ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

サマリー

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。

要約

匂い物質は、約千マウスおよび400人の受容体ファミリーは、匂い物質の数千人を認識できるように、嗅覚受容体活性化のユニークで重複パターンを作成します。臭気物質リガンドは、ヒト受容体^1から11未満の6％について公表されています。データの欠如は、機能的に異種系でこれらの受容体を発現する困難さに起因する。ここでは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、嗅覚受容体活性化のハイスループット評価に続いHana3A細胞における嗅覚受容体ファミリーの大部分を発現させる方法を記載している。このアッセイは、嗅覚受容体のパネルに対する臭気物質の（1）スクリーンパネルに使用​​することができ; （2）用量反応曲線を経由して匂い物質/受容体相互作用を確認。および（3）受容体変異体のうち、受容体活性化のレベルを比較する。サンプル·データでは、328嗅覚受容体は、臭気物質26に対してスクリーニングした。様々な応答スコアが匂い物質/受容体ペアは選択範囲だったテッドと用量反応でテスト。これらのデータは、画面が用量反応実験に合格する匂い物質/受容体ペアを濃縮するための効果的な方法、匂い物質に対する善意の応答を持っているすなわち受容体であることを示している。したがって、このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、哺乳類の嗅覚系における臭気符号化のモデルへ嗅覚受容体に必須な工程を特徴付けるための効果的な方法である。

概要

哺乳類の嗅覚系は、匂い物質の何千もの検出および識別を可能にし、臭気刺激の膨大な数に応答する能力を持っています。嗅覚受容体（ORS）は、嗅上皮¹²内の嗅細胞によって発現される分子センサーである。哺乳類の匂い認識は匂い物質によるORの差動活性化を介して発生し、または遺伝子ファミリーは、およそ千マウスおよび400ヒト受容体^12月16日に、広範囲に及ぶ。嗅覚ニューロンにおける異種細胞でのORの前の機能解析は、さまざまな匂い物質がユニークで認識されていることを示しますが、論理和^10,17-20のアンサンブルを重ねてきた。論理和にリガンドを一致させることは嗅覚コードと嗅覚の生のモデルを構築するための不可欠なを理解するために重要です。により、異種システムでの論理和だけでなく、匂い物質と論理和の両方の多数を表現する難しさに、このデータは、Fからのほとんど存在しているield;確かに、人間の論理和未満の6％は、公表リガンド^1月11日を持っている。このプロトコルは、付臭剤/ ORの相互作用を特徴づけるルシフェラーゼアッセイの使用が記載されている。このアッセイは、ORのハイスループット特性評価、匂い物質/ ORの相互作用を理解するだけでなく、臭い符号化のモデルを開発するために不可欠であるタスクを可能にします。

ORのハイスループット研究は、三つの主要な課題に直面している。まず、オッズ比は、ERに保持され、その....

プロトコル

1。Hana3A細胞の培養に

1. 10％（V / V）FBSを最小必須培地（MEM）を補完することにより、M10のメディアを準備します。
2. 培養維持
   1. M10培地中で細胞を維持する。注：RTP1L、RTP2、REEP1、Gのための発現ベクターは、Hana3A細胞にピューロマイシン耐性を付与する_αolfますが、この抗生物質で細胞を維持することは、大幅に検定結果には影響しません。
   2. 10cmの皿で1:8の比率を2〜3日ごとにサブカルチャー。
   3. 5％のCO _2、37℃でインキュベートする。

2。トランスフェクションのために細胞をプレーティング

1. Hana3A細胞を100％コンフルエント10cmディッシュから培地を吸引。
2. 、10mlのPBSを加える料理を旋回し、PBSを吸引して細胞を洗浄します。
3. 0.05％トリプシン/ EDTAの3ミリリットルを加え、細胞が（約1分）解離するのを待ちます。
4. 5ミリリットルM10を追加することにより、トリプシンを不活性化し、およそ10倍＆を粉砕することにより、細胞塊を壊す＃160; 10ミリリットルピペットで。ピペットを慎重にメディアに気泡を導入しないようにします。
5. 各96ウェルプレートについて15....

結果

一次スクリーニングでは、100μMの濃度で26悪臭に対して328 ORをテストしました。この臭気濃度を効果的に既知のリガンド¹⁰との論理和の大部分を活性化することが実証されている。まず、正規化されたルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ読み取りによってホタルルシフェラーゼ読み取りを割ることによって計算した。次に、ベースライン値は、各ウェル（ 図1）の正規化されたルシフェラーゼの読み取り値から無臭気制御のための正規化されたルシフェラーゼの読み取り値を差し引くことによって計算した。用量応答曲線は48臭剤に対して行わ/ OR対がランダムにベースライン値の範囲にわたって分布した、 図1の有色の棒で示すように論理和が1 mMの1nMのスパニング臭剤の7つの濃度で処理し、得られた応答は、適合させた非線形回帰を使用して、S字曲線に。それは3つの基準を満たした場合に、付臭剤/ ORは、アゴニストと考えられた。（1）標準エラーのlogEC _50未満の1対数単位であった; （2）曲線の上部および下部のパラメーターの95％.......

ディスカッション

同一性は、付臭剤の嗅覚受容体活性化パターンによって符号化されるが、受容体は活性化され、どの程度にしているなどの受容体の活性化パターンは、ヒト嗅覚受容体^1-11未満の6％のために知られている。嗅覚受容体を特徴づけるための努力は、嗅覚受容体ファミリー^{17,23,24,33,34}のサブセットだけに彼らの労働集約的な方法や適用性によって制限されています。 Hana3A異種発現系は、試験された嗅覚受容体の大多数の強い発現を支持し、嗅覚受容体活性化^19,26,27を監視するためのcAMP応答性ルシフェラーゼレポーターシステムと組み合わせて使用することができる。 96ウェルフォーマットにおけるこのアッセイの性能は、相互作用を確認するために、臭気物質/嗅覚受容体対および用量反応曲線のための有望な候補を決定し、受容体活性化レベルは、AFであるかを評価するための画面を含むハイスループット実験計画の数をサポート内および種間変動によってフェクト。画面内のより高い活性値を有する臭気物質/受容体対は、有意な用量応答を実証する可能性が高い。これらのデータは、このスクリーニング方法、それにより臭気物質リ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Hana3A細胞	松波研究室よりご希望
RTP1S-pCI	ご要望に応じて
M3-R-pCI	に応じて
pCRE-luc	Agilent	219076	LUC
>pSV40-RL	Promega	E2231	RL
>Minimum Essential Media, Eagle	Sigma Aldrich	M4655	MEM
FBS	Life Technologies	16000-044	FBS
PBS (Ca2+ および Mg2+)	Cellgro	21-040-CV	a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)	Life Technologies	25300	トリプシン
>CD293	Life Technologies	11913-019	CD293
96-well PDL ホワイト/クリアプレート	BD BioCoat	356693	plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	リポフェクタミン
ホタルルシフェラーゼ基質、ホタルルシフェラーゼクエンチャー/Renillaルシフェラーゼ基質:Dual-Glo	Promega	E2980	dual glo
Synergy S2	BioTek	SLAD	BioTek S2
>マイクロプレート リーダー ソフトウェア: Gen5 データ分析ソフトウェア	BioTek	Gen5	Gen5
	BIOSTACK BioTek	BIOSTACK2WR	BioStack
MultiFlo	BioTek	MFP	MultiFlo
300 μl GripTips	インテグラ	4433	GripTips
12.5 μl GripTips	インテグラ	4414	GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96	Integra	6433<	a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips
>12.5 μl GripTips 384 XYZ	Integra	6403	XYZ tips
384ViaFlo	Integra	6030	384ViaFlo
>TE buffer	Macherey Nagel	740797.1
DMSO	シグマ アルドリッチ	D2650-100ML	DMSO
>Forskolin	Enzo Life Sciences	BML-CN100-0010	FOR

により 松波研究室よりご提供可能 ご要望松波研究室よりご提供可能 <アッセイ