Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats

Protocol

OPMERKING: Alle diergerelateerde procedures beschreven in dit protocol zijn eerder door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite (DUIACUC) goedgekeurd.

1. Cancer Cell Cultuur en Injection

1. Cultiveren fluorescent gelabelde uitgezaaide kankercellen (bijv mens MDAMB231-GFP borstkankercellen, gift van Dr. Patricia Steeg, NCI, en YFP-gelabeld muis sarcoom cellen, gift van Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, afdeling Radiation Oncology) in geschikt kweekmedium (bijvoorbeeld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptavidine) bij 37 ° C tot ongeveer 90% confluent.
2. Trypsinize cellen, was ze dan 2 keer met PBS, tellen, en dan injecteren ze in de staart aderen van-isofluraan verdoofd 10 weken oud vrouwelijk naakt ratten op 5 miljoen cellen per dier, met behulp van een spuit met een 27 G naald. Chirurgische niveau verdoia wordt gecontroleerd door het gebrek aan reactie op teen knijpen.

2. Toezicht van Metastases behulp MicroCT

1. Onderzoek ratten wekelijks behulp van een micro-CT / micro-bestraler, de aanwezigheid van metastasen boven ongeveer 2 mm diameter detecteren. De micro-CT wordt in opdracht zoals eerder beschreven ^12.
   1. Onder ratten 3% isofluraan anesthesie voor beeldvorming. Bevestig diepe narcose door teen knijpen.
   2. Na het begin van de anesthesie, snel overbrengen ratten naar de beeldvorming wieg in de beeldvorming kamer en sluit via een neus-cone om een ​​isofluraan-luchtmengsel bij 2,5-3%. Pas de positie van de rat in de houder zodanig dat de thorax is gepositioneerd in de fotonenbundel van de MicroCT scanner via de externe positie controles en laser scheidingsteken op de beeldvorming houder. Controleer de deur naar de beeldvorming kamer gesloten, de onderzoeker te beschermen tegen de gammastralen.
   3. Controleer de positie van het dier opnieuw metde kleur videocamera. Voer een lage resolutie CT-beeldvorming proefdraaien, en gebruik het resulterende beeld om het gezichtsveld te passen aan de xyz afmetingen van de borstholte.
   4. Afbeelding van de rat thorax met behulp van een 2 mm Al filter op 40 kVp, 2,5 mA, en 0,008 voxel op 7 FPS en terug te keren het dier naar zijn kooi. Beeldvorming van één dier niet meer dan 15 of 20 minuten duren. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden.
   5. Bevestig metastasen door de verschijning van relatief radiopaak objecten die niet kunnen worden verklaard door intrathoracale bloedvaten (Figuur 1A)

3. Window Kamer Chirurgie

1. Anesthesie, vitale functies en de staart ader catheterisatie
   1. Selecteer dieren met aanwezigheid van metastatische ziekte. Injecteer dier met een intraperitoneale dose van 50 mg / kg pentobarbital. Bevestig chirurgische niveau anesthesie door teen knijpen voordat u verder gaat.
      Opmerking: Anesthesie protocollen te worden afgestemd op de respectieve experimentele opstelling. Pentobarbital is hier gekozen als langwerkende anesthesie, teneinde diepe anesthesie voor langdurige procedures induceren, terwijl het de mogelijkheid van gemakkelijke Herdosering. Echter, verlies van dieren overdosering is een veelvoorkomend probleem met pentobarbital verdoving. Een andere optie die autonome reflexen bewaart tot een grotere mate dan pentobarbital is ketamine in combinatie met sedativa zoals xylazine of medetomidine, die echter slechts toelaat voor een single-re dosiscyclus.
   2. Scheer dieren op de zijkant van het lichaam die de metastatische ziekte heeft, en in de nek, met een clipper. Veeg alle losse resterende haren uit de huid. Na losse haren verwijderd is, gelden veterinaire zalf voor de ogen, om te voorkomen dat ze uitdrogen.
      OPMERKING: Athymische naakt ratten mogen resterende haren die buite hebbenres verwijderen alvorens verder te gaan met chirurgische procedures. Het is zeer belangrijk om alle haar grondig te verwijderen, omdat het kan interfereren met chirurgische procedures en beeldvorming.
   3. Fix het dier in rugligging op een metalen plaat die op een temperatuur van 37 ° C water gecirculeerd verwarming pad wordt geplaatst. De voorste en achterste ledematen zijn bevestigd op de plaat met tape.
      Opmerking: Het is nuttig te controleren en opnemen vitale functies zoals hartslag en arteriële oxygenatie door een pulse oximeter gedurende chirurgische en experimentele procedures.
2. Tracheaalintubatie
   1. Om een ​​katheter plaatsen ventilatie van het dier eerst een transversale cervicale incisie, gevolgd door de mediaan scheiding van de longitudinale spieren ventrale naar de luchtpijp.
   2. Gebruik herhaald openen te sluiten actie met een scherpe tang om een ​​doorgang voor de hechting te creëren via de dorsale zijde van de luchtpijp.
   3. Voeg een kleine incisie in de trachea op tHij buikzijde niet meer dan halfcirkelvormig, ongeveer tussen de tweede en derde trachea ring. Laat een voldoende lang gedeelte van de trachea blootgesteld op het dorsale oppervlak fixatie van de tracheale katheter mogelijk.
   4. Plaats een 2,5-3,0 mm "Y" tracheacanule in de luchtpijp, en draai met een 4-0 monofilament hechtdraad. Controleer de canule is verbonden met een druk gefietst ventilator met een fles verbonden afloop buis die gevuld is met 6 cm water, positieve pulmonaire druk te handhaven. Instromende gas moet 100% zuurstof, tenzij experimenteel anders gewenst.
   5. Plaats een katheter met een 25-27 G naald, en gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing in een van de staart aderen van de rat, en zet vast met tape.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de doorgankelijkheid van de staart ader katheter tijdens de gehele procedure door herhaaldelijk injecteren van een kleine hoeveelheid heparine zoutoplossing in de staartader. Ook oro-tracheale intubatie, dwz de begeleiding van een trachealebuis via de mond van het verdoofde dier en langs de larynx in de trachea, is een mogelijk alternatief voor de tracheotomie procedure die hier wordt beschreven. Deze werkwijze vereist een speciale opleiding en ervaring, om schade aan de luchtpijp te voorkomen en ook om de toevallige cannulatie van de slokdarm voorkomen.
3. Toepassing van pulmonale venster
   1. Verwijder het vel van de zijkant van de borst waarbij de metastasen zich, door het creëren van een incisie, en vervolgens verwijderen van de huid met behulp van stompe dissectie.
      Opmerking: De huid kan worden uitgesneden en verwijderd na onthechting
   2. Ga verder met het ontleden van de twee lagen over elkaar spieren (pectoralis, serratus, en latissimus dorsi), maar het verlaten van de intercostale spieren intact. Een perforatie in de borstholte van ongeveer 1,5 cm in diameter, door het verwijderen van gedeelten van typisch twee aangrenzende ribben. In het ideale geval, zoek de perforatie in de regio van de zesde en zevende ribs.
   3. Osteotomie:
      1. Om bloeden en beschadiging van de longen oppervlak minimaliseren, stevig vasthouden van de rib met een getande chirurgische forceps te snijden tijdens het snijden. Met chirurgische schaar, knip de mediale zijde van de eerste rib, onder een hoek van ongeveer 45 °, waardoor de puntige zijde van de resterende rib wijst buiten.
      2. Vervolgens stuurde de zijkant van de rib op een soortgelijke wijze weer waardoor de puntige zijde van de rib naar buiten stekende, om schade aan de longen oppervlak te voorkomen.
      3. Herhaal de procedure voor de aangrenzende rib, knip dan de intercostale spieren en verwijder het weggesneden stuk. Tijdens deze procedure handhaven long druk op een wijze die mechanische interactie tussen de long oppervlak en de ribbenkast geminimaliseerd. Doe dit door het adequaat regelen van inspiratie druk op de ventilator.
   4. Bevestiging van het paneel:
      1. Plaats een maat long raam, bestaande uit een dekglaasje dateen Plexiglas socket (Figuur 1B) bevestigd. Bevestig het venster naar de socket door lijmen of door een kleine hoeveelheid vacuüm vet. Plaats het venster zodanig dat oppervlak metastasen zijn dicht bij het midden van het venster. Indien nodig de geplaatste gat om de micrometastasen naar het midden van het venster meenemen vergroten het gat enigszins aan de respectievelijke zijde.
         OPMERKING: gemetastaseerde ziekte op de pleura oppervlak kan worden geïdentificeerd als duidelijk herkenbare witte stippen of gebieden binnen de anders roze-to-zalmkleurige gezonde delen van de long oppervlakte die voornamelijk langs de scheuren verschijnen. Terwijl micrometastasen kunnen voordoen op andere gebieden van de pleurale buitenkant, de onderzochte cellijnen bijna altijd weer opduiken micrometastasen in het geperforeerde gebied, eenmaal metastasen radiologisch kunnen worden gedetecteerd.
      2. Nadat de fitting in de perforatie en maken direct contact met de viscerale pleura van de lung, hechten de randen van het raamkozijn aan de omringende intercostale spieren, met 4,0 monofilament hechting (figuur 1C). Gebruik een lichte stijging van inspiratie druk op de ventilator om restlucht helpen te ontsnappen en een afdichting.
         Opmerking: De ademhalingssnelheid van ratten kan sterk variëren, afhankelijk van de status van anesthesie, de status van opwinding of angst, zuurstofconcentratie van ingeademde lucht (FiO _2), etc. Het verdient aanbeveling de ademhalingsfrequentie tussen 70 en 90 slagen passen. De inspiratie druk dient te worden aangepast met de nodige voorzichtigheid en niet worden ingesteld op meer dan ong. 8 cm _H2O (0,6 mmHg) om schade aan de longen oppervlak beschadigt.
   5. Plaats het dier in een speciaal ontworpen restrainer die ontworpen Z-gerichte beweging (figuur 1D) op een stalen plaat die is geplaatst op een thermostatisch (elektrisch) verwarmingsdeken elimineren onder een fluorescentie microscoop. Controle lichaam van het diertemperatuur met behulp van een rectaal thermistor. Stel de schroeven van het dier weerhouder en de inspiratie druk op de ventilator om optimale controle van zijwaartse beweging te bereiken.
      Opmerking: Natuurlijke ademhaling bij zoogdieren heeft betrekking op alle drie de richtingen van de long beweging en borst uitbreiding: bilateraal, dorso-ventrale en cranio-caudale. Om de natuurlijke ademhaling beweging zoveel mogelijk behouden, is het belangrijk om z-richting compressie voor zover noodzakelijk minimaliseren. Omdat de Z-dimensionale beperking heeft het potentieel artefacten die van invloed bloedstroom en andere parameters invoeren, is het raadzaam om condities constant te houden tijdens aantal herhaalde metingen in hetzelfde dier.

4. Imaging en waardering van Microcirculatoire Blood Flow

1. Verzamel rode bloedcellen via hartpunctie en labelen met Dil (1,1 = -dioctadecyl 3,3,3 = 3 = tetramethyl-indocarbocyanine perchloraat), zoals eerder beschreven <sup> 10.
2. Injecteer 300 ui gelabelde rode bloedcellen in de staartader van de rat voor het raam kamer operatie wordt uitgevoerd, eerst door hechting effecten op het glasraam voorkomen. Verwijder luchtbellen in de spuit of katheter, zoals inbrengen van lucht in de ader zal verdere injecties remmen.
3. Afbeelding bloedstroom met een microscoop CCD camera bij -40 ° C chip koeltemperatuur en ongeveer 100X algemeen resolutie (dwz met een 10x microscoop objectief en 10X pre-camera oculair). Gebruik standaard Rhodamine / TRITC filter sets (excitatie 450-490 nm, emissie> 515 nm). Noteer de werkelijke framesnelheid en pixel resolutie van het resulterende beeld sequenties. Record minstens 200 (idealiter rond 300) beelden per stapel, om een ​​succesvolle analyse van de stroomsnelheid te garanderen.
4. Vul vochtverlies in het dier door het injecteren ongeveer 1 ml zoutoplossing ip elk uur.
   OPMERKING: Experimentele instellingen die een interventie te betrekken, bijvoorbeeldeen geneesmiddel dat de bloedstroomsnelheid in een longkanker metastase wijzigt, dat meerdere metingen van de bloedstroomsnelheid in pulmonaire metastatische kanker. Voor deze uitgebreide experimenten is het belangrijk om het dier voldoende vloeistof vullen.
5. Euthanaseren de dieren door infusie van 3 ml 3 N KCl in de staartader
6. Evalueer het beeld stapels met behulp van een gepubliceerde, publiekelijk beschikbare Matlab-computer-algoritme, dat zal leiden tot stroomsnelheid grijswaarden en kleur gecodeerde kaarten voor alle bloedstroom sporen ^10,11. De resulterende beelden in grijstinten met behulp van commerciële of openbare beeldanalyse software, zoals Image J, vervolgens evalueren na drempelen off waarden die aangeven geen beweging van bloedcellen, dwz geen actieve vaatstelsel.

Representative Results

Het vaatstelsel in solide tumoren is bekend dat het aanzienlijk afwijken van de normale bloedvoorziening, tonen een grotere mate van tortuositeit, en hogere INTERVASCULAR afstanden ^13. Dienovereenkomstig bloedstroom tracks in experimentele pulmonaire borstkanker en sarcoom metastasen onregelmatige vormen en grote INTERVASCULAR gaten (figuur 2A, onderste twee panelen) vergeleken met de normale pulmonaire microcirculatie (Figuur 2A, bovenste paneel). In een eerdere studie, het vermogen van de pulmonale venster methode werd aangetoond geautomatiseerde meting van veranderingen in de bloedstroomsnelheid presteren in normale longen ^10. Om te onderzoeken of de pulmonaire venster werkwijze ook een toename bloedstroomsnelheid in longmetastasen kunnen meten, de geneesmiddelcombinatie van het sympathomimetische middel efedrine en endotheline blocker ambrisentan dat onlangs is gevonden dat de microvasculaire circulatie in gezonde longen verhogen,Hier werd (elders gegevens onder review) toegepast. In dit onderzoek wordt het vermogen van de methode aangetoond een toename bloedstroomsnelheid in longmetastasen van muis sarcoom, door toediening van de combinatie van efedrine (20 mg / kg) en endotheline receptor antagonist ambrisentan (0,5 mg / detect kg beide drugs intraperitoneaal, Figuur 2B). Elk datapunt vertegenwoordigt de samengevoegde individuele gemiddelden van drie metingen met tussenpozen van vijf minuten, gemiddeld over de ervaring die met vijf dieren data. De eerste injectie significant (p <0,01) verhoogd bloedstroomsnelheid in de tumor gebied van 0,61 ± 0,12 mm / sec tot 0,74 ± 0,19, terwijl de tweede injectie handhaafde verhoogde stroomsnelheid op 0,74 ± 0,19 mm / sec (). De tweede injectie lokte geen verdere toename bloedstroomsnelheid. N = 5, alle statistieken: herhaalde metingen ANOVA.

Figuur 1:. Procedure om een longmetastasen-dragende rat voor live-microscopie beeldvorming te bereiden (A) MicroCT beeld van een rat lager longmetastasen (pijl) (B) Pulmonale raamkozijn (C) Rat met borstwand perforatie en pulmonale venster.. (D) Tegenhouden apparaat tot Z-directionele beweging van de borstkas te beperken (E) Rat met raam kamer en beteugeling van het apparaat onder de fluorescentie microscoop bevestigd... Opmerking: panel C en E tonen haar dragende Sprague Dawley ratten, niet naakt ratten zonder thymus.

Figuur 2: Kwantificering van toename van de bloedstroom van longmetastasen. (A) bloedstroom richting en snelheid in een normalelong, en kanker metastase van MDAMB-231 en muis sarcoom. De kolom aan de linkerkant bevat snap shots uit afbeelding serie van fluorescentiemicroscopiegrafieken. Alveolae kunnen worden geïdentificeerd als deel van de achtergrond fluorescentie patroon in normale longen (bovenste paneel). Metastasen kunnen worden gevestigd door de fluorescentie veroorzaakt door endogene fluorescerende eiwitten van de geïnjecteerde kankercellen (stippellijn). Kolommen rechts:.-Kleur gecodeerde kaarten van de bloedstroom richting (kleurindicator wiel markeert de richting naar welke cellen vloeien) en stroomsnelheid, gemeten in mm / seconde (B) Veranderingen in de microcirculatie bloedstroom na herhaalde injectie van gecombineerde efedrine en ambrisentan (20 en 0,1 mg / kg per injectie). Een significante toename van de totale stroomsnelheid (herhaalde metingen ANOVA, p <0,01) werd waargenomen na de eerste injectie, maar na de tweede (N = 5).

Discussion

Een model wordt gepresenteerd dat haalbaar is om beeld verandert in de microcirculatie bloedstroom en andere dynamische processen in longmetastasen van ratten, met behulp opklaren en computationele bloedstroom analyse. Terwijl andere methoden bestaan ​​om microscopie voeren op blootgestelde longen in de open borstkas van knaagdieren, dit model is ook de eerste die afbeelding longmetastasen door een borstwand perforatie in een gesloten kist setting. Met behulp van deze methode wordt de haalbaarheid aangetoond dat farmacologisch geïnduceerde veranderingen in de microcirculatie bloedstroom van longmetastasen meten.

Twee fundamentele methoden bestaan ​​om het beeld van de longen van levende knaagdieren die worden doorbloed door spontane doorbloeding, met rechtstreeks contact met de longoppervlak: open kist modellen te elimineren het probleem van de constante beweging van de longen als gevolg van respiratoire en cardiale activiteit door het toepassen van een zuig-venster het oppervlak van de longen, terwijl de rest van de cardiopulmonale complex expen en het contract binnen een open borstholte ^7,14. Hoewel deze methode zorgt voor een uitstekende experimentele toegang, de open kist voorwaarden en zuig venster introduceren artefacten in vergelijking met de voorwaarden van een intact long ^8. Alternatief gesloten borst procedures die de ribbenkast reactie grotendeels intact dragen de belofte van behoud van de oorspronkelijke omstandigheden in de intacte borstholte, zoals de wederzijdse beïnvloeding van cardiale en pulmonaire beweging elkaars bloedstroom dynamiek. Deze modellen omvatten typisch een frame met een venster dat is gehecht aan de borstwand ^15, of een doorzichtig membraan dat wordt gebracht in direct contact met het longoppervlak om uitdroging van het weefsel ⁹ voorkomen. De moeilijkheid van het onderhandelen over de cardiopulmonale motie om tegemoet te komen en in staat microscopie beeldvorming is een grote technische uitdaging van procedures gesloten kist, en waarschijnlijk verantwoordelijk voor de lage algemene verspreiding van deze techniek. In ons geval, de combinatie vaneen solid-venster bedrijf frame en een Z-directionele straatverbod apparaat is effectief gebleken om voldoende te elimineren zijwaartse beweging van de longen om geautomatiseerde bloedstroom metingen van de pulmonale circulatie mogelijk te maken in een gesloten kist venster ^10.

Een gebruikelijke methode om bloed stroomsnelheid van intravitale beeld microscopie stacks meten is het gebruik van ruimtelijke aanpassing van de bloedstroom patronen in opeenvolgende beelden van een bepaalde vasculaire segment ^14. Om de tijd inspanningen vereist de analyse van afzonderlijke bloedvaten vermindert, heeft bloedstroom beeldvorming algoritme geïntroduceerd die produceert bloedstroomsnelheid kaarten van het gehele optische veld ^11. Naast de tijdwinst, deze werkwijze ook mogelijk om tegelijkertijd ruimtelijke analyse van de bloedstroom in het gehele optische gebied, ongeacht vasculaire morfologie of vertakkingspunten. Dit is vooral van belang bij het bestuderen van de tumor micro-omgeving waarin meerdere bloedvaten Contribute om de status levering van een bepaalde tumor gebied ^13,16,17. Inderdaad, kan de bekende kronkeligheid van de tumorvasculatuur en het bestaan ​​van grote INTERVASCULAR gaten duidelijk in beide metastatische kankersoorten die zijn onderzocht (Figuur 2A). De pulmonale venster werkwijze is ook getest op zijn vermogen om veranderingen in bloedstroomsnelheid rapporteren de metastatische laesie, door het meten van het effect van een farmacologische behandeling die onlangs is gevonden dat bloedstroomsnelheid in de pulmonale circulatie verhogen: de hypertensieve geneesmiddel efedrine cardiale output verhoogt, terwijl de endotheline receptor blokker ambrisentan vermindert de precapillaire arteriolen tone, waardoor, wanneer de geneesmiddelen in combinatie met verhoogde bloedstroomsnelheid in pulmonaire capillairen. Hoewel deze gegevens zijn nog herzien elders, het vermogen van de combinatie van een hypertensieve geneesmiddel en een endotheline receptor antagonist perifere spierkracht vergrotenperfusie onafhankelijk is ¹⁸ gepubliceerd. Terwijl onder normale omstandigheden een dosisafhankelijke toename van de bloedstromingssnelheid kan worden waargenomen na twee injecties, kan het feit dat de tweede injectie niet tot een verdere toename van de stroomsnelheid in sarcoom metastasen gevolg van het feit dat de maximale tumorvaten vasodilatatie is bereikt na de eerste gecombineerde injectie van efedrine en ambrisentan.

De volgende beperkingen gelden voor de hier gepresenteerde techniek: Dit protocol is voor ratten (en theoretisch gelijke grootte zoogdieren) vanaf ongeveer 180 300 g of meer. Kleinere zoogdieren zoals muizen speciale aanpassing vereisen om de meer kwetsbare anatomie en fysiologie van de ribbenkast tegemoet. De maximale ruimtelijke resolutie die kan worden bereikt met de gepresenteerde techniek theoretisch slechts beperkt door de numerieke apertuur van het objectief en de dikte van het dekglaasje dat wordt gebruikt (~ 0.08-0,1 um standaard merken), 100X doelstellingen, met het gebruik van olie immersie. In de praktijk kan de resterende beweging van de longen het gebruik van hoge resolutie doelstellingen beperken dan 20X. Als alle autonome beweging van de long wordt geëlimineerd, wordt de temporele resolutie van de techniek slechts beperkt door de framesnelheid van de camera en de signaalsterkte van het fluorescerende label, dat de belichtingstijd bepaalt ongeveer 100 beelden per seconde. De volgende aanvullende beperkingen gelden voor de gepresenteerde techniek: enerzijds de actuele microscopische en computationele instelling kan alleen de analyse van het oppervlak van een bepaalde metastase. Het gebruik van diepte penetrerende microscopie, zoals geavanceerde confocale microscopie beeldvormingsstrategieën, in de toekomst mogelijk meten van bloedstroomsnelheid in 3 dimensies. Ook de gepresenteerde techniek kan niet, in zijn huidige vorm, worden gebruikt om laesies verder te visualiseren in het longparenchym. Ten derde, het inbrengen van een glass venster in direct contact met actieve bloedvaten heeft een aantal mogelijkheden om de microvasculaire stroom zelf, via ruimtelijke compressie van bloedvaten verstoren, of door invloed locoregionale temperatuur. Ten vierde, het gebruik van een externe ventilator en positieve druk in de longen ook potentieel pulmonale microcirculatie bloedstroom veranderen. Bovendien is slechts een beperkt gebied van de ribbenkast zijn praktisch toegankelijk voor de beschreven, relatief ongecompliceerde chirurgische ingrepen. Andere gebieden van de long oppervlak, zoals mediale ventrale of dorsale toegang zou uitgebreidere chirurgische technieken, samen met ernstige verstoringen van de biomechanica van de ribbenkast vereisen. Vanwege het gebrek aan alternatieven voor beeldvorming om de microcirculatie bloedstroom te bestuderen microscopie, kunnen belangrijke ontwikkelingen worden verwacht in de nabije toekomst om deze hindernissen te overwinnen en te studeren maligniteiten bij hoge temporele en ruimtelijke resolutie in alle delen van het knaagdier long.

Kortom, een methode is presteerde patronen van en veranderingen in microvasculaire bloedstroomsnelheid in oppervlak metastasen van de ratlong meten. De combinatie van een acute gesloten borst chirurgische model met een geautomatiseerde methode voor het meten bloedstroomsnelheid in de gehele microscopische optische gebied, biedt deze techniek relatief goed behoud van de fysiologische omgeving van de longen, kan het detecteren van veranderingen in de totale microcirculatie bloed stroomsnelheid en -richting en is relatief eenvoudig te gebruiken. Verwacht kan worden dat deze techniek van groot nut zijn voor alle groepen die de microcirculatie van longmetastasen en andere dynamische processen bij deze ziekte instelling in diermodellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope