ठीक करने के लिए एक उपन्यास Microdissection दृष्टिकोण<em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</emफेफड़े granulomas एंबेडेड formalin तय आयल से> विशिष्ट देखिए
Summary
Microdissection बड़े पैमाने पर ऊतक के भीतर डीएनए, आरएनए और प्रोटीन की परीक्षा के लिए नियोजित किया गया है. लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी (LCM) सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, लेकिन एक नए मिलिंग तकनीक, mesodissection, हाल ही में उपलब्ध है. हम mesodissected formalin तय आयल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग granulomas के एम्बेडेड ऊतक स्लाइड से शाही सेना निकासी प्रदर्शित करता है.
Abstract
Microdissection एक दशक से अधिक समय के लिए डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर ऊतकों की परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया है. लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी (LCM) आज सबसे आम microdissection तकनीक है. इस तकनीक में, एक लेजर focally एक निर्जलित ऊतक धारा 1 overlies कि एक थर्माप्लास्टिक झिल्ली पिघला करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊतक अनुभाग समग्र तब उठा लिया और झिल्ली से अलग है. इस तकनीक ऊतक परीक्षा के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है, यह समय लेने और महंगी है. इसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग प्रक्रियाओं के सफल समापन के इस प्रकार इसके उपयोग को सीमित करने, एक लेज़र के उपयोग की आवश्यकता है. Mesodissection नामक एक नई और अधिक किफायती और व्यावहारिक microdissection दृष्टिकोण एलसीएम के नुकसान का समाधान संभव है. इस तकनीक मिल करने के लिए एक स्लाइड घुड़सवार ऊतक के नमूने से वांछित ऊतक MESO-1/MeSectr प्रणाली को रोजगार समवर्ती में वांछित ऊतक नमूना ठीक करने के लिए तरल पदार्थ वितरण और aspirating जबकिएक उपभोज्य मिल सा. विच्छेदन की प्रक्रिया शुरू होने के पहले उपयोगकर्ता (FFPE) एम्बेडेड formalin तय आयल (एच एंड ई) संदर्भ स्लाइड दाग एक hematoxylin और eosin साथ स्लाइड संरेखित करता है. इसके बाद ऑपरेटर वांछित विच्छेदन क्षेत्र annotates और उचित खंड काटना आय. कार्यक्रम विच्छेदन की एक संग्रहीत छवि उत्पन्न करता है. mesodissection का मुख्य लाभ यह है कि इस प्रयोग में पीढ़ी का नमूना देने के लिए सेट से दस मिनट की एक औसत लेने, एक स्लाइड टुकड़े करना करने के लिए आवश्यक कम अवधि है. साथ ही, सिस्टम काफी अधिक लागत प्रभावी और उपयोगकर्ता के अनुकूल है. एक मामूली नुकसान यह लेजर कब्जा माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में सटीक नहीं है. इस लेख में हम mesodissection माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) के कारण FFPE granulomas से स्लाइड से शाही सेना को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.
Introduction
नमूने पारंपरिक रूप से मैन्युअल रूप से पूरे ऊतक या एक सुई और स्केलपेल का उपयोग कर स्लाइड या तो से microdissected किया गया है. यह ब्याज की ऊतक अनुभाग और आसपास के ऊतकों धारा 2 के बीच एक स्पष्ट विभाजन जरूरी है. आणविक रूपरेखा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में वर्तमान प्रगति के साथ, सेलुलर स्तर पर ऊतक का आकलन करने के लिए एक बढ़ाने की जरूरत हुई है. कारण पुस्तिका microdissection की सीमाओं के कारण, एलसीएम सहित तकनीक अधिक से अधिक अलगाव सटीक अनुमति देने के लिए स्थापित किए गए थे. इस तकनीक शोधकर्ता तो ऐसे जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के रूप में नीचे की ओर assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विभिन्न सेल और स्लाइड प्रकार से विशिष्ट सेल आबादी, अलग करने के लिए अनुमति देता है. नीचे की ओर assays के लिए बहुत प्रभावी है, एलसीएम सीमाओं के बिना नहीं है. सबसे पहले, एलसीएम एक महंगी और समय लेने वाली प्रक्रिया है. इसके अतिरिक्त, शाही सेना के अस्थिर स्वभाव के कारण, यह अक्सर एलसीएम नमूने 2 से उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. कारण आपदाओं कोएलसीएम की sadvantages, microdissection प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नए अग्रिमों अभी भी एक किफायती और समय संवेदनशील ढंग से शोधकर्ताओं की एक बड़ी संख्या के लिए इसे और अधिक सुलभ बनाने के लिए आवश्यक हैं.
अब उपलब्ध microdissection प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में ऐसा ही एक उन्नति mesodissection रूप में जाना तकनीक है. इस तकनीक में एक मशीन मिल ब्याज की एनोटेट ऊतक अनुभाग के लिए प्रयोग किया जाता है और एक उपभोज्य मिल बिट 3 में यह रेस्पायरेट्रस. अगला, यह नमूना एक संग्रह ट्यूब में aspirated और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रणाली का लाभ यह काफी कम खर्चीला और समय संवेदनशील है कि कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, सिस्टम दस मिनट में एक फेफड़ों ग्रेन्युलोमा ऊतक अनुभाग के विच्छेदन की अनुमति देता है. दूसरी ओर, पारंपरिक एलसीएम संभावना प्रक्रिया को पूरा करने के घंटे की आवश्यकता होगी. सिस्टम ऑपरेटर एनोटेशन के लिए एक तुलना के साथ ही उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए एक संदर्भ स्लाइड लोड करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त एक रिपोर्ट रूपरेखा वें उत्पन्न होता हैविच्छेदित किया गया था कि स्लाइड की ई क्षेत्र. Mesodissection के लिए दो मुख्य नुकसान कर रहे हैं. एकाधिक कक्षों निकालने में कारगर है, यह एक एकल कोशिका को अलग करने की चुनौती दे रहा है. इसके अलावा, उत्पन्न छवि के सटीक अन्य इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के रूप में अगर के रूप में स्पष्ट नहीं है.
क्षय रोग (टीबी) एक प्रमुख संक्रामक बीमारी दुनिया भर में मानवता का हत्यारा और एमटीबी के साथ संक्रमण का परिणाम है. एमटीबी की एयरोसौल्ज़ को उजागर व्यक्तियों के बहुमत में, संक्रमण गुप्त रूप से सीमित है. प्रतिवर्ष कम से कम 10 लाख लोगों में, यह सक्रिय टीबी रोग 4 में यह परिणाम है. अव्यक्त संक्रमण के दौरान, एमटीबी granulomas के रूप में जाना जाता रोग फेफड़ों के घावों के भीतर निहित है. इसलिए यह एमटीबी संक्रमण के परिणाम ग्रेन्युलोमा 5 के स्तर पर निर्णय लिया जाता है कि तर्क दिया गया है.
यहाँ हम mesodissection एमटीबी के कारण granulomas microdissect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इस्तेमाल किया स्लाइड्ससंक्रमित रीसस मकाक से FFPE फेफड़े के ऊतकों से कर रहे हैं. इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए, हम अपनी संपूर्णता में granulomas काटना होगा. हम भी शाही सेना बरामद ऊतकों से निकाला जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. इस तकनीक को विभिन्न अन्य नमूनों से ऊतकों के नमूनों के लिए आवेदन किया और फिर नीचे की ओर assays के एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection रोगजनकों की एक विशाल सरणी की वजह से वैकृत घाव स्लाइड से शाही सेना निकासी के लिए लागू किया जा सकता है कि एक तकनीक है. यह उपयोगकर्ता छवि पटरियों और सही ढंग से छवि संरेखित करता है कि एक जरूरत है. इसे पूर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, और P51OD011104: लेखक इस शोध के समर्थन के लिए निम्नलिखित एनआईएच पुरस्कार / subawards स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
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