torkade lösningen för att sitta under vakuum i en exsickator under 1-2 timmar. Sedan till n-dekan till lösas lipiden vid 25 mg / ml. Vortex lipidlösningen kort stund och sonikera den i en badsonikator under 15 min. Förvara den rekonstituerade lipid i n-dekan vid -20 ° C.
- Förbered en aktie sackaroslösning. I en 1,5-ml mikrocentrifugrör, tillsätt 900 l av 300 mM sackaros och 100 lav 1% metylcellulosa (MC). Metylcellulosa sätts för att öka viskositeten av lösningen, vilket underlättar bestyckningen. Valfritt steg: Lägg en valfri 1 l av mörk mat färgämne eller fluorescerande pärlor att låna ut mer kontrast eller fluorescens i bildbehandling, respektive. Denna lösning är en 300 mOsm sackaros lösning för att matcha cellulär osmolaritet och ge kontrast under microjetting.
- Drag upp lösningen i en engångs 1 ml plastspruta. Håll sprutan med spetsen uppåt, skaka axeln flera gånger för att driva ut eventuella bubblor mot spetsen, och skjut in kolven för att mata ut den instängda luften. Se till att evakuera all luft från sprutan innan du fortsätter, eftersom det kommer att påverka korrekt piezoelektrisk kontraktion ansvarig för att spruta.
- Installera ett 0,22 ìm filter i änden av sprutan. För att förhindra luft från att fastna i filtret, håll sprutan lodrätt och tryck in kolven tills en droppe bildas ovanför spetsen. Anmärkning: A33 mm diameter sprutfilterenheten befanns fungera bäst, men alternativa filtren så små som en 3 mm diameter sprutfilter kan användas för att minska dödvolymen.
- Skruva av hon-Luer-adaptern på bläckstråleskrivare, och säkert att trycka den på plats över änden av filtret. Återigen, mata ut vätska för att förhindra att fånga luft. Skruv i toppen av bläckstråleskrivare. Fluid måste bege sig till spetsen av bläckstråle efter att den är helt fastsatt.
3. Iordningställande av utrustning
- Med hjälp av en v-klämman, montera sprutenheten på mikroskop scenen. Fäst tråden från bläckstråleskrivare till bläckstråleskrivare controller. Anm: En anpassad scen byggdes för detta protokoll, medan scenografin kan bestämmas av användaren, är det viktigt att ha oberoende xyz kontroll av sprutan och xy kontroll av provhållaren.
- Bestäm förstoring och nödvändig lins kombination för att uppnå önskad avbildning. Här en 10X objektiv och 10X okular används. Använd en höghastighetskamera (≥ 1,000 fps) för att visualisera bestyckningen och vesikler generation. Före bildbehandling, utför nödvändigt kamerakalibrering. Utnyttja bild-baserade auto-trigger i kamerans programvara för att starta Bildinsamling.
- Montera oändlighet kammare på mikroskop scenen. Säkra kammaren genom att tejpa den på plats på scenen.
- Rikta noggrant bläckstråle spets med hålet punkterade i naturgummi (se figur 1b). För att göra detta, ta med bläckstråle nära till kammaren och justera placeringen av ögat, sedan göra mer exakta justeringar genom mikroskoplinsen. Gå försiktigt, eftersom grova rörelser kan skada bläckstrålespetsen.
- När bläckstråle är inriktad, backa sprutaggregatet bort från kammaren för att förhindra eventuella skador på bläckstråle under lastning av brunnarna. Var säker på att rörelsen hos bläckstråleskrivare är enkelriktad, så att den förblir i linje med hålet i membranet.
- Tryck försiktigt på PlunGer av sprutenheten tills en liten droppformer på bläckstrålemunstycket. Detta kommer att ge några inledande mottryck.
- Inmatningssprutparametrar. För en trapetsformad bipolär våg, använd följande parametrar: 20 kHz pulsfrekvens, 3 isek upphov tid, 35 isek pulslängd, 3 isek falla tid, 65 V pålagd spänning (puls amplitud), och 100 jet pulser per trigger (puls nummer) . Emellertid kan den pålagda spänningen (pulsamplitud) och pulsnummer (ljudspulser per trigger) varieras för att styra vesikelstorlek.
4. Vesikel Generation
- Lägg till 25-30 l lipidlösningen upphängd i n-dekan till oändlighet kammaren, som täcker hela ytan på båda brunnarna.
- Tillsätt 25 l glukos (av samma osmolaritet som sackaroslösningen) till den yttersta kanten av en brunn, pipettera långsamt och mjukt. Vid deponeringen, bör en droppe av glukos bildas, på grund av att glukos-och lipid-lösning inte blandas. Lägg till ytterligare 251, l glukos till det motsatta också, vilket kommer att göra en annan droppe och bildar lipidbiskiktmembranet i mitten av kammaren inom 5-10 min.
- Sätt i bläckstråleskrivare genom naturgummi, och försiktigt styra den mot droppgränssnittsdubbelskiktet. Närma dubbelskiktet långsamt, eftersom den introducerade bläckstråleskrivare kommer att tränga volym och kan brista dubbelskiktet.
- När bläckstråleskrivare är inom ~ 200 nm, applicera sprut med de inställningar som beskrivs i steg 3,8. Avståndet från dubbelskiktet kan i första hand beror på den spänning och pulsnumret, bland andra parametrar. Detta protokoll rekommenderas långsamt ökande inställningar (spänning och pulsnummer) och observera dubbelskikts deformation.
5. Rengöring av utrustning
- Lossa sprutan enheten från mikroskop scenen, och kassera sprutan 1 ml plast och filter.
- För att rengöra bläckstråle, aspirera följande lösningar i ordning genom att doppa spetsen i Våra produktern 7-10x vardera: 70% etanol, 2% Neutrad lösning i varmt vatten, 70% etanol, och DDH 2 O. Om bläckstråle inte passar säkert på aspirations pipett, skär en pipettspets för att bilda en adapter.
- Torka kammaren med vävnaden. Placera oändlighet kammaren i en 250 ml bägare med 2% volym / volym Neutrad i varmt vatten, och sonikera under 5 till 10 min. Efter ultraljudsbehandling, torka brunnarna inom tryckluft. Fukt i brunnarna kan äventyra stabiliteten hos lipidbiskiktmembranet, så det är också rekommenderat att kamrarna är placerade i en ugn vid 60 ° C under 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har samlat en mikroflödes bestyckningen setup på en konventionell inverterat fluorescensmikroskop med en anpassad scen sammansatta av bearbetade detaljer och manuella mikrometer (Figur 1). Karakterisering av bläckstråle ger inblick i vesikeln genereringsprocessen. Att variera avståndet mellan bläckstrålemunstycket och lipiddubbelskikt påverkar den kraft som anbringas för att orsaka deformation av membranet. Närheten till biskiktet fokuserar jetströmmen och hindrar membranet från dispergering energi bort ur vesikler generation. Virvelrese ökar med den spänning som appliceras på det piezoelektriska manövreringsorganet, i överensstämmelse med våra förväntningar (Figur 2). Vesikelbildning och representativ jetted vesiklar visas i Figur 3. Figur 3a visar en representativ bild sekvens för vesikelbildning genom microjetting. Efter bildning tenderar vesikel stabilitet att variera med vesikel diameter, där mindre vesiklar var mer stabil.
Figur 1. Illustration av den teknik och utrustning. (A) Schematisk bild av piezoelektriska driven prutningsprocess mot droppgränssnittsdubbelskiktet. Flera pulser sköt i snabb följd bildar en virvel ringstruktur som deformerar biskiktet att producera GUVs. Nederst till höger skildring visar var glukos nedfall och dimension också. När lipidlösning har lagts till i oändlighet kammaren, är 25 l glukos läggs till de yttersta kanterna på bra, först vid (1) och sedan på (2). (B) Den monterade sprutaggregatet, anpassningsbar hålla plattformen och oändligkammaren. Kammaren är fäst på plats, och spetsen på bläckstråle är inriktad med hol e i naturgummi på sidan av brunnen. (C) Den kompletta mikroskop och anpassade scenen församling. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Karakterisering av bläckstråleskrivare. (A) snabb inkjet pulser vid 20 kHz (50 pulser vid 55 V pulsamplitud) överlappar varandra för att bilda en enda virvelringen. (B) Flytande jet främre förskjutning som funktion av tid över puls amplitudområde (40-65 V) för fast puls nummer (200 pulser). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Blås Generation. Bilder av vesikler processen och flera blåsor produceras. (A) Deformering av droppen gränssnitt tvåskiktsmembran (DPhPC) framställt av snabba pulser av lösning orsaka membranet att nypa av och forma en GUV. (B) Många blåsor som genereras med hjälp av mikroflödes bestyckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många tekniker har utvecklats för vesikler generation, inklusive electroformation, emulsion, och droppgenerering 14-16. Nya experimentella tekniker dock är nödvändiga för att möjliggöra utformningen av biologiska system med allt större likheter med levande system. Mikroflödes metoder i synnerhet har erbjudit en ökad nivå av kontroll som styr membran unilamellarity, monodispersitet av storlek och interna innehåll 17,18, vilket vesikler modeller närmare biologi. Dessutom har karaktärisering och experiment med hjälp av mikroflödes bestyckningen visat effektiv inkorporering av orienterade membranproteiner, membran asymmetri, och inkapsling 3,13.
Denna teknik är enkel, men innehåller några steg där försiktighet bör vidtas. Både akryl blad och naturgummi måste bilda fullständiga tätningar med oändlighet kammaren under tillverkning. Annars kommer infinity-formade brunnar läcka och risk dubbelskikts stabilitet. Under experimentell förberedelse, måste forskaren se till att helt evakuera sprutan montering av luft, initialt och efter att fästa varje komponent. Bubbles inom denna församling skapar en kompressibel volym i strålen och mildra eller förneka bestyckningen effekten av piezoelektriska ställdon. Medan iordningställande av utrustningen, är det största problemet att skada den bräckliga bläckstrålemunstycket. Slutligen nedfallet av glukos kräver mest uppmärksamhet under stegen före vesikler generationen, eftersom det fastställer membranet för efterföljande bestyckningen.
Vesikler generation av mikroflödes bestyckningen är tillförlitlig och repeterbar, men avvikelser bland bläckstråleskrivare kräver viss erfarenhet och parametersättning. Enligt vår erfarenhet kan införandet av bläckstrålemunstycket i oändlighet kammaren före bestyckningen förskjuta upp till flera mikroliter av glukos beroende på munstyckenas storlek, som producerar en lätt böjning av dubbelskiktet bort frånbläckstråleskrivare. Genom oproportionerligt dispergera den glukoslösning när den ursprungligen upprättandet av dubbelskiktet, kan denna effekt kompenseras och en plan tvåskiktsmembran kommer att resultera. Detta ökar inte bara dubbelskikts stabilitet utan även ger bättre kontroll över blåsbildning. En 20 ^ m öppningsdiameter av bläckstråle användes för att erhålla resultaten som visas i detta dokument. En öppningsdiameter av 10-20 ^ m är att rekommendera. Minimering av vibrationer rekommenderas också, enkla gummi utskärningar användes för att stödja mikroskopbordet och dämpa laboratorie vibrationer.
Även om detta protokoll är tillämpligt på många lipider, var DPhPC valdes för dess speciella kemi och hög dubbellager stabilitet. Andra primära lipider testades var 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC). Jämförelsevis, DPhPC hade en starkare tendens att bilda en enhetlig dropp gränssnitt dubbelskikt och producera enlamellvesiklar. Vid förstaformation, dubbelskiktet i detta protokoll hade en skenbar tjocklek på grund av en icke-plana gränsytan och införlivandet av olja. Formen hos de vattenbaserade dropparna bildas en krökt dubbelskikt, och det verkade som en tjocklek i ett givet synfält. DPhPC tillät den initiala kontaktzonen på gränsytan mellan de två dropparna att expandera, driver oljan bort från dubbelskiktet. På grund av detta energimässigt gynnsam process, mer och mer av kontakten mellan de två dropparna blev en dubbellager, och det observer tjockleken minskat över tiden. Denna tillväxt av biskiktsregionen testades under variation av längden av dubbelskiktet, den initiala kammarkonstruktion justerades något (den andra generationen utformningen bestod av två cirklar med diametern 0,15 i separerade med ett centrum-till-centrumavstånd av 0,13 cm) att kräva mindre volymer och resulterade i en mindre bilager gränssnitt. Både den nya och ursprungliga konstruktion tillåts för exakt vesikler generation, men ingen av designen visade en DOMINmyra fördel i bilager gallring. En annan testade optimering var datorstyrda mottryck appliceras på piezoelektriska bläckstråleskrivare. Även om detta gav en mer kvantitativ kontroll över flödeshastigheten medan bestyckningen, var det inte används genom en majoritet av experimenterande.
Denna metod erbjuder de kombinerade fördelarna med flera existerande tekniker. Flera GUVs kan genereras med hög frekvens (~ 200 Hz) på grund av den höga koncentrationen av fettmolekyler, även om snabb vesikler generationen var inte i fokus för detta arbete. Eftersom denna teknik strålar mot en enda membranet, är membran unilamellarity förväntat och har observerats. Dessutom kan ett brett utbud av lösningar kapslas oberoende av specifika lösta egenskaper såsom molekylvikt eller laddning, vilket möjliggör fler potentiella tillämpningar 17. Också, på grund av storleken av vesiklar bildas (en rad är möjligt av> 10 ^ m till <400 ^ m), observation av konventionell mikroscopy tekniker är tillräcklig 13.
Microfluidic bestyckningen kan appliceras på en mängd olika biologiska problem. Ett konkret exempel är cellulär biomekanik, deformerbarheten av GUVs gör dem ett idealiskt verktyg för att studera styrkebidrag och själv montering av inkapslade aktin nätverk som visade intressanta effekter när den monteras på ytan av en GUV 4,19. Ytterligare applikationer är drogleveranssystem, cellstorlek bioreaktorer, och modulsystem för syntetisk biologi, biofysik, samt en mängd andra områden inom grundläggande vetenskap, industri och medicin där compartmentalized biomolekyler önskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Mike Vahey från Fletcher Lab vid University of California, Berkeley för råd om microjetting parametrarna. Detta arbete sponsrades av NIH bidrag DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33 mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1 ml Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8 in Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | homemade | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
