L'analisi dei tessuti muscolari scheletrici per determinare le proprietà strutturali, funzionali e biochimiche è notevolmente facilitata da un'adeguata preparazione. Questo protocollo descrive i metodi appropriati per preparare il tessuto muscolare scheletrico per un'ampia gamma di studi di fenotipizzazione.
Articolo metodologico
Tissue Triage e Freezer per i modelli di malattia muscolare scheletrico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il muscolo scheletrico è un tessuto unico per la sua struttura e funzione, che richiede protocolli per la raccolta dei tessuti per ottenere risultati ottimali da valutazioni funzionali, cellulari, molecolari, e patologici. A causa della sottigliezza di alcune alterazioni patologiche viste nei disturbi muscolari congenite e il potenziale di fissazione di interferire con il riconoscimento di queste caratteristiche, la valutazione patologica del muscolo congelato è preferibile muscolare fisso nel valutare muscolo scheletrico per malattia muscolare congenita. Inoltre, il potenziale di produrre gravi artefatti congelamento nel muscolo richiede precauzioni specifiche per la congelazione muscolo scheletrico per l'esame istologico che non vengono comunemente utilizzati per la congelazione altri tessuti. Questo manoscritto descrive un protocollo per congelamento rapido del muscolo scheletrico utilizzando isopentano (2-metilbutano) raffreddato con azoto liquido per mantenere ottimale la morfologia del muscolo scheletrico. Questa procedura è efficace anche per freezing tessuto destinati a studi di espressione genetica o proteine. Inoltre, abbiamo integrato il nostro protocollo di congelamento in un procedimento più ampio che descrive anche i metodi preferiti per il triage a breve termine di tessuto per (1) sola fibra studi funzionali e (2) coltura cellulare dei mioblasti, con un focus sullo sforzo minimo necessario per raccogliere tessuti e trasportarlo in ricerca o di riferimento laboratori specializzati per completare questi studi. Nel complesso, questo manoscritto fornisce una descrizione di come tessuto fresco può essere efficacemente distribuito per una varietà di studi fenotipici e quindi fornisce procedure operative standard (POS) per studi patologici legati alla malattia muscolare congenita.
Introduzione
Il muscolo scheletrico è un tessuto unico per la sua struttura e funzione, che può presentare una serie di sfide quando si valuta la sua patologia. Sebbene sia sufficiente, e spesso anche ottimale, valutare la maggior parte dei tessuti dopo la fissazione in formalina e l'inclusione di paraffina, questo processo porta alla produzione di artefatti da restringimento cellulare che compromettono la valutazione dei fenotipi critici nella malattia muscolare congenita (comprese le dimensioni e la forma delle miofibre). Inoltre, il muscolo congelato è necessario quando si eseguono molte colorazioni istochimiche (tra cui la nicotinammide adenina dinucleotide ridotta (NADH), la citocromo ossidasi (COX), la succinato deirogenasi (SDH), l'adenosina trifosfatasi (ATPasi) e le colorazioni Oil Red O) che sono essenziali per il rilevamento di specifiche anomalie patologiche necessarie per diagnosticare una varietà di miopatie congenite, miopatie mitocondriali e malattie da accumulo. Molti anticorpi e strumenti molecolari utilizzati per caratterizzare la morfologia e la funzione muscolare sono stati di conseguenza sviluppati e ottimizzati solo per il tessuto congelato, il che limita ulteriormente l'utilità dei preparati di tessuto fisso negli studi di biologia del muscolo scheletrico. Di conseguenza, è diventata pratica standard congelare campioni di muscolo scheletrico per la maggior parte delle indicazioni cliniche e di ricerca nel campo delle malattie muscolari congenite, nonostante le sfide tecniche che un congelamento appropriato potrebbe comportare.
Il congelamento del muscolo scheletrico può essere tecnicamente impegnativo a causa dell'alta probabilità di formazione di cristalli di ghiaccio all'interno delle miofibre quando viene seguito un protocollo di congelamento inappropriato1. Nella maggior parte dei casi, gli artefatti da congelamento si verificano quando il contenuto di acqua del tessuto è troppo elevato o quando il processo di congelamento è troppo lento. Il contenuto d'acqua del tessuto può essere accidentalmente aumentato dall'immersione in fluido, come il trasporto del muscolo in soluzione salina; o il congelamento può essere compromesso se il tessuto è stato completamente immerso nell'OCT. Entrambe queste procedure possono portare a catastrofici artefatti da congelamento nel tessuto muscolare. Inoltre, una serie di piccoli passi falsi nel processo di congelamento possono causare un congelamento lento o lo scongelamento accidentale dei campioni dopo un congelamento appropriato e questi problemi possono complicare allo stesso modo la valutazione patologica.
Man mano che vengono sviluppati nuovi modelli e trattamenti per la malattia del muscolo scheletrico, diventerà sempre più utile utilizzare procedure operative standard (SOP) per valutare i fenotipi del muscolo scheletrico e l'efficacia del trattamento. Ciò è particolarmente importante per la valutazione patologica delle malattie muscolari congenite, poiché il riconoscimento di fenotipi sottili osservati in molte di queste malattie può essere compromesso da una preparazione tissutale impropria. Questo rapporto rappresenta uno sforzo da parte di un consorzio per le malattie muscolari congenite per stabilire una SOP di congelamento del muscolo scheletrico per lo studio di modelli di malattia muscolare congenita.
Il protocollo qui presentato descrive una strategia utilizzata nei nostri laboratori clinici e di ricerca per ottimizzare la valutazione della patologia del muscolo congelato, pur essendo adatto anche per una varietà di studi genetici e basati su proteine. Vengono inoltre presentate strategie specifiche per la preparazione di campioni di muscolo scheletrico per la microscopia elettronica. Inoltre, poiché è possibile eseguire test funzionali su una singola fibra di tessuto congelato2,3, gli esperti di queste tecniche hanno fornito dettagli sui protocolli ottimali di manipolazione dei tessuti. Sfortunatamente, l'isolamento di linee cellulari di mioblasti non può essere eseguito efficacemente su tessuto precongelato, quindi qui viene presentata una strategia per lo stoccaggio e il trasporto a breve termine di tessuto muscolare per lo stabilimento di colture di mioblasti presso laboratori esterni. Nel complesso, i metodi qui descritti forniscono linee guida per il trattamento appropriato del tessuto muscolare per una varietà di studi patologici, funzionali, molecolari e cellulari, indipendentemente dalle capacità in loco di un determinato laboratorio.
Protocollo
Etichettare i contenitori da utilizzare per lo stoccaggio dei muscoli con gli identificatori appropriati per l'animale e il muscolo raccolto. Pre-raffreddano i sacchetti / contenitori e strumenti per evitare congelamento / scongelamento del tessuto quando viene aggiunto.
1. Considerazioni di studio-progettazione per il tessuto muscolare Collection
- Per piccoli animali (murini) modelli di malattia muscolare, usa un intero muscolo per lo studio in quanto piccoli modelli animali spesso richiedono la valutazione di un intero muscolo di fornire sufficiente campionamento myofiber per gli studi patologici. Per grande animale (canino) modelli di malattia muscolare, usa porzioni muscolari che sono almeno 0.3 x 0.3 cm o maggiore nella loro trasversale (trasversale) aspetto.
NOTA: biopsie nucleo può essere utilizzato anche, ma possono essere ottimale per studi di caratterizzazione primari a causa di problemi di campionamento. - Per gli studi che coinvolgono il sarcomero, la misura ultrastrutturali della lunghezza del sarcomero può comprendere un endpoint critico e può require specializzata manipolazione. Questo è di solito rilevante solo nelle malattie in cui gli elementi del sarcomero spettacolo lunghezze appropriato, come in alcune cause di nemaline miopatia. Alcuni laboratori preferiscono riparare il muscolo nel suo stato non-contratto o allungato, anziché effettuare queste misurazioni sul muscolo non in tensione o non allungato.
- Se non sarà misurata lunghezza sarcomero, fissare il tessuto muscolare senza pre-stiramento del muscolo collocandolo direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti).
- Se saranno misurate le lunghezze sarcomero, possono essere utilizzate diverse tecniche di pre-allungare il muscolo (vedi Discussione):
- Utilizzare un dispositivo di bloccaggio per tenere il muscolo sua tensione di riposo, mentre è ancora in animale, asportare il muscolo intorno alla parte esterna della pinza, ed inserire direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti).
- Allungare e pin muscolo ad una superficie (ad esempio un pezzo di sughero) ad una lunghezza simile a quella osservata in vivo dopo che è stato estratto dall'animale.
2. Sub-dividere il isolata del muscolo scheletrico in frammenti che sono appropriati per gli Studi desiderati (Figura 1)
- Per congelati istologia muscolare:
- Includere tanto di un determinato muscolo possibile per minimizzare i bias di campionamento (vedi punto 1.1), ma i campioni devono essere <1,5 centimetri per evitare il congelamento artefatti.
- Trattare tutti i muscoli dallo stesso studio simile per evitare che le differenze artefatti nelle dimensioni delle fibre a causa di differenze di trattamento.
- Per la microscopia elettronica (EM):
- Tagliare un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 centimetri striscia di muscolo dal campione, con l'asse longitudinale del campione parallelo all'asse longitudinale del muscolo originale.
NOTA: Il fissativo non sarà adeguatamente penetrare spessi pezzi di tessuto, in modo da mantenere lo spessore del campione pari o inferiore a 2 mm è fondamentale per ottenere risultati adeguati. Inoltre,l'orientamento di tali piccoli frammenti di muscolo è spesso difficile, è consigliabile utilizzare un frammento di tessuto che imita l'orientamento effettivo del muscolo (cioè, l'aspetto più lungo dei campione fissato è l'orientamento longitudinale del muscolo / miofibre) a minimizzare la movimentazione e la confusione durante la lavorazione EM.
- Tagliare un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 centimetri striscia di muscolo dal campione, con l'asse longitudinale del campione parallelo all'asse longitudinale del muscolo originale.
- Per la coltura cellulare:
- La resa cella desiderata può influenzare la quantità di muscolo necessaria per lo stabilimento di coltura cellulare. Muscoli singoli (o porzioni di muscoli) da piccoli animali possono fornire il numero di cellule sufficienti a stabilire colture cellulari, quindi, se necessario, piscina tessuto da più muscoli.
3. Fissazione lavorazione di tessuti e per la microscopia elettronica (EM)
- Collocare un frammento di muscolo non superiore a 2 mm sua dimensione più sottile direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti).
- Posizionare il muscolo in tampone fissativo EM (vedi Reagenti), dopo 2-48 ore di fixation. Fissazione prolungata (per settimane o mesi) può causare la perdita di dettaglio ultrastrutturale per studi EM.
- Invia ad un impianto di base di EM per l'elaborazione.
4. Congelamento muscolare per istologica, biochimica e studi molecolari
- Rimuovere eccessiva umidità nel campione COMPLETAMENTE tamponando il campione con un tovagliolo di carta finché il tessuto è leggermente aderente al telo. Eccessiva umidità produrrà significativi manufatti di congelamento nel muscolo.
NOTA: tessuto può essere ulteriormente asciugato facendolo rotolare in polvere per bambini. Questo passaggio non è generalmente necessaria per i muscoli meno che non siano stati in un ambiente eccessivamente umido. - Posizionare OCT (o un adesivo simile come la gomma adragante) sul fondo di una cryomold superficiale o sul sughero, con solo abbastanza Office per fornire una base per il muscolo orientato (Figura 2C). Etichettare il sughero o cryomold prima il congelamento può essere utile per il monitoraggio del campione.
- Carefully posizionare il muscolo nello stampo con l'orientamento desiderato, con la maggior parte del muscolo sporgente dal PTOM in modo che il muscolo sezionata non è in contatto con OCT (Figura 2C).
- Aggiungere isopentano a una tazza di metallo fino a raggiungere una profondità di circa 3-4 cm.
- Indossare guanti di protezione termica e rimuovere il coperchio di Dewar.
- Posizionare o tenere la tazza di metallo a contatto con l'azoto liquido, in modo che il livello di azoto liquido sulla parte esterna della coppa è superiore al livello del isopentano all'interno della tazza. Strategie per organizzare questi contenitori sono mostrati nella Figura 2.
- Non consentire l'azoto liquido per entrare nella tazza di metallo, in quanto produce una schiuma spumeggiante che può essere ingombrante per lavorare con (ed è anche sufficientemente freddo per congelamento).
- Osservare il isopentano per determinare quando ha raggiunto la temperatura adeguata. Alla temperatura appropriata (ottimale tra -140 a -149 ° C), cosìCoperchio bianco ciottoli di isopentano congelati formeranno (dopo pochi minuti, e dopo la nebbia iniziale è scomparso sopra la isopentano) sul fondo della coppa, oppure la soluzione generalmente addensare alla consistenza di melassa. Congelamento prima di questa fase sarà resa atifacts congelamento.
- Se il isopentane blocca del tutto solida, scongelare e chill al congelamento di nuovo le temperature prima di riutilizzarli.
- Utilizzando pinze pre-refrigerati, abbassare il campione e sughero / muffa nella isopentane per circa 10-20 sec.
- Porre il campione congelato in un contenitore pre-raffreddato.
- Mantenere campione e contenitore in ghiaccio secco in ogni momento fino al trasferimento in un -80 ° C freezer.
5. Se Artifact congelamento è presente nel tessuto già congelati, è possibile migliorare il grado di Artefatto congelamento utilizzando la seguente "Disgelo e Congelare nuovamente" Procedura
- Prendere blocchi dal congelatore, una alla volta, E tenerli in ghiaccio secco. La tempistica di questo protocollo è fondamentale. Scongelare e ricongelare un blocco alla volta soltanto.
- Spostare campione dal ghiaccio secco a RT.
- Se il campione è stato incorporato in OCT, rimuovere PTOM circostante il più completamente possibile utilizzando un bisturi.
- Lasciare il campione scongelamento a temperatura ambiente fino al punto in cui è completamente scongelato, ma non fino al punto in cui si sta asciugando fuori.
- Spingere delicatamente il campione con una pinza per garantire che il campione è completamente scongelato prima di passare alla fase successiva.
- Congelare il muscolo, come specificato nei passaggi 4,1-4,10.
6. Preparazione di Muscle per pelate in fibra single Testing Funzionale
- Il regime di custodia per il muscolo dipende da quando il muscolo / fiber viene utilizzato per esperimenti.
- Per l'uso nel giro di poche settimane, posizionare il muscolo in una soluzione di 50% glycerol/50% soluzione rilassante (vedi Reagenti), e conservare a -20 ° C.
- Per uso poppaer un paio di settimane, posizionare il muscolo in una soluzione del 75% glycerol/25% soluzione rilassante (vedi Reagenti), e conservare a -80 ° C.
- In alternativa, lasciare asciugare muscolare, perno di sughero, e negozio on granuli di silice a -80 ° C. Questi muscoli disidratati possono essere usati per anni.
7. Preparazione del muscolo fresco per la spedizione di coltura cellulare per laboratori esterni
Protocolli per la creazione di colture cellulari sono stati ben descritto altrove 4-7.
- Riempire una provetta sterile da 50 ml con sterile terreno di coltura completo.
- Aggiungi il tessuto muscolare per il tubo con una pinza sterile, sommergendo completamente il tessuto in media.
- Riempire il resto del tubo con mezzi per impedire l'essiccazione durante la spedizione.
- Aggiungi impacchi di ghiaccio alla scatola di polistirolo e posizionare il tubo conico vicino a numerosi impacchi di ghiaccio.
- Si prega di notare che dovrebbero essere usati solo impacchi di ghiaccio (e non ghiaccio secco)per evitare danni da congelamento del liquido e tessuto.
- Pacchetti Nave O / N, ma i tessuti possono durare due giorni in queste condizioni.
Risultati
Per fornire esempi di manufatti visto con il congelamento improprio, diversi quadricipiti muscoli di topo sono stati congelati utilizzando diverse tecniche (Figura 3) per replicare gli errori comunemente riscontrati. Come mostrato in Figura 3A, muscolo scheletrico opportunamente congelato mostra una stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante (solitamente altre fibre muscolari, ma a volte lo spazio endomysial tra miofibre è riempito con fibrosi o cellule infiammatorie in una varietà di malattie o processi pregiudizio) e un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile. Per l'analisi patologica, la possibilità di visualizzare lo spazio intracellulare è spesso più importante del vano endomisio, come di solito è fondamentale individuare chiaramente la presenza di cambiamenti degenerativi, cambiamenti rigenerativi o altri reperti patognomonici (nuclei centrali, inclusioni intracellulari) in questa spazio. Pertanto, la presenza di cristalli di ghiaccio nel compartimento intracellulare rappresenta amproblema RINCIPALI nella valutazione patologica del muscolo.
La corretta congelamento del tessuto muscolare richiede entrambe le temperature sufficientemente fredde e una velocità sufficiente di congelamento per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio. Anche quando contabilità per entrambi i fattori, notevole manufatto congelamento può ancora verificarsi a causa di eccessiva umidità all'interno del tessuto muscolare. Questo problema è più comunemente riscontrato nel tessuto muscolare precedentemente immerso in soluzione fisiologica e sufficientemente secche o quando il muscolo è stata in contatto diretto con il mezzo di montaggio Ott sito di sezionamento (Figura 3B, 3E). Mentre qualche contatto con ottobre è di solito inevitabile come conseguenza del processo di montaggio, dovrebbe essere fatto ogni sforzo per evitare il contatto tra le aree che saranno istologicamente valutato e ottobre utilizzato per il montaggio. Al contrario, i campioni congelati con un -80 ° C freezer (Figura 3C) e l'azoto liquido (Figura 3D) forniscono esempios del manufatto congelamento che è prodotto dalla temperatura non ottimale o velocità di congelamento. Il processo di congelamento lento incontrato mettendo tessuto in un -80 ° C freezer fornisce un esempio estremo di congelamento manufatto. Quando si utilizza l'azoto liquido, il problema principale è che il contatto tra azoto liquido e il tessuto provoca una guaina di azoto gassoso per formare all'interfaccia tessuto-liquido, e questa interfaccia gassoso non è sufficientemente fredda per produrre muscolare rapida congelamento 1. Questo può produrre artefatti significativi congelamento vicino alla superficie del campione, ma zone interne del campione hanno maggiori probabilità di flash freeze ad un tasso adeguato e può essere interamente risparmiata di congelamento manufatto. Mentre la semplice immersione del tessuto muscolare in azoto liquido non è neanche lontanamente utile come il processo isopentano congelamento, può essere utile per il congelamento di campioni di muscolo di grandi dimensioni in situazioni in cui isopentano non è disponibile (come ad esempio i campioni autoptici clinici a istituzionilaboratori di patologia muscolare clinici out). Risultati utilizzando questa strategia sono generalmente migliori quando si utilizzano grandi porzioni di tessuto (> 2 cm di varie dimensioni).
Mentre evitare manufatto congelamento fornisce risultati istologici ottimali, è stato anche sviluppato una tecnica (e descritto) che inverte sostanzialmente congelamento artefatti consentire la valutazione del tessuto impropriamente congelato. Tessuto che viene impropriamente congelato (Figura 3E) può essere scongelato e ricongelato in condizioni strettamente controllate (Figura 3F) per consentire la ridistribuzione dell'acqua all'interno delle fibre, e il grado di conservazione morfologica che è ottenibile può essere eccellente. Nella nostra esperienza, questo processo conserva la morfologia intracellulare del tessuto in misura notevole, ma spesso produce una separazione artefatta di fibre all'interno dello spazio dell'endomisio. Come molti endpoint patologiche si trovano nello spazio intracellulare e quellilo spazio endomisio sono meglio visualizzato con colorazioni speciali (sia per evidenziare fibrosi o per identificare altri tipi di cellule), questi cambiamenti artefatti difficilmente compromettere veramente la valutazione patologica del muscolo.
Figura 1. Triage di tessuto per studi strutturali, funzionali e cellulari del muscolo scheletrico. Seconda dei tipi di studi desiderati, tessuto muscolare scheletrico raccolti vengono elaborati in una varietà di modi per ottenere risultati ottimali. I protocolli descritti in questo documento descrivono i metodi per la valutazione degli o il trattamento di campioni di muscolo scheletrico per gli studi off-site per ottimizzare i risultati ottenibili dalle strutture centrali di esperti.
Figura 2. Esempi di apparecchiature utilizzate per congelamento muscolare. Come descritto nel protocollo, congelamento ottimale muscolare richiede immersione del tessuto muscolare in isopentano che si trova alla temperatura di congelamento. Un mezzo sicuro ed efficiente di ottenere isopentano ghiacciata prevede l'utilizzo di un contenitore metallico per la isopentano che viene raffreddato in un Dewar contenente azoto liquido circostante. Come è spesso conveniente avere entrambe le mani libere, è possibile utilizzare un tutore come un anello di supporto (A) per ospitare il contenitore isopentano in azoto liquido evitando la miscela dei due liquidi. In alternativa, il contenitore potrebbe anche essere mantenuta l'azoto liquido manualmente (B). In entrambi i casi, il tessuto non deve essere collocato in isopentano fino alla isopentano è visibilmente gelata sul fondo del contenitore (solitamente ciottoli bianchi opachi) e quindi deve essere immerso per 10-20 secondi per consentire il completo congelamento. Isopentane a temperatura di congelamento produce minimal "nebbia", (cioè, la temperatura è insufficiente se considerevole presenza di nebbia). Una volta che il tessuto è congelato, metterlo direttamente in contenitori pre-raffreddati (e poi direttamente in un dispositivo di raffreddamento o freezer) per evitare lo scongelamento accidentale dopo il congelamento. Muscolare (C) opportunamente montato congelato dovrebbe avere la maggior parte del tessuto muscolare che sporge da una base di congelati ottobre
Figura 3. Esempi di congelamento artefatto, e di un efficace scongelamento / ricongelamento. Immagini rappresentative della (A) dei muscoli opportunamente isopentano congelati, (B) il muscolo congelate in modo adeguato in isopentano, ma mentre in contatto con il mezzo di montaggio ottobre, (C) del muscolo congelato in un congelatore -80 ° C, e (D ) muscolo congelato in azoto liquido, i quali visualizzare vari gradi di congelamento manufatto. Come mostrato in (B), l'alto contenuto di liquido di ottobre produce significativi artefatto congelamento nel muscolo che è in contatto con esso, deve essere utilizzato in modo che solo la quantità minima di ottobre necessaria per il montaggio, e il muscolo per la valutazione istologica dovrebbe essere "permanente out "dalla sua superficie. La lentezza del processo di congelamento utilizzando un (C) -80 ° C o congelatore (D) azoto liquido (rispetto alla velocità di congelamento in isopentano ghiaccio freddo) può portare alla produzione di artefatti significativi congelamento. Pannelli E e F spettacolo muscolo stesso campione che era (E) inizialmente subottimale congelati (a causa di un contatto eccessivo con OCT) e poi (F) scongelati e ricongelati utilizzando la tecnica qui descritta. Mentre si può osservare una certa separazione artefatta tra le fibre nel campione ricongelati, l'i miglioramenton la morfologia intracellulare delle fibre muscolari è evidente. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussione
Il muscolo scheletrico è un tessuto strutturalmente e funzionalmente unico, e sono necessari per consentire la valutazione ottimale dei parametri strutturali e funzionali procedure di preparazione specializzati. Mentre una varietà di tessuti sono comunemente congelato per studi patologici in contesti clinici e di ricerca, protocolli di congelamento per tessuti non muscolari generalmente comportano la totale immersione del tessuto in OCT prima del congelamento. Come mostrato in figura 3, tale protocollo è inadatto per la valutazione patologica del muscolo scheletrico e tuttavia è abbastanza simile al protocollo qui descritto che ciò è un errore comunemente incontrati. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire un protocollo semplice per la corretta gestione del muscolo per evitare problemi come questo. Consigli è stato compilato sulla corretta manipolazione di muscoli per off-site fisiologico e studi cellulari nel tentativo di agevolare l'acquisizione di dati di alta qualità dai laboratori centrali esterne nei casi wheri studi sul posto non sono preferibili o possibile.
Come notato in questo protocollo, elementi che sono assolutamente essenziale per il corretto trattamento dei muscoli per studi patologici includono minimizzare il contenuto di acqua del tessuto, diminuendo la temperatura alla quale il muscolo è congelato, e aumentando la velocità con cui si ottiene il congelamento. Un'eccessiva umidità all'interno del tessuto o eccessiva lentezza del processo di congelamento (prodotto da temperature insufficienti o dalla mancanza di un contatto diretto tra l'agente e il congelamento del tessuto, come si incontra con azoto liquido) porterà a congelamento artefatti che possono alterare analisi patologica. Come Ottobre fornisce un'ulteriore fonte di umidità dei tessuti, molti laboratori usano altri adesivi come gomma adragante come substrato incorporamento. Anche nei casi in cui il congelamento viene eseguita in modo appropriato, occorre prestare attenzione per evitare di esemplari successivamente accidentalmente scongelamento attraverso il contatto con contenitori o strumenti RT.Così, un processo di congelamento successo richiede un grado di pianificazione che comprende un pre-raffreddamento di tutti gli strumenti e contenitori da utilizzare. Quando artefatti congelamento si incontrano, c'è un metodo qui descritto per il recupero del tessuto che è sufficiente per la maggior parte delle valutazioni patologiche. Tuttavia, questo ciclo di congelamento / scongelamento non offre perfetta istologia e ha il potenziale di compromettere altri studi molecolari o enzimatica del tessuto (oltre al tempo necessario per ri-congelare il tessuto), quindi utilizzando appropriate tecniche di congelamento iniziale è di gran lunga preferibile . Nei casi in cui il congelamento manufatto viene rilevata sul tessuto pre-congelato, tuttavia, la tecnica qui descritta può essere estremamente utile.
Fissazione e lavorazione di tessuti per EM in grado di offrire sfide tecniche specifiche che richiedono una pianificazione prima della raccolta del tessuto. L'errore più comune quando il prelievo dei campioni per EM prevede l'utilizzo di frammenti di tessuto che sono troppo spessi per glutaraldehyde di penetrare. Come glutaraldeide penetra solo circa 0,1 cm nel tessuto muscolare da una superficie data, la cura dovrebbe essere presa per assicurare che una dimensione dei campioni EM è più spesso di 0,2 centimetri. Inoltre, come EM è un ottimo mezzo per valutare direttamente l'apparato contrattile, alcuni ricercatori hanno sviluppato strategie di pre-tensione o pre-stiramento del muscolo prima della fissazione per consentire la misurazione di elementi contrattili ad una tensione fisiologicamente rilevanti. Non esiste un protocollo standard per il pre-tensionamento, ma due strategie sono brevemente descritte in questo protocollo. Va notato che i tentativi di pre-tensionamento del muscolo può produrre risultati imprevedibili se non sono fatte in modo molto specifico, e può essere preferibile fissare muscoli nello stato lasco per evitare modifiche artefatti di lunghezza sarcomero attraverso un non-standard procedura di pre-tensionamento 8,9. Per i muscoli in cui tali misure specifiche non sono necessarie (compresa la maggior parte biopsies eseguite per scopi clinici), sforzi di pre-tensionamento del muscolo non sono generalmente realizzati, e l'effetto principale sulla morfologia muscolare è una spaziatura non uniforme dei sarcomeri nel muscolo.
Questo documento rappresenta il primo di una serie di fornire SOP per l'esecuzione di prove in campo malattia muscolare congenita, e rappresenta gli sforzi di oltre 20 esperti del settore malattia muscolare congenita che abitualmente esegue cellulare, molecolare, funzionale, fisiologico e la ricerca patologica. Una gamma di POS pubblicati sarà reso disponibile nel corso del prossimo anno, ed i protocolli necessari e opportuni formati di pubblicazione per ciascuna sono stati discussi in un muscolo congenita malattia Consortium Workshop tenutosi nel mese di aprile del 2013 a Washington DC L'obiettivo di questo sforzo SOP è quello di fornire una tabella di marcia per la sperimentazione necessaria e l'analisi di campioni nel campo malattia muscolare congenita a 1) uniformare le pratiche e gli endpoint utilizzati nel nostro campo come male come possibile e 2) fornire istruzioni su pratiche standard per i nuovi ricercatori nel nostro campo. Noi crediamo che queste risorse potranno facilitare l'ingresso di nuovi ricercatori nel nostro campo sotto-studiato e migliorare la portata della ricerca che possono essere eseguite così. Inoltre, una standardizzazione delle pratiche sarà estremamente utile per confrontare i dati tra gli studi e per identificare gli endpoint per la pianificazione e l'esecuzione di studi preclinici e clinici.
Sebbene l'obiettivo principale di questo articolo è correlato al congelamento e preparazione di tessuti adatti per una varietà di studi, il gruppo di collaborazione anche discusso gli endpoint utili per l'analisi patologica dei campioni muscolari. Allo stato attuale, non vi è consenso ufficiale l'approccio da adottare quando si esegue l'analisi patologica, e una varietà di diversi studi vengono eseguiti a relazionarsi nuove scoperte a pubblicazioni precedenti per ciascuna malattia. Così, abbiamo pensato che sarebbe utileproporre alcune linee guida generali per la programmazione degli endpoint patologici nel muscolo patologia caratterizzazione. Prima di quantificare la patologia in uno studio, considerevole pensiero dovrebbe essere messo in 1) il metodo di misurazione della dimensione delle fibre, 2) la possibilità di anomalie fibra-specifico tipo o gli effetti del trattamento, 3) la possibilità di anomalie o effetti che sono limitati a singoli muscoli, e 4) una strategia per quantificare patologici che sono caratteristici per la malattia in studio. Dimensioni delle fibre è un endpoint necessario per la maggior parte degli studi, e purtroppo ci è ampia variazione nel modo in cui viene quantificato. Molti studi riportano questi risultati con i metodi di quantificazione automatici forniti dal software di imaging proprietario, ma molti di questi programmi prendono scorciatoie (come nell'ipotesi in cui le fibre sono cerchi o ellissi) che possono rendere queste misurazioni automatizzate imprecisa. E 'necessario capire come questi programmi automatici fanno le loro misurazioni brima di avere fiducia nelle misure e lo incoraggiano i ricercatori a comprendere questi dettagli nei metodi di carta. Inoltre, la misurazione specifico utilizzato per indicare la dimensione delle fibre è estremamente variabile, e alcune misure sono preferibili ad altri 10,11. Una misura comunemente usata di dimensioni delle fibre è l'area della sezione trasversale di fibra (CSA), in particolare perché gli investigatori effettuano studi fisiologici standardizzare i risultati di misurazioni CSA ottenuti utilizzando i loro strumenti. Purtroppo, mentre misure CSA possono riflettere accuratamente dimensioni delle fibre in sezioni trasversali perfette, sono ampiamente in funzione dell'orientamento fibra (nella misura in cui le fibre longitudinali o obliquamente sezionata avranno misurazioni artificialmente elevati CSA) e sono risultati così non ideali per dimensioni delle fibre. Una misura preferibile di dimensioni delle fibre che è meno dipendente fibra sezione trasversale è il diametro minimo di Feret (diametro MinFeret), che è la misura del secoloe diametro minore nella cellula muscolare 12. Questa misura è solo leggermente in funzione dell'orientamento della fibra ed è generalmente la clinica oro standard per la misura della fibra, e gli investigatori sono incoraggiati a muoversi verso l'uso di questa tecnica. Queste misure possono spesso essere effettuate utilizzando lo stesso software che genera le misurazioni CSA 13, ed è anche semplice da misurare manualmente. Per quanto riguarda la valutazione dei dati patologici secondo tipo di fibra, muscolo specifico, e nel contesto dei risultati patologici relative alla patologia specifica, questi sono argomenti meno controversi che dovrebbe essere considerato durante la progettazione di uno studio. Tipo di fibra può essere valutata mediante colorazione immunoistochimica o ATPasi, ma è utile considerare che i muscoli specifici e specie animali hanno specifiche miscele di tali tipi di fibre (che richiedono quindi diverse aspettative e strategie di sperimentazione). Muscle coinvolgimento patologico specifico o l'efficacia del trattamentopuò verificarsi, e il peso totale del muscolo rispetto ai controlli può essere utilizzato per identificare il grado di eterogeneità della malattia prima di decidere muscoli per valutare patologicamente. Infine, è noto che molte malattie muscolari sono associati ad alterazioni patologiche specifiche (quali steli in nemaline miopatia nemaline 14,15), e così è anche utile considerare se queste anomalie si trovano in un muscolo-fibra-tipo o distribuzione specifico quando si esegue l'analisi 16,17. Nel complesso, mentre noi non proponiamo una serie inflessibile di standard per la valutazione del muscolo, crediamo che tali questioni dovrebbero essere considerati prima della realizzazione di studi patologici in qualsiasi malattia del muscolo scheletrico.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa pubblicazione è finanziata attraverso Cure CMD, una sovvenzione dell'Association Contre Les Myopathies (AFM) (progetto 16297) e il National Institutes of Health (numeri di sovvenzione K08 AR059750 e L40 AR057721). Ringraziamo anche la dottoressa Julie Tetzlaff per la sua assistenza nella revisione di questo manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Per il congelamento | |||
| Dewar con azoto liquido con un dispositivo di prelievo di liquidi | Biogenic Systems | Lab-5 Series | Qualsiasi altro dewar con azoto liquido potrebbe essere sostituito. |
| Contenitore conduttivo a freddo | Fisher | 02-583A | |
| Ampio contenitore isolato in grado di contenere azoto liquido | Nalgene | 4150-2000 | |
| Termometro a termocoppia Oakton Temp 10 | Thomas Scientific | 1228Y01 | Opzionale, ma può essere molto utile per identificare il punto in cui l'isopentano si congela. |
| funzionali a fibra singola | |||
| Piastra di Petri | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Rivestimento Sylgard | Adesivi Ellsworth | 3-6636 | |
| Stereomicroscopio di dissezione | Apparecchio di Harvard | 693101 | Qualsiasi altro microscopio di dissezione potrebbe sostituirlo. |
| Per la coltura | |||
| Cappa sterile a flusso laminare | Thermo Scientific | 51022485 | Qualsiasi altra cappa per coltura cellulare potrebbe sostituirla. |
| Per il congelamento dei | |||
| Sacchetti/contenitori di plastica | Nasco | B01009WA | |
| Guanti di sicurezza termici | Denville | G4162 | |
| Visiera | Fisher Scientific | S47640 | |
| Pinze lunghe | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Graffette per marcatori | 125328 | ||
| Per colture | |||
| Provette coniche sterili da 50 ml | Denville | C1060-P | |
| PES, 500 ml, 0,22 &; m | Denville | F5227 | |
| Pinze sterili | Fisher Scientific | 644320 | |
| Impacchi di ghiaccio | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Scatola isolata in polistirolo | Polar Tech | 207F | |
| Nastro da imballaggio | Graffe | 795570 | |
| Congelamento | |||
| Azoto | liquidoAirgas | Conservare l'azoto liquido in contenitori progettati per liquidi a bassa temperatura | |
| Isopentano (2-metilbutano) | Sigma | M32631-4L | Conservare Isopentano in un armadio per materiali infiammabili. |
| Fissativo EM (scegline uno) | Dovrebbero essere disponibili anche tamponi senza fissativo, poiché i tessuti fissati EM dovrebbero essere trasferiti dal fissativo al tampone dopo diverse ore o giorni se non vengono immediatamente processati per EM. | ||
| 2,5% di glutaraldeide in tampone di cacodilato 0,1M | Microscopia elettronica Scienze | 16537-15 | |
| Fissativo di Karnovsky (3% glutaraldeide + 2% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1M) | Scienze di microscopia elettronica | 15732-10 | |
| Per studi funzionali (se lo si desidera) | |||
| Soluzione rilassante, contenente (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6,56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5,88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionato | Preparare una soluzione mescolando acido proprionico (Sigma P1386) e KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatina fosfato, pH 7,0 | Sigma | P7936 | |
| 0,4 leupeptina | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Soluzione per scuoiare, contenente | |||
| Soluzione rilassante (Vedi sopra) | |||
| 0,5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indice di granuli | |||
| di silice Pezzi piatti di sughero (1 x 1 pollice) | Microscopia elettronica | Sciences 63305 | |
| Glicerolo | Sigma | G2025 | |
| Per colture cellulari (se lo si desidera) | |||
| Terreno di crescita completo, contenente (per 500 ml) | Sterilizzare filtrando la soluzione attraverso una batteria da 500 ml 0,22 µ m Unità filtro PES. Negozio a 4 gradi C e utilizzare entro 1 mese. | ||
| 395 ml di Dulbecco' ad alto contenuto glicemico s Aquila modificata' s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml di siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml di 100X Penicillina-Streptomicina-Glutammina (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Consultare la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti gli altri reagenti per le specifiche di |
Riferimenti
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
Ristampe e permessi
