כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבות ומבודדות היטב של יחידה אחת מאינטרנוירונים מעכבים שזוהו בקליפת המוח של העכבר המורדם. תאי עצב המבטאים ChR2 מזוהים על ידי תגובתם לאור כחול. השיטה משתמשת בציוד הקלטה חוץ-תאי סטנדרטי, ומשמשת כחלופה זולה להדמיית סידן או תיקון מונחה חזותית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדריך ל בשנת vivo הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically
במאמר זה
סיכום
תקציר
אתגר גדול בנוירופיזיולוגיה היה לאפיין את מאפייני התגובה ותפקוד של סוגים הרבים של תאים מעכבים בקליפת המוח. אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבה, מבודדות היטב יחידה אחת מinterneurons המעכבת שזוהתה בקליפת מוח העכבר הרדים בשיטה שפותחה על ידי לימה ו1 עמיתים. הקלטות מבוצעות בעכברים המבטאים Channelrhodopsin-2 (ChR2) בתת אוכלוסיות עצביות ספציפיות. בני האוכלוסייה מזוהים בתגובתם להבזק קצר של אור הכחול. טכניקה זו - המכונה "PINP", או זיהוי סייע-photostimulation של אוכלוסיות נוירונים - יכולה להיות מיושמת עם ציוד הקלטה תאי סטנדרטי. זה יכול לשמש חלופה זולה ונגישה להדמית סידן או תיקון חזותי מודרך, לשם מיקוד הקלטות תאית לתאים גנטיים מזוהים. Here אנו מספקים סדרה של הנחיות לייעול השיטה בפרקטיקה יומיומית. אנו מעודנים האסטרטגיה שלנו באופן ספציפי למיקוד תאי parvalbumin-חיובי (+ PV), אבל מצאנו שזה גם עובד עבור סוגים אחרים interneuron, כגון (SOM +) להביע סומטוסטטין וinterneurons להביע calretinin (CR +).
מבוא
אפיון סוגי התאים הרבים המרכיבים את מוח היונקים היה מטרה מרכזית, אך חמקמקה מזה זמן רב, של נוירופיזיולוגיה. לדוגמה, המאפיינים והתפקוד של סוגי תאים מעכבים שונים בקליפת המוח הם נושאים מעניינים מאוד אך עדיין אינם ידועים יחסית. הסיבה לכך היא בין השאר מכיוון שטכניקות הקלטה עיוורות קונבנציונליות מוגבלות ביכולתן להבחין בין סוגי תאים שונים. ניתן להשתמש ברוחב ספייק חוץ-תאי כדי להפריד נוירונים מעכבים חיוביים לפרוואלבומין מתאי פירמידה מעוררים, אך שיטה זו כפופה לשגיאות מסוג I וסוג II2,3. לחלופין, ניתן למלא, לשחזר ולצבוע נוירונים מתועדים כדי לאשר מאוחר יותר את זהותם המורפולוגית והמולקולרית, אך זהו תהליך גוזל זמן רב. לאחרונה, אוכלוסיות מזוהות גנטית של אינטרנוירוני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול הבא הוא בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות כפי שאושר על ידי אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים אורגון ועדת שימוש.
1. ניתוח חריף
- להרדים את החיה עם קוקטייל קטמין-medetomidine, באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP) (טבלת 1).
הערה: העכברים משמשים בניסויים אלה נוצרים על ידי חציית line10 המהונדס cre תלוי ChR2-EYFP לinterneuron קווי נהג (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, + SOM; Cr-iCre12, CR +). משלוח ויראלי של ChR2 או opsins קשור צריך לעבוד באותה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יחידה אחת מinterneurons המעכבת גנטי-מסווגת בקליפת העכבר בהרדמה, באמצעות שיטת optogenetic שפותחה על ידי ואח לימה אל. 1. טבלת פרטים 1 קוקטייל ההרדמה הציע, קטמין-medetomidine-Acepromazine (" KMA "). איור 1 מתאר microelectrode טונגסטן, מוכן להקלטה. איור 2 מכילים תרשים מעגל עבור יחידת בקרת LED פשוט. איור 3 מכילים את התצורה וקוד .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות PINP באופן רעיוני פשוט, זה יכול להיות מאתגר בפרקטיקה. הקובע עיקרי של הצלחה הוא הבחירה של האלקטרודה. רדיוס ההאזנה החשמל הוא הפרמטר הקריטי. זה חייב להיות גדול מספיק כדי לזהות קוצים אור עורר כאשר הקצה הוא עדיין במרחק מה מתא ChR2 +, כך שאפשר להתאים את קצב התקדמות בהתאם. באותו הזמן, זה חייב להיות מוגבל מספיק כדי לאפשר בידוד יחידה אחת טוב. כלומר, האלקטרודה אסור גם להרים קוצים מיחידות ChR2- שכנים. את האיזון הנכון במונחים של רדיוס האזנה יהיה אתגר עבור כל סוג תא מטרה, אבל זה נכון במי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי קרן וייטהול וה-NIH. אנו מודים לקליפורד דקס (מינהל התמיכה הטכנית של אוניברסיטת אורגון) על עזרתו ומומחיותו בתכנון מעגל עבור אספקת אור.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ChR2-EYFP | קו מושבות ג'קסון | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) קו | מושבות ג'קסון | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) | קו מושבות ג'קסון | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) | קו מושבות ג'קסון | 10774 | |
| אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | A9793 | סוג III-A, נקודת מיקרו EEO גבוהה |
| (דוראלית וו) | FST | 10066-15 | |
| מספריים כירורגיים | FST | 14084-09 | |
| אזמל | FST | 10003-12 (ידית), 10011-00 (להבים) | |
| Puralube משחת | פוסטר & סמית | 9N-76855 | |
| שמיכה הומותרמית | מנגנון הרווארד | <שם = "טווח! C11 אינץ'>507220F | |
| טונגסטן מיקרואלקטרודות | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ התנגדות AC, 127 μ קוטר מ', 12& מעלות; קצה מחודד, צינורות זכוכית נימית מצופה אפוקסי |
| וורנר אינסטרומנטס | G150TF-3 | ||
| צינורות כיווץ חום | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit מאיץ | DVA | SKU ZA/ | ZAA שימוש עם דבק סופר סטנדרטי. |
| מגבר AC מיקרואלקטרודה 1800 | AM מערכות | 700000 | |
| MP-285 מיקרומניפולטור ממונע | סאטר | MP-285 | |
| אוסילוסקופים דיגיטליים 4 ערוצים | Tektronix | TDS2000C | |
| רמקולים מופעלים | הרמן | דגם JBL | |
| מניפולטור ידני | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 ומיקרו; m כבל תיקון סיבים אופטיים | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| מד כוח | ThorLabs | PM100D (מד כוח), S121C (חיישן כוח סטנדרטי) | |
| 475 ננומטר Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED ההספק והיעילות גדלים ללא הרף, לכן אנו ממליצים לבדוק את המוצרים העדכניים ביותר (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
מקורות
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
