Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator
Bu makalede
Özet
Özet
Fiziksel hücrelerine olmayan geçirgenler dışsal moleküler problar tanıtmak için çok güçlü bir tekniktir çünkü elektroporasyon, geçmiş yıllarda artan ilgi görmüştür. Bu çalışma, hassas ve moleküler bağlı bir parametre kontrol memeli hücreleri için birden fazla molekül teslimat gerçekleştirebilen bir mikroakışkan elektroporasyon platformu bildirir. Üniform bir boyut dağılımı ile hücreleri izole etmek için etme kabiliyeti verilen elektrik alanı gücüne göre elektroporasyon verimlilikte az varyasyona izin verir; Bu nedenle örnek canlılığı artırmıştır. Dahası, bu süreç de görselleştirme özelliği verimliliğin arttırılması için in situ moleküler hızlı teslimat parametre ayarlaması izin gerçek zamanlı flüoresan molekül alım işlemi, gözlem için izin verir. Bildirilen platformunun geniş yeteneklerini göstermek için, farklı boyutlarda ve elektrik ücretleri ile Macromolecules (örneğin, Dextran'ın 3.000 ve 70.000 Da MW ile) vardıtest edilen tüm molekülleri için yüksek bir uygulama randımanı (>% 70) ile metastatik meme kanserli hücrelere verilebilir. Geliştirilen platform-chip elektroporasyon teknikleri yararlı olabilir araştırma alanları genişleme kullanım potansiyelini kanıtlamıştır.
Giriş
Son yıllarda, hücre dışı molekülleri sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için elektrik darbeleri kullanımı memeli hücreleri manipüle çekici bir araç haline gelmiştir. 1 ayrıca elektroporasyon gibi bilinen bu yöntem, tersine çevrilebilir şekilde erişim elde etmek için doğal olarak zarın geçirgen moleküller sağlayan, hücresel membran permeabilizes hücrelerin hücre içi muhitine. Hemen hemen herhangi bir molekül, elektroporasyon kullanılarak hücre herhangi bir tip membran geçici oluşturulan gözenekler yoluyla sitosol içine sokulabilir için, teknik olarak rapor edilmiş olan, daha fazla tekrarlanabilir evrensel olarak uygulanabilir, ve virüs aracılı, kimya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre Hazırlanması
- Levha 1 x 10,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 1 ile takviye Leibovitz L-15 Vasatı içerisinde doku kültürü T75 şişesi başına 10 ml'lik bir hacim içinde metastatik göğüs kanser hücre hattı MDA-MB-231 5 hücre / mi % penisilin-streptomisin.
- 0% CO2 ortamında 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, MDA-MB-231 hücreleri inkübe edin.
- 2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak hücreler 2 gün sonra tohumlama deneyleri için Hücreleri, büyüme ortamı ve 8 ml eklenerek tripsin enzim aktivitesini bloke ederler.
- 5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir ni....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Geliştirilen paralel mikroakışkan Electroporator metastatik meme kanseri hücrelerini canlı olarak çeşitli boyutlarda ve elektrik ücretleri makromolekuller teslim. Başarılı moleküler teslimat yerinde niteliksel elektroporasyona yörüngedeki hücrelerinin floresan yoğunluğundaki değişmeler izlenerek tespit ve akış sitometresi analizi ile ölçümü ile teyit edilmiştir. 4A muamele edilen hücrelerin% 90 70000 Da nötr dekstran alımı olduğunu göstermektedir. İstatistiksel analiz .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Verim ve çoklu teslimat molekül verimlilikte yeni paralelleştirilmiş elektroporasyon platformu 10 kat geliştirilmesi ile, daha önce geliştirilmiş tek odacıklı sistem sağladığı tüm yararları ek olarak elde edildi. 18 Daha önce hazır yararları: (i) ön-arıtılması canlılık geliştirme için üniform bir boyut dağılımı, (ii) tam bir dozaj ve ayrı ayrı moleküler kontrol ve (iii) düşük işletme elektrik akımı ile hedef hücrelere. Bu molekül ağırlıkları, konjuge florofor türleri ve bir elektrik yükü geniş kolayca elde ed.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Rowland Yeni Fellow programı tarafından desteklenmektedir. Chris Stokes özel yapılmış, bilgisayar destekli basınç kontrolü kurulumu, Ph.D. Diane Schaak, gelişmesinde yaptığı yardım için: Yazarlar Harvard'da Rowland Enstitüsü bilim adamları ve personel için minnettarlığını ifade etmek istiyorum biyolojik numune taşıma için onun girişi için, Winfield Tepesi için elektrik kurulumu, Ph.D. Alavaro Sanchez, gelişmekte Basınç kurulumu için gerekli mekanik tesisat bileşenleri işlemek için sitometrede akış, Scott Bevis, Kenny Spencer ve Don Rogers erişim verilmesi için. Mikroakışkan ustaları Harv....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MDA-MB-231 kanser hücre hattı | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz' s L-15 Orta Boy Cellgro | , Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco, Yaşam Teknolojileri | 16000-044 | |
| Penisilin-streptomisin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Tripsin | Gibco, Yaşam Teknolojileri | 25200-056 | |
| Akış Sitometresi easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oksijen Plazma Temizleyici | Teknikleri Micro-RIE | ||
| Dektak 6M yüzey profilleyici | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILIKON ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Sıkıştırılmış Azot gazı | Airgas | NI 300 | |
| Yüksek Basınç Regülatörü | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Aşağı akış regülatörü | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| Yüksek hızlı 3/2 8 valf manifoldu | Festo | ||
| Sıralı Çek Valf | Idex Sağlık ve Bilim | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Poliüretan tüpler | Pnömadine | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Poliüretan tüpler | Pnömadin | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK borular | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK borular | Idex Sağlık ve Bilim | P1569 | |
| PEEK boru rakorları | Idex Sağlık ve Bilim | P881 | |
| Darbe Jeneratörü | HP | 8110A | |
| Alüminyum Tel | Bob Martin Company | 6061 ŞAP | |
| Osiloskop | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml santrifüj tüpleri | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml santrifüj tüpü | VWR | 21008-216 | |
| T75 kültür şişesi | VWR | 82050-862 | |
| Dekstran, Tetrametilrodamin, 3.000 MW, Anyonik | Gibco, Yaşam Teknolojileri | D3307 | |
| Dekstran, Tetrametilrodamin, 70.000 MW, Nötr | Gibco, Yaşam Teknolojileri | D1819 | |
| Dekstran, Teksas Kırmızı, 3.000 MW, Nötr | Gibco, Yaşam Teknolojileri | D3329 |
Kaynaklar
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
