Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch hat sich zu einem Mainstream-Wirbeltier-Modell, das für viele Disziplinen der wissenschaftlichen Studie relevant ist. Zebrafische sind besonders gut für die Vorwärts genetische Analyse von Entwicklungsprozessen geeignet, die aufgrund ihrer äußeren Befruchtung, embryonale Größe, schnelle Ontogenese und optische Klarheit - eine Konstellation von Eigenschaften, die die direkte Beobachtung von Veranstaltungen von der Gastrulation zu Organogenese mit einer grundlegenden Stereomikroskop ermöglichen. Ferner kann Zebrafischembryonen für mehrere Tage im haploiden Zustand überleben. Die Produktion von haploiden Embryonen in vitro ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Mutationsanalyse, da sie ermöglicht die Identifizierung von rezessiven mutierten Allele in der ersten Generation (F1) Trägerinnen folgende Mutagenese in der elterlichen (P)-Generation vor. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit, mehrere Generationen (F2, F3, usw.), die Zucht von Mutanten-Familien beinhaltet zu erhöhen, so sparen die Forscher Zeit zusammen mit Reduktionsder Bedarf an Zebrafisch-Kolonie Raum, Arbeit und die Haltungskosten. Obwohl Zebrafisch verwendet worden, um nach vorne zu führen Bildschirme für den letzten Jahrzehnten hat es eine stetige Expansion von transgenen und Genom-Editing-Tools. Diese Tools bieten heute eine Fülle von Möglichkeiten, um differenzierte Tests für Bildschirme der nächsten Generation, die verwendet werden können, um weitere sezieren die Gen-regulatorischen Netzwerke, die Wirbel Ontogenese fahren erstellen. Hier beschreiben wir, wie man haploiden Zebrafischembryonen vorzubereiten. Dieses Protokoll kann für neue Zukunft haploiden Bildschirme, wie in Enhancer-und Suppressor-Screens durchgeführt werden, um die Mechanismen der Entwicklung für eine große Anzahl von Prozessen und Gewebe, die während der frühen embryonalen Stadien bilden, zu adressieren.

Einleitung

Die grundlegenden Prozesse, die Entwicklung von Wirbeltieren zu orchestrieren sind breit konserviert ^ein. Ein guter Weg, um Gene mit wichtigen Rollen in der Entwicklung zu identifizieren, ist vererbbare Mutationen, die zu phänotypischen Defekte in den Prozess der Zinsen führen zu isolieren. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist eine kleine Süßwasserknochenfischarten an den Cyprinidae Fischfamilie, die zu einem weit verbreiteten Modellorganismus für Wirbeltier-Entwicklungsgenetik in den letzten ^zwei Jahrzehnten hat sich gehört. Zebrabärblingeier extern befruchtet wird, die den Zugang zu der Zygote vom Beginn der Befruchtung ^3. Ferner ist der frühe Embryo optisch transparent, so dass die Visualisierung der Entwicklung mit einem einfachen Stereo ^3. Zebrafisch Ontogenese schnell ist, mit den Verfahren der Spaltung der Gastrulation und Organogenese viele Strukturen, wie Herz und Niere, im Wesentlichen über dem ersten Tag der Entwicklung ³ abgeschlossen. Ter Zeit von Larvenstadien bis zur Geschlechtsreife dauert 2-3 Monate, und die Erwachsenen sind kleine Wirbeltiere ca. 3-4 cm in der Länge, so viele Fische auf kleinstem Raum ² gehalten werden. Darüber hinaus haben Zebrafisch Erwachsenen hohe Fruchtbarkeit, mit jedem Fisch in der Lage, mehrere hundert Embryonen pro Woche ² zu produzieren. Diese Attribute haben die Lenkbarkeit des Zebrafisches für Vorwärts-und Rückwärts gemacht genetischen Bildschirme. Zebrafische besitzen einen hohen Grad der Erhaltung in ihrer Anatomie, Zellbiologie und Physiologie mit fortgeschrittenen Wirbeltiere wie Säugetiere ^2,4. In der Tat hat die jüngste Sequenzanalyse zeigte, dass das Zebrafischgenom Homologe zu fast 70% der menschlichen Gene ^5. Diese Konservierung konnten die Forscher Zebrafisch als Modell für zahlreiche menschliche Krankheiten, einschließlich sowohl embryonalen und adulten Bedingungen ^2,4 zu verwenden. Zusammengenommen haben diese Faktoren Zebrafisch ein ausgezeichnetes System für Bildschirme zu identifizieren Gene, die ausgerichtet sind gemachtessentiell für die normale Wirbel Ontogenese.

Eine Reihe von großen Bildschirmen wurden im Zebrafisch durchgeführt und mehrere tausend Mutationen in Entwicklungsgenen ^8.6 identifiziert. Der Zebrafisch männlichen Erwachsenen zugänglich ist Mutagenese und chromosomale Veränderungen mit relativ hoher Frequenz mit dem chemischen Mutagen Ethylnitrosoharnstoff (DEU) ^6,7 oder retrovirale Insertionsmutagenese ⁹ erzeugt werden. Bis heute sind über 9.000 vererbbare Mutationen wurden erstellt und beinhalten Gene, die praktisch alle Aspekte der Embryogenese beeinflussen. Der Zebrafisch-Community hat eine zentrale Bank dieser Mutanten im Zebrafisch International Resource Center (oder ZIRC) ^10, die rund 5.000 Mutante und transgenen Allele aus der ganzen Welt gesammelt hat, gegründet. Viele dieser Mutationen wurden analysiert und kloniert, was Forscher über biologische Disziplinen wertvolle Informationen, die verwendet wurde, auseinander zu necken numerouns zellulären und physiologischen Wege durch die Erkenntnisse Ursprung mit Zebrafisch Experimenten.

Obwohl vorne Bildschirme haben eine beeindruckende Reihe wichtiger Gene identifiziert, viel ist noch nicht über die genetischen Regulationsnetzwerke, die eine Vielzahl von Prozessen zu vermitteln geschätzt. Viele Bildschirme bisher unternommen haben, nicht erreicht Sättigung, und damit sowohl vorwärts als auch Rückwärts genetischen Bildschirme haben ein Grundstein zu identifizieren und zu analysieren, Mechanismen der Embryogenese geblieben. Zwar gibt es enorme Erkenntnisse, die von jedem einzelnen Zebrafisch-Mutante Linie entnommen werden kann, ist ein wichtiger limitierender Faktor im Bereich historisch die zeitraubende Aufwand in der Positions Klonen beteiligt. Aus diesem Grund hat die Identität vieler chemisch induzierte Mutationen ein Rätsel geblieben. , Mit dem Aufkommen von Genomsequenzierungsansätze, die eine schnelle Klonen ^11-14 zu erleichtern, ist aber unglaublich effiziente Identifikation von genetischen Mutationen nun feasible.

Die prototypische Vorwärts Bildschirm in der Zebrafisch ist ein Bildschirm, der diploiden rezessive Mutationen innerhalb von drei Generationen ^6,7 identifizieren kann (Abb. 1, linke Spalte). Diese Technik beinhaltet Erzeugung von Mutationen in den Keimzellen der Eltern (P) männlich, und dann diese Paarung Männchen mit einem Wildtyp-Weibchen. Jede der ersten Generation (F1) Nachkommen von dieser Gegen eine oder mehrere einzigartige Mutationen aufgrund der chromosomalen Beiträge des mutierten väterlichen Genom beherbergen. Die F1-Nachkommen werden angehoben und mit Wildtypen F2 Familien zu schaffen kreuzt. In der F2-Familie, Geschwister wird entweder Wildtyp-oder heterozygote Träger sein und werden zufällig incrossed bis F3 Kupplungen, die für Phänotyp (e) von Interesse analysiert werden, erzeugen. Die F3 Fängen der heterozygote Träger 25% Wildtyp, 50% heterozygot und 25% homozygot mutierten Fisch enthalten. Das Mehr-Generationen-Screening-Schema ist wirksam, jedoch einen großen Nachteil dieser einNSATZ beinhaltet die erforderliche Zeit, um für den Bildschirm vor: mindestens 1 Jahr von Fischhaltung allein beteiligt ist, da jede Generation erfordert etwa 3 Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Weitere Einschränkungen dieser Art von diploiden Bildschirm sind die Arbeit, Raum und Kosten für Wohn diese Generationen.

Die haploiden Bildschirm ist eine Alternative, die verwendet werden können, zu identifizieren und anschließend zu isolieren rezessive Mutationen werden mit ähnlichen Mutagenesestrategien ¹⁵ (Abbildung 1, rechte Spalte). Die Herstellung von haploiden Zebrafischembryonen wurde erstmals vor über 30 Jahren ¹⁶ beschrieben, und die Fähigkeit der Zebrafisch normalerweise diploiden für mehrere Tage mit einem haploiden Chromosomen Ploidie entwickeln für zahlreiche genetische Studien seit dieser Zeit verwendet. Der große Vorteil des haploiden Bildschirm ist, dass diese Methode nicht um Erhöhung F2 Familien, um für rezessive Mutante Allele zu screenen. Stattdessen werden die F1-Generation Weibchen ausgewertetHeterozygotie rezessiver Mutationen in den Prozess von Interesse durch die Untersuchung ihrer F2-Nachkommen in einem haploiden Zustand (Fig. 1, rechte Spalte). Insgesamt sind die Schritte zu haploiden Embryonen relativ einfach zu beschaffen (Abbildung 2). Nach Herstellung der erforderlichen Lösungen für die Spermien Handhabung sind Eier von F1-Generation Weibchen durch manuelle Manipulation erhalten wird, um aus dem Bauch zu extrudieren (oder "Squeeze") die Eier. Sobald die Eier erhalten werden, werden sie in vitro durch Exposition gegenüber ultravioletter (UV) inaktiviert Spermium befruchtet. Die UV-inaktivierten Sperma unfähig sind lebensfähige DNA beiträgt, das Ei durch die Tatsache, dass die kurzwellige UV-vernetzt das väterliche DNA. Allerdings sind die Spermien noch in der Lage Auslösen Ei-Aktivität und die Ereignisse mit zygotische Entwicklung verbunden. Bei Stoffwechselaktivierung, wird das Ei Meiose II abzuschließen, und fahren Sie mit nur der einen mütterlich hinterlegt Kopie jeder chromosomale entwickelnmich. Aufgrund dieser 1N Ploidie ist der Embryo unter den Entwicklungs Folgen eines rezessiven mutierten Allels, wenn sie auf einer mütterlichen Chromosom vorhanden ist. So ist jedes F2 haploiden Kupplung werden 50% und 50% Wildtyp-Mutante Embryonen enthalten, wenn die Mutter ist eine heterozygote Träger eines voll penetrant rezessive Allel. Diese Verteilung der embryonalen Genotypen können relativ leicht in Bezug auf die Beurteilung der Kupplung auf die Anwesenheit von Mutanten-Phänotyp (en) von Interesse. Wenn ein solcher Phänotyp erkannt wird, wird der weibliche Gründer F1-Generation nachträglich zu Wildtyp männlichen Zebrafisch kreuzt mehr heterozygote Träger zu schaffen und zu erhöhen. Denn es ist nicht notwendig, mehrere Generationen anzuheben, um den Bildschirm durchzuführen, kann der Forscher viel Zeit, Arbeit und Aquarium Platz zu sparen, hat aber immer noch die Macht, eine beträchtliche Anzahl von Genomen, basierend auf der Anzahl der F1-Weibchen untersucht Umfrage. So sind haploid Bildschirme vor allem machbar für kleine Labors oder Projekte in der absenc eingeleitete erhebliche Mittel.

Es gibt jedoch mehrere Beschränkungen und Nachteile der Verwendung von Haploiden. Erstens leben haploiden Zebrafisch-Embryonen nur für einige Tage, und in der Regel sterben zwischen 3 und 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) ^15. Haploid Zebrafischembryonen aus Diploiden auf der Grundlage verschiedener Merkmale unterschieden werden, vor allem unter ihnen ist eine kleine, kompakte Körper, dennoch hat die normale Anzahl von Somiten Segmente ^15,17. Da die Entwicklung fortschreitet, erhöht die Gehirn Exponate Zelltod und Kreislauf ist schlecht, mit Blut-Pooling in der Regel von 03.02 dpf und Ödeme ^15,17 verbunden. Ferner Haploiden nicht, eine Schwimmblase ^15,17 aufzublasen. Unabhängig von diesen morphologischen Unterschiede, sind die meisten wichtigen Organe und Gewebe gebildet, einschließlich Herz-, Augen-und Rückensaite ^15,17. Ein Merkmal hingewiesen zu haploiden Kupplungen ist, dass sie enthalten eine Reihe von Phänotypen in Bezug auf Sorten von defekten Embryonen & #8212; ein Feature, über Zebrafisch-Stämmen beobachtet. So sollte man überprüfen, ob das Gewebe (n) und die Zeit von Interesse zeigen maßen normale Entwicklung im Wildtyp haploiden Stamm und haben daher das Potenzial, auf genetische Defekte in einem Bildschirm oder andere Forschungsprojekt ausgewertet werden.

Trotz dieser Herausforderungen haben haploiden Bildschirme erfolgreich umgesetzt worden, um Gene für die frühen Entwicklungsprozesse in der Zebrafisch notwendig, zu identifizieren und haploiden Protokolle wurden auch in der Gemeinde seit vielen Jahren etabliert ^15-19 Ressourcen. In jüngerer Zeit hat der Prozess der Erzeugung haploiden Fischembryonen von Forschern verwendet worden, um haploide embryonale Stammzellen (ES)-Zellkulturen aus Medakafisches ^20,21 erstellen. Nach der Herstellung des Medaka haploiden Embryonen in vitro wurden die Embryonen verwendet werden, um primäre Zellkulturen, die für etwa 15 Wochen, gefolgt von weiteren 5-8 Wochen zu rein Klone von haploiden Zellen erzeugen agiert wurden ableitenES-Zell-Eigenschaften ^15-19. Die Erzeugung von Fisch haploiden ES-Zelllinien hält Versprechen für zukünftige breite Analyse rezessive Phänotypen in Wirbeltier-Zelllinien und stellt einen neuen Ansatz für die genetische Analyse in den kommenden Jahren. Somit wird die Erzeugung von Fisch haploiden Embryonen wachsenden Anwendungen in der biomedizinischen Forschung. Dieses Video Artikel bietet eine visuelle Demonstration der Schritte, mit der Herstellung von haploiden Zebrafisch-Embryonen in vitro mit UV-inaktivierten Spermien basierend auf etablierten Protokollen ^15-19,22 beteiligt.

Protokoll

HINWEIS: Die Vorgehensweisen für die Arbeit mit in diesem Protokoll beschriebenen Zebrafisch-Embryonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Notre Dame genehmigt. HINWEIS: Obwohl die folgende Protokoll bietet eine Demonstration von Spermien Isolation, die Euthanasie der Männer geht, Sperma aus der Geschlechtsöffnung des Sammelns werden betäubt lebenden Zebrafisch-Männchen mit sanftem Druck im Bauchraum und eine Mikrokapillar für Spermien Sammlung ^17,18. Quetschen von Live-Männchen erfordert mehrere Männchen eingesetzt, um die entsprechende Menge der Spermien, die von einem männlichen eingeschläfert ^17,18 erhalten werden kann, zu sammeln. Aber Männer, die durchgemacht haben drückte bleiben ganz gesund und kann für natürliche oder nachfolgenden Paarungen in vitro Verfahren ¹⁷ verwendet werden. Wann immer möglich, sollte so gewählt Verfahren unnötig Fisch Opfer zu minimieren.

1. Herstellung von Lösungen und Zebrafisch-Mating Chambers

1. Bereiten Hank-Stammlösungen (# 1, 2, 4, 6) und Hank-Premix-Lösung (siehe Materialien Tabelle) ^19, dann autoklavieren und bei 4 ° C
2. Wählen Sie die gewünschte Anzahl der erwachsenen Zebrafisch-Weibchen (e) für haploiden Kupplung Kollektion. HINWEIS: Aufgrund der Erfahrungen mit einem mutierten F1 von Inzuchtstamm Tübingen Zebrafisch besteht, etwa 50% der geschlechtsreifen Frauen waren nach dem Grundieren sie, indem sie in einer passenden Käfig über Nacht mit einem männlichen "quetschbaren 'im Durchschnitt - also eine Kupplung erhalten wurde über das Zusammendrücken Verfahren - und die Mehrheit dieser Kupplungen (zwischen 70-90%) hergestellt Haploiden lebensfähig. Mit zwei Forscher der Durchführung der haploiden Vorbereitung können etwa 80 erwachsenen weiblichen F1 Zebrafisch an einem Vormittag gequetscht werden. Die Reagenzien für die haploiden Experiment Faktor in der sowohl der Pressgeschwindigkeit der F1-Generation und die Anzahl von Forschern zur Verfügung, um die exp zuführen benötigt berechneneriment. Beachten Sie, dass die Zahl der Frauen, die hohe Qualität haploiden Kupplungen produzieren wird ist äußerst variabel, mit Zebrafisch-Weibchen zwischen von verschiedenen Stämmen, Alter, Ernährung und Lebensmittel ¹⁵ beobachteten Unterschiede.
3. Bereiten Sie passenden Käfige, indem jede erwachsenen Zebrafisch Weibchen mit einem erwachsenen männlichen Zebrafisch in einer Kammer des Systems Wasser, so dass sie von einem Teiler über Nacht getrennt. HINWEIS: Frauen müssen zu einem Mann über Nacht prime ausgesetzt werden, oder bereiten sie zum Laichen über Quetschen.

2. Präparation der Hoden

1. Machen Hanks Lösung Nr. 6 frische, indem 0,35 g Natriumbicarbonat auf 10 ml destilliertem Wasser. Gut mischen, um das Natriumbicarbonat Pulver zu lösen.
2. Kombinieren Sie die folgenden in einem Rohr auf Eis, um die gepufferten Hank Final Arbeitslösung für die Spermien zu machen: 9,9 ml Hanks Premix I mit 100 ul Stammlösung Nr. 6.
3. Gut mischen, dann aliquotiert 500 ul der Hank7; s Finale Arbeitslösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis. HINWEIS: Jede 500 ul Aliquot wird verwendet, um Spermien aus den Hoden von 4-5 männlichen Zebrafisch vorzubereiten.
4. Wählen Sie zwischen 4-5 männlichen Zebrafisch für jedes Samenernte. Hinweis: das wird genug Sperma gesammelt, verarbeitet und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die genutzt werden, um etwa 15 haploiden Kupplungen befruchten werden gespeichert ernten. Wählen Sie zusätzliche Kohorten von Männern, um zusätzliche Rohre je nach Umfang des Experiments vor. Wenn die ausgewählte männliche Zebrafisch kleine oder den Hoden Dissektion unvollständig ist, typischerweise 5 Männchen benötigt.
5. Euthanize jeden männlichen indem ein Netz zu übertragen Sie leicht den Fisch in eine Schüssel mit 0,2% Tricaine für ca. 5-6 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass der männliche ordnungsgemäß vor Beginn der Dissektion eingeschläfert. Typischerweise warten mehreren (2-3) Minuten nach den Kiemen der Fische nicht mehr bewegt und die Fischenicht mehr anspricht, zu berühren.
6. Suchen Sie sich die männlichen sanft mit einem Plastiklöffel und die männliche trocken Flüssigkeit vorsichtig tupfen. Dann entfernen Sie den Kopf des Männchens mit einer scharfen Schere und schneiden einen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie dann. HINWEIS: Entfernen aller überschüssige Flüssigkeit aus dem Fisch ist wichtig Auslösung Aktivierung der Spermien zu verhindern.
7. Entfernen Sie den Darm und Darm assoziiert Organe aus der Bauchhöhle mit feinen Pinzetten und Ort in einen Biohazard Behälter zur Entsorgung.
8. Verwenden feinen Pinzette, um die Hoden, die sich entlang der dorsalen Körperwand befinden, seitlich der Schwimmblase zu entfernen, und haben eine weiß-opake Aussehen, wenn unter dem Stereomikroskop betrachtet. HINWEIS: Halten Sie die Hoden intakt kann helfen, um die Exposition der Spermien auf Wasserbasis, Körperflüssigkeiten zu verhindern und so verhindern, dass vorzeitige Aktivierung.
9. Legen Sie die Hoden in die Samenlösung auf Eis und halten Sie die Röhrchen auf Eis wie die anderen Hoden seziert werden. Wiederholen Sie die Schritte, bis alle 2,6 bis 2,9 mBiere wurden seziert.
10. Legen Sie die Tierkörper und alle restlichen tierischen Geweben in einen Behälter für biologischen für angemessene institutionelle Verfügung.

3. UV Sperma Inaktivierung

1. Homogenisieren die Hoden durch vorsichtiges Schleifen der Mikrozentrifugenröhrchen mit einem sterilen Mikroröhrchen Stößel.
2. Den Überstand in einer kleinen Petrischale oder Uhrglas auf Eis. HINWEIS: Nicht Gewebetrümmer zusammen mit der überstehenden Lösung übertragen. Dies wird Schatten erzeugen und gefährden die UV-Inaktivierung von Spermien.
3. Spülen Sie den Schlauch mit Sperma zwischen 300-400 ul zusätzlicher Hank Final Arbeitslösung (in Schritt 2.2 vorbereitet und auf Eis gelagert), und fügen Sie diesen Überstand zu waschen, um die kleine Petrischale oder Uhrglas in Schritt 3.2.
4. Freizulegen, um die Schale von einer Bank Lampe (254 nm) für insgesamt 2 min UV bei einem Abstand von der Lampenquelle von ungefähr 15 in (38,1 cm). HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie mit einer UV-Lampe und Gesichtsschutz tragen, oderandere Auge persönlicher Schutzausrüstung.
5. Gibt die Schale in den Eiskübel, dann überweisen Sie den UV-inaktivierte Spermien auf eine neues Mikrozentrifugenröhrchen und speichern Sie die Probe auf Eis. HINWEIS: An dieser Stelle wird es etwa 800 ul von UV-inaktiviert Sperma zur Befruchtung haploiden Kupplung sein. Das Sperma sollte auf Eis während der gesamten Dauer der Zeit auf Quetschen Weibchen verbrachte gehalten werden. Sperma in kaltem Hanks kann für bis zu 6 Stunden ohne Reduzierung der Befruchtung Ergebnis verwendet werden. Interessanterweise haben andere Forscher berichtet, dass Spermien in kaltem Hanks tragfähige von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen ¹⁸ ist.

4. Egg Beschaffung von erwachsenen Zebrafisch Weibliche und In-Vitro-Fertilisation der Kupplung

1. Bereiten Tricaine Bad für Anästhesie durch die Kombination von 20 ml 0,2% Tricaine Lager mit 80 ml Fisch System Wasser.
2. Wählen Sie die für weibliche Eiersammlung mit einem Netz, um sie sanft in die Schüssel legen von tricaine.
3. Warten Sie 2-3 Minuten, bis das Weibchen betäubt und reagiert nicht mehr zu berühren. HINWEIS: Wenn die weibliche Zucken auslöst, oder andere Bewegungen, geben Sie ihr zusätzliche Zeit, um die Narkose zu erliegen.
4. Verwenden Sie einen Plastiklöffel zu heben das weibliche, Dekantieren der Lösung, bevor das Weibchen auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit abzusaugen. HINWEIS: Achten Sie darauf, um zusätzliche Lösung auf dem weiblichen verlassen, da Flüssigkeit Eiaktivierung vor der Zugabe von Spermien auszulösen.
5. Legen Sie die Frau auf ihrem Schlitten in einer sauberen Petrischale und visualisieren ihren Bauch unter dem Stereomikroskop.
6. Stroke Bauch der Frau sanft für ca. 10-20 Sekunden mit einem oder zwei Fingern von einer Hand in Eiern aus ihrem Bauch drücken, inzwischen unterstützt den Rücken des Weibchens, indem einer oder zwei Fingern der anderen Hand hinter ihr dorsalen Körperwand. HINWEIS: Bei streichelte den Bauch des Weibchens, sollten die Eier aus sehr leicht. Wenn Eier nicht entstehen Witzh zu erleichtern ist es nicht ratsam, "mehr Druck" und Kraft Eier vom Weibchen. Dies zeigt, dass Eier nicht vorhanden sind und / oder nicht bereit für die Befruchtung und weiter schieben ist mit erheblichen Risiko der Schädigung der weiblichen (zB Entleeren der Schwimmblase oder was andere tödliche innere Verletzungen) verbunden. Wenn ein Weibchen zusammengedrückt wird, aber bietet keine oder nur wenige Eier, geben die Weibchen der Tieranlage. Nach 1-2 Wochen Ruhe, Paar die Frau mit einem Mann für eine natürliche Paarung zu reinigen, Rest Ei Schutt. Sondern Frauen, die von Natur aus, bevor Sie eine zweite Squeeze passen in einen Tank noch 1-2 Wochen Ruhe. Alternativ können Frauen für 4 Wochen, während welcher Zeit sie können sich für natürliche Paarungen ¹⁵ eingestellt werden ausgeruht sein.
7. Mit einem feinen Sonde oder Spachtel, um Eier unter der weiblichen und / oder ihren Bauch Oberfläche aushöhlen.
8. Heben Sie die weibliche und Rück sie zu einem entsprechend gekennzeichneten Isolationstank mit Fisch System Wasser.
9. Dann werden 50 ul UV inaktiviert Sperma Lösung der Gelege, und bei Raumtemperatur für 30 sec, während der Zeit, zu befestigen eine entsprechende Etikett in die Schale, um es mit der Zahl zu der weiblichen Eltern zugeordnet verfolgen.
10. 1 ml E3 auf die Eier, und bei Raumtemperatur für 1 min.
11. Ausreichend E3-Lösung, die Schüssel in der Mitte zu füllen, und legen Sie die Embryonen bei 28 ° C für die nachfolgende Inkubation. HINWEIS: Der Zusatz von Penicillin / Streptomycin (1% (v / v) Pen-Strep-Lösung, die 5000 Einheiten Penicillin und 5 mg Streptomycin pro ml) ¹⁹ bis E3 in der allgemeinen Gesundheit der haploiden Embryonen zu unterstützen.

5. Beobachtung und Handhabung von Embryonen Haploid

1. Nach 4-8 Stunden, entfernen Sie unbefruchteten Embryonen aus der Schale waschen und die restlichen Embryonen durch Austausch der E3 Embryo Medien mit frischen E3-Lösung. HINWEIS: ungedüngte Embryonen ein weißes, opakes Aussehen anzuzeigen oder kann eine transparente Anzeige einppearance mit einem missgestalteten Einzelzelle.
2. Inkubieren, bis die gewünschte Zeit von Interesse, und dann in der gewünschten Bildschirm Assay oder anderen Forschungs Anwendung (en) zu nutzen.

Ergebnisse

Die Produktion von haploiden Embryonen implementiert werden, um rezessive Mutationen in der F2-Generation zu identifizieren, wenn die Haploiden werden aus reifen Zebrafisch Weibchen, die die Nachkommen der mutagenisierten Eltern (Abbildung 1) sind, erhalten werden. Das spart Zeit und Platz im Vergleich zu den traditionellen diploiden Bildschirm, in dem die Forscher müssen F2 Familien, deren diploide Nachkommen werden dann für die Phänotypen von Interesse (Abbildung 1) ausgewertet erhöhen.

Die wesentlichen Schritte in dem Protokoll in Schritt 1-5 oben beschrieben zur Gewinnung Zebrafisch-Embryonen haploiden durch in-vitro-Fertilisation werden als Flussdiagramm (Fig. 2) schematisch dargestellt. Diese Schritte beinhalten Herstellung von Lösungen und Grundierung von Frauen durch die Einwirkung von männlichen Hormonen in der Paarungs Tanks (Tag 1), gefolgt von Ei-und Samen Beschaffungs-und in-vitro-Fertilisation (Tag 2) und schließlich die Aufzucht der Haploiden (Tage 3-5) (Abbildung 2). Wenn comkombiniert mit einer genetischen Screen, eine gemeinsame Mutageneseverfahren im Zebrafisch frühere Exposition der männlichen Wildtyp-Zebrafisch Erwachsenen gegenüber einem Mutagen (zB einem chemischen Mutagen, wie ENU, obwohl andere Verfahren, wie zB retrovirale basierend Mutagenese kann durchgeführt werden, die auch erleichtern Klonierung des Chromosomenstörung), die durch Züchtung mit Wildtyp-Weibchen einen mutierten F1-Generation zu erstellen gefolgt. Solche Präparate erfordern mehrere Monate Arbeit (ca. 6 Monate) auf der Grundlage der Generationszeiten nach hinten Wildtypen benötigt, führen Mutagenese und die anschließende Rück mutagenisierten F1 ^15,17,22.

Ein weiterer wichtiger Punkt zur Prüfung im Einsatz Haploiden für einen Bildschirm ist die Wahl des Zebrafisch-Belastung. Die AB * (AB Sterne)-Stamm hat sich für die Herstellung von haploiden Embryonen mit besseren Gesamteigenschaften und Gesundheit als andere Stämme ¹⁵ bekannt. Jedoch in der abgeleiteten Tübingen Stamm in unserem Labor gezüchtetGeschichte, wir haben vor kurzem beobachtet embryologischen Merkmale, die erfolgreiche Bildschirme für Entwicklungsstörungen der Nieren-System (G. Gerlach und R. Wingert, unveröffentlicht) aktiviert haben. Erwachsene Zebrafisch Tübingen Stamm Männer wurden von einer Serie von drei Behandlungen DEU mutiert, und dann ging zum Wildtyp-Weibchen Tübingen, ein F1-Generation für das Screening generieren. Die F1-Weibchen wurden gequetscht, um Eier zu erhalten und diese F2 Eier wurden mit UV inaktiviert Spermien befruchtet. Im Vergleich zu diploiden Kupplungen durch natürliche Paarung von Wildtyp-Tübingen Eltern (3A) erhalten, in diesen Embryonen haploiden Stamm Kupplungen angezeigt Tübingen einen kürzeren, gedrungenen Rumpf Merkmal der haploiden Zustand (3B, C). Ferner haploiden Kupplungen bestehen typischerweise aus Embryo Geschwistern, die eine Reihe von Fehlern, die wir beobachtet und (3B, C), von denen bekannt ist, um in Stämmen variieren, wie weiter unten diskutiert ^15,17 anzuzeigen.

Frühere Studien haben eine kanonische Grading Serie etabliert, entsprechend den Besoldungsgruppen A bis D, um den Bereich der haploiden Phänotyp Mängel ^15,17 kategorisieren und zusätzlich Haploiden wurden auch in Bezug auf die Adjektive gute, mittlere und schlechte Qualität ²² bezeichnet. Grade A Haploiden, entsprechend hohe Qualität Haploiden, sind die normal in Erscheinung, mit einer kurzen und stämmigen Körper, aber insgesamt zeigen eine morphologische Erscheinungsbild ähnlich Diploiden ^15,17,22 (vgl. diploiden Geschwister (d) zu haploiden Klasse A (mit der Bezeichnung A) Geschwister, 3B). Haploid Klasse A Embryonen entwickeln auch bescheiden Herzbeutel Ödeme, die ein typisches Merkmal von haploiden Zebrafisch-Entwicklung ^15,17,22 (3B) ist. Im Vergleich zur Klasse A Haploiden-, Zwischen-oder so genannte Klasse B haploiden Embryonen (mit B, 3B, C) ​​werden bei der Entwicklung eines weiteren gekürzt oder geknickt / twis unterschiedented Kofferraum, wenn Merkmale eines Kopf und Schwanz sind deutlich unterscheidbar ^15,17,22. Schließlich sind Klasse C oder schlechter Qualität Haploiden (auch in einigen Referenzen als C / D aufgeführt sind) ^15,17,22 äußerst mangelhaft und zeigen eine unorganisierte Masse von Zellen in Verbindung mit der Dotterkugel (mit C, 3C). Auch unter dem gleichen Stamm, variieren haploiden Kupplungen in der Verteilung von A, B und C Phänotypen, wird man beobachten. Zum Beispiel die Kupplung von einem haploiden weiblichen Tübingen angezeigt bessere Entwicklung insgesamt, mit meist A-und B-Klasse haploiden Nachkommen (3B) im Vergleich zu Haploiden von einem zweiten Tübingen weiblich, dessen Kupplung bestand aus zahlreichen Klasse C haploiden Nachkommen sowie A erhalten und B haploiden Phänotypen (Fig. 3C). Ähnliche Stammvariabilität von haploiden Embryo-Typen wurden bereits in AB und AB * Stamm Fischen beobachtet sowie ^15.

Trotz dieser mormorphologische Unterschiede, Organogenese viele Strukturen verläuft relativ normal in der haploiden Embryo. Obwohl sie eine kürzere Körperstamm, Entwicklung von Organen wie Augen und Herz ist relativ ähnlich der von Wildtyp-diploide Embryonen und Zelltypen wie Pigmentzellen (Melanophoren und Xanthophoren) kann auch bewertet werden ^15. Darüber hinaus haben wir kürzlich dokumentiert, dass die Pronephros oder embryonale Nieren wird um 1 Tag nach der Befruchtung im Wildtyp haploiden entwickelt, ähnlich wie bei Wildtyp-Diploiden. Als Beweis hierfür ist, zeigt Pronephros Zelltyp Strukturierung der prototypischen Muster der Segmente (Abbildung 4). Ferner ist der Phänotyp der rezessiven Mutationen, die Pronephros Entwicklung, wie die lib Mutation, die Retinsäure Produktion reduziert verändern, zeigen ein ähnliches Muster im haploiden Zustand im Vergleich zu den diploiden Zustand (Abbildung 4) ^23,24. Diese Beobachtung steht in Einklang mit der von anderen recessive Mutationen, die zu ähnlichen Phänotypen führen sowohl in der haploiden und diploiden Zustand, obwohl dies nicht immer der Fall mit allen Mutationen und sollte im Auge behalten werden, wenn die Bewertung dieser Art von Bildschirm-Strategie ^15.

Eine Anzahl von Geweben und Organen sind typischerweise in Haploiden abnormal. Zum Beispiel Haploiden anzuzeigen Mängel im Umlauf, die gemeinhin ausstellenden Blut-Pooling, die machen ihre Fähigkeit, einige Aspekte der Vaskulogenese studieren ¹⁵ begrenzt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Haploiden können Unregelmäßigkeiten in Ohrentwicklung für Mutationen, die feinen Prozessen mit Morphogenese von dieser Struktur ¹⁵ beteiligt wirksam wird, so dass sie für Mutationen, die vollständig Ohrbläschen Bildung zu verhüten, aber nicht. Als ein weiteres Beispiel dafür ist die Morphogenese Gehirn abnormal in Haploiden und damit haploiden Bildschirme erforderlichen Hirnentwicklungspfade zu identifizieren sind begrenzt ^15. Trotz dieser Einschränkungen eine unserernalyse der Nierenentwicklung im haploiden Zustand (Abbildung 4) fügt diese Orgel in die Liste der 'screenbaren' embryonalen Strukturen. Dieser Befund unterstreicht, dass eine haploide Bildschirm Methodik kann verwendet werden, um die genetischen Komponenten der Nierenvorläufer Strukturierung sezieren und fügt Gewicht auf die Stimmung, dass geniale Bildschirm Ansätze können die Grenzen der haploiden Embryo Ontogenese zu umgehen, wertvolle neue Mutanten-Modelle zu entdecken, um ¹⁵ Wirbeltierentwicklung zu studieren.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der diploiden und haploiden Bildschirm Strategien im Zebrafisch-Modell. Nach der Mutagenese der Elterngeneration kann die F1-Generation erhoben und verwendet werden, entweder F2 Mutante Familien, die verwendet werden, um die F3-Generation in einer diploiden Zustand linken Bildschirm (erzeugen ) oder direkt Bildschirmin einem haploiden Strategie (rechts) ed. In einem haploiden Bildschirm werden die geschlechtsreifen Weibchen F1-Generation verwendet werden, um haploide F2 Kupplungen für die genetische Analyse zu sammeln. Weiblich heterozygote Träger identifiziert werden, wenn etwa die Hälfte der F2 Haploiden zeigen einen mutierten Phänotyp (rot Embryonen), im Vergleich zu den Wildtyp-Geschwister haploiden (gelb Embryonen).

Abbildung 2. Haploid Embryo-Flussdiagramm. Die wichtigsten Schritte der In-vitro-Fertilisation zu haploiden Embryonen sind schematisiert als Aufgaben an Tag 1 (pink Boxen) durchgeführt, um Spermien Lösungen und prime erwachsenen Zebrafisch-Weibchen, Aufgaben am Tag 2 (orange-Boxen durchgeführt vorbereiten ) zu sammeln und zu inaktivieren UV Sperma, um Eier zu sammeln, um die Eier mit UV inaktiviert Spermien befruchten zu Haploiden erzeugen, und dann, um den weiblichen Mutter wieder zu beleben, und finally Aufgaben an den folgenden Tagen durchgeführt, 3-5 (gelber Kasten), wenn die Kupplungen auf die gewünschte Zeit Stelle (n) für die Beobachtung und Analyse inkubiert.

Abbildung 3. Vergleich von diploiden und haploiden Stamm Tübingen Zebrafischembryonen. A) diploiden Wildtyp-Embryonen wurden durch natürliche Laich hergestellt und dann bis ca. 30 hpf. B inkubiert, C) Haploid Wildtyp-Embryonen, die durch In-vitro-Befruchtung von Kupplungen von F1-Generation mutiert Frauen mit UV-inaktivierten Spermien erhalten produziert und bis inkubiert ca. 30 hpf. Haploiden zeigte eine Reihe von Auffälligkeiten in der Entwicklung im Vergleich zu diploiden Wildtyp-Embryonen (schwarze Pfeilspitzen, d zu diploiden angeben). Relativ normal Haploiden hatte einen verkürzten, mehr Lager Körper analog der Notenskala vonein A haploiden ¹⁵ (rote Pfeilspitzen, die mit A), während Haploiden grob Anomalien zeigten eine stark abgeschnitten Körperachse (lila Pfeile, beschriftet B) entspricht der Note B und schließlich die Besoldungsgruppe C (blaue Pfeilspitzen, mit C) auf der Grundlage veröffentlichten Beschreibungen ^15. Alle Embryonen wurden bei einer 2,5-facher Vergrößerung fotografiert.

Abbildung 4. Entwicklungs Strukturierung von Zelltypen, die die embryonale Nieren Pronephros Orgel in Tübingen haploiden Stamm Zebrafisch enthalten. Haploid Wildtypen angezeigt ein normales Muster von Zelltypen in der embryonalen Nierenstruktur (obere Reihe). Die embryonale Nieren besteht aus einem Paar von segmentierten Funktionseinheiten Nephronen bekannt. Die segmentierte Muster einzelner Zelle in Nephronen vorhanden Typen können auf der Grundlage der ganze Berg visualisiert werden in-situ-Hybridisierung Expressionsmuster des Gens Transkripte, die einzigartig für den differenzierten Nephron Zelltypen, die die Podozyten (P) durch wt1b und Nephrin markiert sind sind der proximale Tubulus (PCT) von slc20a1a, proximalen gerade Röhrchen (PST markiert ) durch TRPM7 markiert, das distale früh (DE) von SLC12A1, und das distale Ende des Röhrchens (DL markiert) von SLC12A3 markiert. lib haploiden Mutante Embryonen (untere Reihe) Display reduziert Podozyten, PCT und ein abwesender PST, zusammen mit einem erweiterten DE und DL-Segment, ähnlich diploide Embryonen ¹⁸ lib. Embryonen wurden in einer dorsal fotografiert, mit vorderen links, an einer 10-facher Vergrößerung.

Diskussion

Haploid Screening ist eine nützliche Technik, um essentielle Gene Voraussetzung für frühen Entwicklungsstadien zu entdecken. Weitere, Anzucht von haploiden Zellen aus dem Medaka-Fisch verwendet wurde, um ES-Zelllinien, die wie zahlreiche Forschungsanwendungen und Potenzial, die zeigen, dass haploide Zellen eine wertvolle Zukunft Austragungsort für andere Arten von Wirbeltieren genetische Studien ^20,21 liefern zu isolieren. Dieses Protokoll bietet eine Demonstration der mit der Durchführung der Produktion von haploiden Zebrafischembryonen durch in-vitro-Fertilisation mit UV inaktiviert Spermien beteiligt Methoden. Diese Methode kann verwendet werden, um vorwärts haploiden Bildschirme mit mutagenisierten F1 Fische, die mit Wildtyp-oder transgenen Mutanten-Stämme für Enhancer / Suppressor-Screening vorgenommen werden können durchzuführen.

Obwohl das Screening Zeit mit einem haploiden Strategie ist enorm im Vergleich zu diploiden Screening verkürzt, wird es dennoch mehrere Monate in Anspruch nehmen. Wie wir beschriezuvor Bett, es gibt viele Vorteile, die durch Ausführen einer Bildschirm mit einem haploiden Schema, die alle bei der Herstellung neuartiger Beiträge zum aktuellen Wissen über eine beliebige Anzahl von Entwicklungs-Ereignissen zu erleichtern existieren. Die haploiden Bildschirm-Methodik ist für die Identifizierung der rezessiven mutierten Allelen als diploide-basierte Bildschirme aufgrund der Reduzierung von Zeit, Raum und die Anzahl der Fische, die benötigt werden effizienter. Allerdings gibt es einige Fallstricke zu einem haploiden Bildschirm. Ein Bildschirm kann nur haploide Mutanten identifizieren Gene, die in den ersten Tagen der Entwicklung aktiv sind, wie der Embryo kann nur für eine begrenzte Zeit zu überleben mit einem haploiden Genom. Gene, die später in der Entwicklung exprimiert werden müsste durch ein anderes Verfahren, wie beispielsweise eine diploide Bildschirm identifiziert werden. Auch einige Organe richtig in einem haploiden Organismus entwickeln nicht. Es können anatomische Anomalien, oder eine verzögerte Zeit der Entwicklung, was dazu führen kann die Mutation von haploiden Screening-Technik verfehlt werden. Ichn hinaus einige Stämme von Fisch nicht so gut entwickeln in einem haploiden Zustand ^15. Haploiden kann durch eine Reihe von Sortier gute, mittlere und schlechte embryonalen Eigenschaften kategorisiert werden, mit einer Embryonen als die meisten normalen, B, Embryos mit Defekten in der Achse bezeichnen, aber ein klarer Kopf und Schwanz, und C / D, um Embryonen mit unkenntlich zu bezeichnen Funktionen (Zellmassen oberhalb Dotterkugeln) ^15,17. Die Anteile von Embryonen innerhalb dieser Kategorien ist je nach Zebrafisch-Stamm, mit einer erhöhten Anzahl von besserer Qualität Haploiden häufiger in bestimmten genetischen Hintergründen ^15,17. Aufgrund dieser Faktoren ist es erforderlich, einen geeigneten Stamm von Zebrafisch zu finden, um die Mutagenese und anschließende Kreuzungen durchzuführen. In unserer jüngsten Erfahrungen, produziert der Wildtyp-Stamm Tübingen tragfähige Haploiden für das Screening (wie in den 3 und 4 gezeigt), obwohl historisch Zebrafisch-Forscher haben die AB oder die AB * haploiden Stämme für experim genutztsentation ^15.

Zusätzlich zu diesen oben genannten Herausforderungen werden nicht alle grundierten erwachsenen Zebrafisch Weibchen eine Kupplung auf die Durchführung der Presstechnik zu produzieren. Zum Beispiel in der Arbeit mit ENU-mutagenisierten Stamm Tübingen Weibchen produziert etwa die Hälfte aller Frauen eine Kupplung beim Zusammendrücken, und einige Bruchteil davon (in der Regel 10-30%) waren arm Embryoqualität oder konnte nicht befruchtet werden. So, um einen haploiden Bildschirm durchführen muss man planen, mindestens doppelt so viele Fische wie notwendig, um die gewünschte Anzahl von Genomen (jedes Weibchen stellt eine Genom geschirmt) Bildschirm zu erhöhen. Unabhängig von dieser Überlegung sind die Vorteile der haploiden Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Genomen ohne eine massive Tieranlage decken in der Tat sehr wichtig, wenn der Test zugänglich haploiden Zustand. Es sollte jedoch auch darauf hingewiesen, dass die weitere Studie über die Mutation (en) in der haploiden Kupplungs identifiziert ist vollständig abhängig von erfolgreich ein Anheben werdenn Outcross aus der weiblichen Gründer. Wie bei jedem Bildschirm 'trifft' zunächst während der Screening-Prozess identifiziert muss in der diploide Zustand wieder identifiziert werden.

Trotz der Gefahren der Verwendung der haploiden Bildschirm hat sich gezeigt, sehr erfolgreich bei der Identifizierung von Mutanten, die in der Tiefe mit aufschlussreichen Gewinne an den wissenschaftlichen Bereich ¹⁵ analysiert wurden zu sein. Haploid Bildschirmen implementiert werden, um andere schlecht verstanden Prozesse der Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Mit Haploiden für Enhancer und Suppressor-Bildschirme ist ein Weg, um mehr Einblick in die Aktivitäten und regulatorische Netzwerk eines Gens von Interesse zu gewinnen. Die haploiden Screening-Technik kann auch verwendet werden, um Enhancer und Suppressoren von Mutanten, die bereits durch Verfahren wie chemische oder Insertionsmutagenese isoliert oder Rückwärts Genetik Ansätze wie TILLING oder TALENS identifizieren. Kurz gesagt, kann der zuvor isolierten Mutante mit ENU Mutagenese und Verstärker oder s zu sehen seinuppressors der ursprünglichen mutierten Phänotyp. Die Mutante muss adulte Stadien zu erreichen, so ist es notwendig, einen heterozygoten Tier oder eine schwache homozygot mutierte Fische haben, um diesen Bildschirm durchzuführen, aber die jüngsten Fortschritte in der Transgenese haben es Forscher, dieses Problem zu Rock. Lernen, wie man Wege in der Entwicklung manipulieren kann auf viele spannende Möglichkeiten, einschließlich der Aussicht störenden Wege zur Behandlung von Krankheitszuständen führen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hank's Stammlösung #1			8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0,358 g Na2HPO4 wasserfrei; 0,60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0,72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1,23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O
Hank's Premix			Kombinieren Sie in der folgenden Reihenfolge: (1) 10,0 ml HS#1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Lagern Sie alle HS-Lösungen und Premixe bei 4 °C.
Hank's Stock Solution #6			0,35 g NaHCO3 in 10,0 ml ddH2O; am Tag der Anwendung frisch machen.
			Kombinieren Sie 9,9 ml Hank's Premix mit 0,1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Bankleuchte	UVP	95-0042-05	Modell XX-15S Bankleuchte
XX Tischständer (verstellbar)	UVP	18-0062-01	Modell XX-15 Stand
Embryo Inkubationsschale	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in destilliertem Wasser. Ergänzen Sie mit Methylenblau (1 x 10-5 M) (Sigma M9140), um Kontaminationen zu hemmen.
1 X E3			50 X E3 in destilliertem Wasser verdünnen
Stereomikroskop	Nikon	SMZ645;

SMZ1000