Анализ скелетных мышечных тканей для определения структурных, функциональных и биохимических свойств значительно облегчается соответствующей подготовкой. В этом протоколе описываются соответствующие методы подготовки скелетной мышечной ткани для широкого спектра исследований фенотипирования.
Методическая статья
Ткань Сортировка и морозильные моделей скелетных мышечных заболеваний
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Скелетных мышц является уникальным ткани из-за его структуры и функции, которые необходимы особые протоколы для сбора ткани для получения оптимальных результатов от функциональных, клеточном, молекулярном и патологических оценок. В связи с тонкостью некоторых патологических отклонений видели в врожденных мышечных расстройств и потенциал для фиксации мешать признанию этих особенностей, патологическая оценка замороженных мышцы предпочтительнее фиксированной мышцы при оценке скелетных мышц для врожденным пороком мышц. Кроме того, потенциал для производства серьезные артефакты замораживания в мышце требуется особых мер предосторожности при замораживании скелетные мышцы для гистологического исследования, которые обычно не используется при замораживании другие ткани. Эта рукопись описывает протокол для быстрого замораживания скелетных мышц с использованием изопентан (2-метилбутан) охлаждался жидким азотом, чтобы сохранить оптимальную морфологию скелета мышц. Эта процедура также эффективна для фreezing ткани, предназначенной для генетических или белковых исследований экспрессии. Кроме того, мы включили наш протокол замерзания в более широкий процедуры, которая также описывает предпочтительные методы для краткосрочного сортировки ткани для (1) одиночное волокно функциональных исследований и (2) культуры миобластов клетки, с акцентом на минимальных усилиях, необходимых для сбора ткани и транспортировать его в специализированных научно-исследовательских или справочных лабораторий своевременно завершить эти исследования. В целом, эта рукопись содержит набросок, как свежий ткань может быть эффективно распределены по разным фенотипических исследований и тем самым обеспечивает стандартные операционные процедуры (СОП) для патологических исследований, связанных с врожденным пороком мышц.
Введение
Скелетные мышцы являются уникальной тканью из-за своей структуры и функции, что может представлять ряд проблем при оценке ее патологии. В то время как достаточно, а часто даже оптимально, для оценки большинства тканей после фиксации формалина и встраивания парафина, этот процесс приводит к образованию артефактов усадки клеток, которые ухудшают оценку критических фенотипов при врожденных заболеваниях мышц (включая размер и форму миоволокон). Кроме того, замороженные мышцы необходимы при выполнении многих гистохимических окрашиваний (включая восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), цитохромоксидазу (ЦОГ), сукцинатдегирогеназу (СДГ), аденозинтрифосфатазу (АТФазу) и окрашивание маслом Red O), которые необходимы для выявления специфических патологических аномалий, необходимых для диагностики различных врожденных миопатий, митохондриальных миопатий и болезней накопления. Многие антитела и молекулярные инструменты, используемые для характеристики морфологии и функции мышц, были разработаны и оптимизированы только для замороженных тканей, что еще больше ограничивает полезность препаратов фиксированной ткани в исследованиях биологии скелетных мышц. В результате, стало стандартной практикой замораживание образцов скелетных мышц для большинства клинических и исследовательских показаний в области врожденных мышечных заболеваний, несмотря на технические проблемы, которые может возникнуть при соответствующем замораживании.
Замораживание скелетных мышц может быть технически сложным из-за высокой вероятности образования кристаллов льда внутри миоволокон при неправильном протоколе замораживания1. В большинстве случаев артефакты замораживания возникают при слишком высоком содержании воды в ткани или при слишком медленном процессе замораживания. Содержание воды в тканях может быть случайно увеличено при погружении в жидкость, например, при транспортировке мышцы в физиологическом растворе; или замораживание может быть нарушено, если ткань была полностью погружена в ОКТ. Обе эти процедуры могут привести к катастрофическим артефактам замораживания мышечной ткани. Кроме того, ряд небольших ошибок в процессе замораживания может привести к медленному замораживанию или случайному размораживанию образцов после соответствующего замораживания, и эти проблемы также могут осложнить патологическую оценку.
По мере разработки новых моделей и методов лечения заболеваний скелетных мышц, становится все более полезным использовать стандартные операционные процедуры (СОП) для оценки фенотипов скелетных мышц и эффективности лечения. Это особенно важно для патологической оценки врожденных мышечных заболеваний, поскольку распознавание тонких фенотипов, наблюдаемых при многих из этих заболеваний, может быть нарушено из-за неправильной подготовки тканей. Этот отчет представляет собой попытку Консорциума по врожденным мышечным заболеваниям создать СОП по замораживанию скелетных мышц для изучения моделей врожденных мышечных заболеваний.
Представленный здесь протокол описывает стратегию, используемую в наших клинических и исследовательских лабораториях для оптимизации оценки патологии замороженных мышц, а также подходит для различных белковых и генетических исследований. Также представлены конкретные стратегии подготовки образцов скелетных мышц для электронной микроскопии. Кроме того, поскольку функциональное тестирование замороженной ткани с помощью одного волокнавозможно2,3, эксперты по этим методам предоставили подробную информацию об оптимальных протоколах обработки тканей. К сожалению, выделение клеточных линий миобластов не может быть эффективно выполнено на предварительно замороженных тканях, поэтому в настоящем документе представлена стратегия краткосрочного хранения и транспортировки мышечной ткани для создания культуры миобластов во внешних лабораториях. В целом, описанные здесь методы дают рекомендации по надлежащей обработке мышечной ткани для различных патологических, функциональных, молекулярных и клеточных исследований, независимо от возможностей конкретной лаборатории.
Протокол
Этикетка контейнеры, которые будут использоваться для мышечной хранения с соответствующими идентификаторами для животных и мышцы заготовленной. Предварительного охлаждения сумки / контейнеры и инструменты для предотвращения замораживания / оттаивания ткани при его добавлении.
1. Учебно-проектирования для мышечной ткани коллекции
- Для мелких животных (мышиные) модели мышечных заболеваний, использовать весь мышцы для изучения, так как небольшие животные модели часто требуют оценки целой мышцы, чтобы обеспечить отбор проб достаточной мышечное волокно для патологических исследований. Для крупного животного (собачьи) модели мышечных заболеваний, использовать мышечные части, которые по крайней мере, 0,3 х 0,3 см или больше в их поперечном (в разрезе) аспект.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основные биопсии можно также использовать, но может быть неоптимальным для первичных исследований по характеристике из-за проблем отбора проб. - Для исследований с участием саркомера, ультраструктурным измерение длины саркомера может содержать критическую конечную точку и может Requгнев специализируется обработки. Обычно это требуется только актуально в заболеваний, при которых элементы саркомер шоу неподходящих длины, как и в некоторых причин немалиновой миопатия. Некоторые лаборатории предпочитают зафиксировать мышцы в его не-контракт или растянутом состоянии, а не выполнять эти измерения на не-натянутой или не растягивается мышцы.
- Если длина саркомера не будет измеряться, исправить мышечную ткань без предварительного растягивания мышц, поместив его непосредственно в нужное EM фиксатора (см. Реагенты).
- Если длины саркомера будет измеряться, могут быть использованы несколько методов предварительного растянуть мышцы (см. Обсуждение):
- С помощью зажимного устройства, чтобы держать мышцы на ее покоя напряжения, пока она еще в животном, вырезать мышцы вокруг наружной поверхности зажима, и поместить его непосредственно в желаемую EM фиксатора (см. Реагенты).
- Натяжные и приколоть мышцы к поверхности (например, кусок пробки) при длине аналогичной той, что наблюдается в естественных условиях после того, как был извлечен из животного.
2. Sub-разделить Изолированные скелетных мышц на фрагменты, которые соответствовали требуемой исследований (рис. 1)
- Для замороженных мышц гистологии:
- Включите столько данной мышцы, чтобы минимизировать смещение выборки (см. шаг 1.1), но образцы должны быть <1,5 см, чтобы избежать замораживания артефакты.
- Лечить все мышцы от того же исследования аналогично для предотвращения артефактом различий в размере волокон из-за различий в обращении.
- Для электронной микроскопии (ЭМ):
- Вырезать ~ 0,5 х 0,2 х 0,2 см полоски мышцы от образца, с продольной осью образца, параллельной продольной оси исходного мышцы.
Примечание: фиксатор не будет адекватно проникать более толстые куски ткани, так что поддержание толщины образца на 2 мм или менее имеет решающее значение в получении нужных результатов. Кроме того,как ориентация таких небольших фрагментов мышцы часто бывает трудно, желательно использовать фрагмент ткани, которая имитирует реальную ориентацию мышцы (т.е., самый длинный аспект неподвижного образца является продольная ориентация мышечных / мышечных волокон), чтобы минимизировать обработку и путаницы во время обработки ЭМ.
- Вырезать ~ 0,5 х 0,2 х 0,2 см полоски мышцы от образца, с продольной осью образца, параллельной продольной оси исходного мышцы.
- Для клеточной культуре:
- Желаемый выход клеток может повлиять на количество мышц, необходимую для создания клеточной культуры. Холост мышцы (или части мышц) от мелких животных может обеспечить недостаточное количество клеток по созданию клеточных культур, поэтому в случае необходимости, бассейн ткани из нескольких мышц.
3. Ткани фиксации и обработки для электронной микроскопии (ЭМ)
- Поместите фрагмент мышцы не выше 2 мм в самом тонком измерении непосредственно в нужной EM фиксатора (см. Реагенты).
- Поместите мышцы в EM фиксирующего буфера (см. Реагенты) после 2-48 часов из fixatiна. Длительное фиксация (в течение недель или месяцев) может привести к потере ультраструктурном подробно на ЭМ исследований.
- Отправить на основной объект EM для обработки.
4. Мышцы Замораживание для гистологического, биохимические и молекулярные исследования
- Удаление излишней влаги в образце путем тщательного блоттинга образца с бумажным полотенцем, пока ткань не является слегка прилегает к полотенцем. Повышенная влажность будет производить значительные артефакты замораживания в мышцах.
Примечание: ткань может быть дополнительно сушили путем прокатки его в детской присыпки. Этот шаг, как правило, не является необходимым для мышц, если они не были в чрезмерно влажной среде. - Поместите октября (или аналогичный клей, такие как трагакантовая камедь) в нижней части мелкой cryomold или на пробки, и только достаточно октября, чтобы обеспечить основу для ориентированной мышцы (рис. 2в). Маркировка пробку или cryomold перед замораживанием может быть полезно для отслеживания образца.
- CarefUlly разместить мышцы в форму в требуемой ориентации, при этом большинство мышцы, выступающей из октября так что разрезом мышца не находится в контакте с октября (рис. 2в).
- Добавить изопентан в металлическую чашку, пока он не достигает глубины примерно 3-4 см.
- Положите на тепловых защитных перчаток и снимите крышку сосуда Дьюара.
- Поместите или удерживать металлическую чашку в контакте с жидким азотом, так, чтобы уровень жидкого азота на внешней стороне чашки выше уровня изопентана на внутренней стороне чашки. Стратегии организовать эти контейнеры показаны на рисунке 2.
- Не позволяйте жидкий азот, чтобы войти в металлическую чашку, как она производит восходящей пены, которая может быть громоздким для работы с (а также недостаточно холодно для замораживания).
- Соблюдайте изопентан, чтобы определить, когда она достигла нужной температуры. При соответствующей температуре (оптимально от -140 до -149 ° С), таккрышка белая галька замороженного изопентана образуют (после нескольких минут, и после первоначального туман исчез над изопентан) на дне чашки, или раствора, как правило, сгустить до консистенции патоки. Замораживание до этой стадии даст atifacts замораживания.
- Если изопентан полностью замерзает твердой, таять и охладить его на температуру замерзания снова перед последующим использованием.
- Использование предварительно охлажденные щипцы, опустите образца и пробки / плесени в изопентана в течение примерно 10-20 сек.
- Поместите замороженные образцы в предварительно охлажденной емкости.
- Хранить образец и контейнер на сухом льду в любое время до перевода к -80 ° C морозильник.
5. Если Замораживание Артефакт присутствует в уже замороженной ткани, можно повысить степень замерзания Артефакт с помощью следующей «оттепели и замораживать" Порядок
- Возьмите блоки из морозильника, по одному за раз, И держать их в сухом льду. Сроки этого протокола является критическим. Только разморозить и заморозить один блок за раз.
- Перемещение образца с сухим льдом до комнатной температуры.
- Если образец было заложено в октябре, удалить окружающий октября как можно более полно с помощью скальпеля.
- Разрешить образец таять при комнатной температуре до точки, где она полностью талой, но не до такой степени, где она высыхания.
- Аккуратно подтолкнуть образец с пинцетом для того, чтобы образец полностью разморожены перед переходом к следующему шагу.
- Замораживание мышцы, как указано в шагах 4.1-4.10.
6. Подготовка мышц для стенками одному волокну функционального тестирования
- Процедура для хранения мышцы, зависит от того, когда мышца / волокно используется для экспериментов.
- Для использования в течение нескольких недель, поместите мышцы в растворе 50% glycerol/50% расслабляющий решение (см. Реагенты), и хранить при температуре -20 ° С.
- Для использования кормовойэ несколько недель, поместите мышцы в растворе 75% glycerol/25% расслабляющий решение (см. Реагенты), и хранить при -80 ° С
- С другой стороны, пусть мышц сухой, контактный для пробки, и хранить его на гранулы кремнезема при температуре -80 ° С. Эти обезвоженные мышцы могут быть использованы в течение многих лет.
7. Подготовка Fresh Muscle для пересылки клеточной культуры на улицу Laboratories
Протоколы для создания клеточных культур были хорошо описаны в другом месте 4-7.
- Заполните 50 мл стерильной коническую трубку со стерильным полной питательной среды.
- Добавить мышечной ткани к трубе с помощью стерильного пинцета, полностью погружая ткани в средствах массовой информации.
- Заполните оставшуюся часть трубки со средствами массовой информации, чтобы предотвратить высыхание во время транспортировки.
- Добавить льда в коробку из пенопласта и поместите коническую трубку возле нескольких пакетов льда.
- Пожалуйста, обратите внимание, что только пакеты со льдом (а не сухой лед) следует использоватьчтобы предотвратить повреждение от замерзания жидкости и ткани.
- Пакеты кораблей O / N, но ткани может длиться 2 дня в этих условиях.
Результаты
Чтобы привести примеры артефактов видели с неправильной точки замерзания, несколько четырехглавой мышцы мыши были заморожены с использованием различных методов (рис. 3) для репликации обычно-встречающиеся ошибки. Как показано на фиг.3А, соответственно замороженный скелетных мышц показан жесткий присоединением миофибрилл в окружающие ткани (как правило, другие мышечных волокон, но иногда эндомизиальные пространство между миофибрилл наполнен фиброза или воспалительных клеток в различных заболеваний или процессов травмы) и отчетливо видны цитоплазматический отсек. Для патологического анализа, возможность просмотра внутриклеточное пространство зачастую важнее, чем эндомизия отсеке, как это обычно критически четко определить наличие дегенеративных изменений, регенеративными изменениями или других патогномоничных выводов (центральные ядер, внутриклеточные включений) в этом пространство. Таким образом, наличие кристаллов льда в внутриклеточное пространство представляет утраПроблема AJOR в патологический оценки мышцы.
Правильное замораживание мышечной ткани требует как достаточно низких температурах и достаточную скорость замораживания, чтобы избежать образования кристаллов льда. Даже при учете обоих факторов, значительная артефакт замораживание может еще произойти из-за чрезмерной влажности в мышечной ткани. Этот вопрос чаще всего встречаются в мышечной ткани, которые были ранее погруженной в солевом растворе и недостаточно высушенной или когда мышцы был в прямом контакте с октября монтажа СМИ на месте секционирования (рис. 3б, 3E). Хотя некоторые контакты с октября, как правило, неизбежно, как следствие процесса монтажа, необходимо приложить все усилия, чтобы избежать контакта между областях, которые будут гистологически оценены и октябре, используемых для монтажа. В отличие от этого, образцы замороженные использованием -80 ° C морозильник (Рисунок 3C) и жидкий азот (Рисунок 3D) приводятся в качестве примерае годы замерзания артефакта, который вырабатывается неоптимального температуры или скорости замораживания. Медленный процесс замерзания встречается путем размещения ткани в -80 ° C морозильник предоставляет собой крайний пример замораживания артефакт. При использовании жидкого азота, основной проблемой является то, что контакт между жидким азотом и ткани вызывает оболочку из газообразного азота с образованием на поверхности ткани и жидкости, и этот газообразный интерфейс не является достаточно холодный производить быстрое замораживание мышцы 1. Это может привести к значительным артефактом замерзания вблизи поверхности образца, но внутренние районы образца, более вероятно, флэш-замораживание при соответствующей скорости и может быть полностью избавлены от замораживания артефакт. В то время как простой погружение мышечной ткани в жидком азоте далеко не так полезна, как процесса изопентана заморозки, она может быть полезна для замораживания крупных экземпляров мышечных в ситуациях, когда изопентан недоступен (например, клинических вскрытия образцов при учреждениях сиз клинических мышцы патологи лабораторий). Результаты использования этой стратегии, как правило, лучше, когда с помощью больших частей ткани (> 2 см в нескольких измерениях).
В то время как предотвращение замерзания артефакта обеспечивает оптимальные результаты гистологических, методика была разработана (и описано здесь), что существенно изменяет замораживания артефакты, чтобы позволить оценку неправильно замороженной ткани. Ткань, что неправильно замороженные (рис. 3Е) можно разморозить и замораживать в жестко контролируемых условиях (рис. 3F), чтобы позволить перераспределение воды в волокнах, и степень морфологической сохранности, который можно получить может быть отличным. По нашему опыту, этот процесс сохраняет внутриклеточный морфологию ткани в значительной степени, но это часто производит следов искусственной разделение волокон внутри эндомизия пространстве. Поскольку многие патологические конечные точки найдены в межклеточном пространстве и те, вэндомизиальные пространство лучше всего рассматривать с помощью специальных пятна (либо выделить фиброз или выявить другие типы клеток), эти артефактом изменения вряд ли действительно ухудшают патологическое оценку мышцы.
Рисунок 1. Сортировка ткани для структурных, функциональных и клеточных исследований скелетных мышц. В зависимости от типа желаемых исследований, собранных ткани скелетных мышц может быть обработан в различных способов для достижения оптимальных результатов. Протоколы, изложенные в этой статье описаны способы для сортировке или обработке скелетные образцы мышц для исследований за пределами площадки, чтобы оптимизировать результаты, полученные из экспертов основных средств.
Рисунок 2. Примеры аппаратов, используемых для мышц замерзания. Как описано в протоколе, оптимальное мышцы замораживание требует погружение мышечной ткани в изопентан, которая по меньшей его температуры замерзания. Безопасным и эффективным средством получения ледяной изопентан предполагает использование металлического контейнера для изопентана, который охлаждается в окружающем Дьюара с жидким азотом. Как это часто удобно иметь обе руки свободными, можно использовать скобки, такие как кольцо стоять (A), чтобы держать контейнер изопентана в жидком азоте при предотвращении смесь двух жидкостей. Кроме того, контейнер может быть также проведена в жидком азоте вручную (B). В любом случае, ткань не должны быть помещены в изопентан, пока изопентан заметно замораживание в нижней части контейнера (обычно в виде непрозрачной белой галькой), а затем должен быть погружен в течение 10-20 сек, чтобы позволить полное замерзание. ISOPEntane при температуре замерзания производит минимальный "туман", (т. е. температура недостаточна, если значительная туман присутствует). После того, как ткань замораживается, поместите его непосредственно в предварительно охлажденные контейнеров (а затем непосредственно в охладитель или морозильник), чтобы предотвратить случайное размораживание после замораживания. (C) соответствующим образом установлен замороженные мышцы должны иметь большую часть мышечной ткани, выступающим из основания замороженных октября
Рисунок 3. Примеры замораживания артефакт, и эффективного оттаивания / повторным замерзанием. Типичные изображения (А) соответствующим образом изопентан заморозки мышц, (B) мышца заморожены соответствующим образом в изопентан, но при контакте с монтажной октября среды, (C) мышцы заморожены в -80 ° C с морозильной камерой, и (D ) мышца замораживали в жидком азоте, все из которых отображать различную степень замораживания артефакт. Как показано на (B), высокая содержание жидкости октября производит значительное артефакт замерзания в мышцах, которая находится в контакте с ним, так что только минимальное количество октября необходим для установки следует использовать, и мышца для гистологического исследования должно быть "стоячей "из его поверхности. Медленность процесса замораживания, используя (С) -80 ° C морозильник или (г) жидкий азот (по отношению к скорости замораживания в ледяной изопентана) может привести к образованию значительного артефакта замерзания. Панели E и F шоу мышцы из того же образца, который был (E) первоначально неоптимально в замороженном виде (из-за чрезмерного контакта с октября), а затем (F) оттаивали и замораживать по методике, описанной в данном документе. Хотя можно наблюдать некоторое следов искусственной расстояние между волокнами в замораживать образца, улучшение ян внутриклеточный морфология мышечных волокон легко просматривается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Обсуждение
Скелетных мышц является структурно и функционально уникальной ткани, и специализированные процедуры подготовки необходимы, чтобы позволить оптимальную оценку структурных и функциональных параметров. В то время как различные ткани, как правило, в замороженном патологических исследований в клинических и исследовательских контекстах, протоколы замораживания для не-мышечных тканей, как правило, связаны с полного погружения ткани в октябре перед замораживанием. Как показано на фиг.3, такой протокол не подходит для патологического оценки скелетных мышц и еще достаточно похож на протокол, описанный здесь, что это часто встречается ошибка. Целью данной работы является создание простой протокол для надлежащего обращения с мышцы, чтобы избежать проблем, как это. Консультации также был составлен на соответствующую обработки мышцы за пределы участка физиологических и клеточных исследований, с тем чтобы облегчить приобретение высококачественных данных по внешним основных лабораторий в случаях Wheповторно на месте исследования не являются предпочтительными или возможно.
Как отмечено в этом протоколе элементы, которые являются абсолютно необходимым в надлежащем обработки мышцы для патологических исследований включают минимизации содержание воды в тканях, снижение температуры, при которой мышца заморожены, и увеличить скорость, при которой замораживание достигается. Повышенная влажность в ткани или чрезмерной медлительности процесса замораживания (производства недостаточных температурах или отсутствием прямого контакта между агентом замерзания и ткани, как встречается с жидким азотом) приведет к замораживанию артефактов, которые могут повлиять на патологический анализ. Как октября обеспечивает дополнительный источник увлажнением тканей, многие лаборатории использовать другие клеи, как трагакантовая как вложения подложки. Даже в тех случаях, когда замораживание выполняется надлежащим образом, следует позаботиться, чтобы избежать впоследствии случайно оттаивания образцов при контакте с RT контейнерах или инструментов.Таким образом, успешный процесс замораживания требует определенной планирования, которая включает предварительно охлаждение всех инструментов и контейнеров, которые будут использоваться. Когда артефакты морозильные встречаются, существует метод, описанный здесь для восстановления тканей, которое является достаточным для большинства патологических оценок. Однако это замораживания / оттаивания не предлагает идеальный гистологию и имеет потенциал, чтобы нарушить другие молекулярные или ферментативные исследования ткани (в дополнение к времени, необходимого для повторного замораживания ткани), так с использованием соответствующих исходных практики замораживания является гораздо предпочтительнее . В случаях, когда замораживание артефакт, возникающих на предварительно замороженной ткани, однако, способ, описанный здесь, может быть чрезвычайно полезным.
Фиксация и обработка ткани для ЭМ может предложить конкретные технические проблемы, которые требуют планирования до сбора ткани. При сборе образцов для EM наиболее распространенная ошибка предполагает использование тканевых фрагментов, которые являются слишком толстым для glutaraldehydе проникнуть. Как глютаральдегид только проникает около 0,1 см в мышечную ткань от заданной поверхности, следует позаботиться, чтобы убедиться, что одно измерение образцов ЭМ является не толще 0,2 см. Кроме того, как EM является отличным средством непосредственно оценки сократительной аппарата, некоторые исследователи разработали стратегии для предварительного натяжения или предварительного натяжения мышц до фиксации, чтобы позволить измерение сократительных элементов в физиологически соответствующего напряжения. Там нет стандартного протокола для предварительного натяжения, но две стратегии кратко описаны в этом протоколе. Следует отметить, что попытки предварительного натяжения мышц может привести к непредсказуемым результатам, если они не сделаны в очень специфическим образом, и это может быть предпочтительным, чтобы исправить мышцы в ослабленном состоянии, чтобы предотвратить артефактом изменения длины саркомера через нестандартные предварительного натяжения процедура 8,9. Для мышц, в которых такие специфические измерения не нужны (в том числе большей Ъiopsies выполненные для клинических целей), усилия по предварительному натяжению мышц, как правило, не производится, и основной эффект на мышечную морфологии является неравномерное расстояние саркомеров в мышцах.
Эта статья представляет собой первый в серии, чтобы обеспечить СОП для проведения испытаний в области врожденного заболевания мышц, и это являет собой результат труда более чем 20 специалистов в врожденной мышечной области заболевания, которые обычно выполняют клеточном, молекулярном, функциональный, физиологические и патологическое исследование. Диапазон опубликованных СОП будут доступны в течение следующего года, и были обсуждены необходимые протоколы и соответствующие форматы публикации для каждого при врожденном мышц Болезнь Консорциум семинара, проведенного в апреле 2013 года в Вашингтоне, округ Колумбия Цель этой SOP усилий является обеспечение дорожная карта необходимого тестирования и анализа образцов в врожденной области заболевания мышц, чтобы 1) стандартизации практики и конечные точки, используемые в нашей области, как муч насколько возможно, и 2) обеспечить обучение на стандартной практикой для новых исследователей в нашей области. Мы считаем, что эти ресурсы будут способствовать появлению новых исследователей в нашей под изученный поле и тем самым улучшить сферу исследований, которые могут быть выполнены. Кроме того, стандартизация практики будет чрезвычайно полезно сравнить данные по исследованиям и определить конечные точки при планировании и выполнении доклинические и клинические испытания.
В то время как основное внимание в этой статье связано с соответствующей замораживания и приготовления ткани для различных исследований, наша совместная группа также обсудила полезные конечные точки для патологического анализа мышечных образцов. В настоящее время нет официального консенсуса на подходе принять при выполнении патологический анализ, и множество различных исследований выполнено связать новые данные с предыдущими публикаций для каждого соответствующего заболевания. Таким образом, мы думали, что было бы полезно, чтобыпредложить некоторые общие рекомендации по планированию патологических конечных точек в мышечной патологии характеристики. До количественного патологию в исследовании, значительная мысль должна быть введена в 1) метод измерения размера волокно, 2) возможность аномалий волоконно-типоспецифических или эффектов лечения, 3) возможность аномалий или эффектов, которые ограничены в отдельных мышц, и 4) стратегия для количественного патологических, которые характерны для этой болезни в исследовании. Размер волокна является необходимым конечная точка для большинства исследований, и, к сожалению, весьма обширен изменение в том, как она количественно. Многие исследования показывают эти результаты, используя автоматизированные методы количественной предоставляемые проприетарного программного обеспечения визуализации, но многие из этих программ срезать углы (например, если предположить, что волокна представляют собой окружности или эллипсы), которые могут сделать эти автоматизированные измерения неточны. Надо понять, как эти автоматизированные программы делают их измерения бEfore имея уверенность в измерениях, и мы призываем следователей включить эти данные в методах бумаги. Кроме того, удельный измерение используется для обозначения размера волокна является чрезвычайно переменным, и некоторые измерения предпочтительнее других 10,11. Обычно используется измерение размера волокон является площадь поперечного сечения волокна (CSA), в частности, потому, что исследователи, выполняющие физиологических исследований стандартизировать свои результаты измерений, полученных с помощью CSA свои инструменты. К сожалению, в то время как измерения CSA может точно отражать размер волокна в идеальных секций поперечными, они широко в зависимости от ориентации волокон (в том случае, продольные или наклонно-секционные слои будут иметь искусственно завышенные размеры CSA) и, таким образом, не идеальными для измерения размера волокон. Предпочтительным измерение размера волокон, которые меньше зависит от волокна площади поперечного сечения является минимальной диаметр Фере (диаметр MinFeret), который является измерение гое малый диаметр в мышечной клетке 12. Это измерение слабо зависит от ориентации волокон и, как правило, клиническая золотым стандартом для измерения волокна, и следователи поощряются двигаться к использованию этой техники. Эти измерения часто можно сделать с помощью того же программного обеспечения, который генерирует измерений CSA 13, и также просто для измерения вручную. Что касается оценки патологических данных в зависимости от типа волокна, определенной мышцы, и в контексте патологических, связанных с конкретным заболеванием, они менее спорные вопросы, которые должны просто быть рассмотрены при планировании исследования. Тип волокна можно оценить с помощью иммуногистохимического или АТФазную окрашивание, но это полезно рассмотреть, что конкретные мышцы и животных имеют особые смеси этих типов волокон (что требует разные ожидания и тестирование стратегии). Мышцы конкретных патологических участие или эффективность леченияможет иметь место, и общий вес мышц по сравнению с контрольной может быть использован, чтобы идентифицировать степень гетерогенности заболевания, прежде чем решить на мышцы к патологически оценки. Наконец, хорошо известно, что многие заболевания мышц, связанные с конкретными патологических отклонений (например, немалиновой стержней в немалиновой миопатия) 14,15, и поэтому он также полезно рассмотреть, являются ли эти нарушения обнаружены в волоконно-типа или мышцы конкретных распределение при выполнении анализа 16,17. В целом, в то время как мы не предлагаем негибкий набор стандартов для оценки мышцы, мы считаем, что эти вопросы должны рассматриваться до исполнения патологических исследований в любой скелетной мышечных заболеваний.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта публикация финансируется за счет Cure CMD, гранта Ассоциации по борьбе с миопатиями (AFM) (проект 16297) и Национальных институтов здравоохранения (номера грантов K08 AR059750 и L40 AR057721). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Джули Тецлафф за ее помощь в редактировании этой рукописи.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Для замораживания | |||
| Дьюар с жидким азотом с устройством отвода жидкости | Пользовательские биогенные системы | серии Lab-5 | Любой другой жидкий азот дьюара может заменить. |
| Контейнер холодопроводящий | Fisher | 02-583A | |
| Широкий изолированный контейнер, способный удерживать жидкий азот | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Термопара | Термометр Thomas Scientific | 1228Y01 | Опционально, но может быть очень полезен для определения точки, в которой изопентан замерзает. |
| Для функционального тестирования | |||
| чашка Петри | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Покрытие Sylgard | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Диссекционный стереомикроскоп | Гарвардский аппарат | 693101 | Любой другой диссекционный микроскоп может быть заменен. |
| Для клеточной культуры | |||
| Стерильный ламинарный проточный колпак | Thermo Scientific | 51022485 | Любой другой капюшон для клеточных культур может быть заменен |
| Для замораживания | |||
| Пластиковые пакеты/контейнеры | Nasco | B01009WA | |
| Термозащитные перчатки | Denville | G4162 | |
| Защитный щиток для лица | Fisher Scientific | S47640 | |
| Длинные щипцы | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Маркерные скобы | 125328 | ||
| клеточных культур | |||
| Стерильные конические пробирки 50 мл | Denville | C1060-P | |
| PES фильтрующий блок, 500 мл, 0.22 &; m | Denville | F5227 | |
| Стерильные щипцы | Fisher Scientific | 644320 | |
| Пакеты со льдом | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Изолированная коробка из пенополистирола | Polar Tech | 207F | |
| Упаковочная лента | Скобы | 795570 | |
| Тканевая заморозка | |||
| Жидкий азот | Аэрогаз | NI NF160LT350 | Хранить жидкий азот в емкостях, предназначенных для низкотемпературных жидкостей |
| Изопентан (2-метилбутан) | Sigma | M32631-4L | Хранить Изопентан в шкафу для легковоспламеняющихся материалов. |
| Фиксатор ЭМ (выберите один) | Буферы без фиксатора также должны быть доступны, так как ткани, зафиксированные на ЭМ, должны быть переведены из фиксатора в буфер через несколько часов или дней, если они не будут немедленно обработаны для ЭМ. | ||
| 2,5% глутаральдегида в 0,1М какодилатном буфере | Электронная микроскопия наук | 16537-15 | |
| Фиксатор Карновского (3% глутарового альдегида + 2% параформальдегида в 0,1М фосфатном буфере) | Электронная микроскопия наук | 15732-10 | |
| Для функциональных исследований (при желании) | |||
| Расслабляющий раствор, содержащий (в ммоль/л) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6,56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 | DTT RPI | D11000 | |
| 46.35 K-пропионат | Приготовить раствор, смешав проприоновую кислоту (Sigma P1386) и KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 креатинфосфат, pH 7,0 | Sigma | P7936 | |
| 0,4 люпептин | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Раствор для снятия шкуры, содержащий | |||
| Расслабляющее решение (см. выше) | |||
| 0,5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Индикация гранул диоксида | |||
| кремния Плоские кусочки пробки (1 x 1 дюйм) | Электронная микроскопия Sciences | 63305 | |
| Глицерин | Sigma | G2025 | |
| Для клеточной культуры (по желанию) | |||
| Полноценная питательная среда, содержащая (для 500 мл) | Стерилизовать, процедив раствор через 500 мл 0,22 m Фильтрующий блок PES. Хранить по адресу 4° C и использовать в течение 1 месяца. | ||
| 395 мл Дульбекко с высоким содержанием глюкозы s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 мл 100X пенициллин-стрептомицина-глутамина (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Для всех остальных реагентов см. паспорт безопасности материалов (MSDS) для всех остальных реагентов для спецификаций |
Ссылки
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
Перепечатки и разрешения
