表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内 通过将转化细胞原位注射到同系、免疫功能健全的同窝幼鼠脑内。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
目前的星形细胞瘤模型在界定致瘤性突变在疾病发生过程中对特定脑细胞类型的作用，以及在临床前药物开发中的应用方面存在局限性。为了针对这些应用设计更优的模型系统，研究人员从携带不同组合的floxed致瘤等位基因的条件性基因工程小鼠（GEM）中分离出表型为野生型的皮层星形胶质细胞和神经干细胞（NSC），并在体外进行培养。通过诱导基因重组 体外 通过腺病毒介导的Cre重组，实现突变癌基因的表达和肿瘤抑制基因的缺失。通过检测细胞增殖、转化能力及药物反应，确定这些突变的表型效应。 体外. 通过将转化细胞立体定向注射到免疫健全、遗传背景相同的同窝幼鼠脑内，建立同位异体移植模型，以明确致癌突变和细胞类型在肿瘤发生中的作用 体内与大多数已建立的人胶质母细胞瘤细胞系异种移植模型不同，将经转化的GEM来源的皮层星形胶质细胞注射到免疫健全同窝幼鼠脑内，可产生星形细胞瘤，包括最具侵袭性的亚型——胶质母细胞瘤，其组织病理学特征与人类星形细胞瘤高度相似，表现为向正常脑实质的弥漫性浸润。通过生物发光成像技术，对经基因工程改造后表达荧光素酶的转化星形胶质细胞所形成的原位同种移植瘤进行监测 在体 随时间推移的肿瘤生长情况。因此，利用从携带条件性致癌等位基因的基因工程小鼠（GEM）中分离的星形胶质细胞和神经干细胞构建的星形胶质瘤模型，为研究星形胶质瘤发病机制中的遗传学和细胞生物学提供了整合性研究系统 体外 和 体内 在这些严重疾病的临床前药物开发中可能具有应用价值。
引言
星形细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，而胶质母细胞瘤（GBM）是星形细胞瘤的Ⅳ级亚型，为最常见且最具侵袭性的类型，其中位生存期为12至15个月1,2弥漫性星形细胞瘤（尤其是胶质母细胞瘤，GBM）的侵袭性导致无法完全手术切除，限制了辅助治疗的效果，并不可避免地引起治疗后复发3患者最初表现为初发性（原发性）胶质母细胞瘤，或表现为不可避免地进展为继发性胶质母细胞瘤的低级别星形细胞瘤4胶质母细胞瘤（GBM）在基因组上具有异质性，其特征是调控三条核心信号通路的基因存在互斥性及共现性突变：G1/S（Rb）细胞周期检查点、受体酪氨酸激酶（RTK）和 TP53 通路5-7胶质母细胞瘤（GBM）包含四种具有不同基因表达谱的基因组亚型，其表达特征类似于不同类型脑细胞，提示GBM亚型受其起源细胞的影响。6,8,9需要更好的星形细胞瘤模型来明确特定突变组合在星形细胞瘤发病过程中对特定细胞类型的作用。利用这些模型进行更高效的临床前药物开发，最终将有助于改善患者的预后。目前的星形细胞瘤模型包括已建立的人源细胞系、患者来源的异种移植模型（PDX）、基因修饰的正常人星形胶质细胞以及神经干细胞。 （NSC）和基因工程小鼠（GEM）10-14我们开发了一种替代性的非生殖系基因工程小鼠（nGEM）模型15 利用携带不同组合的floxed致癌等位基因的GEM中分离出的原代脑....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 培养新生小鼠皮层星形胶质细胞
- 准备
- 将2-3张精细擦拭纸揉成团，放入盛有70%乙醇的锥形瓶底部。将解剖剪、弯头镊子和两对直头显微镊放入该锥形瓶中。擦拭纸用于防止显微镊尖端弯曲。
- 加入 1 ml 向60 mm组织培养皿中加入HBSS。每只动物准备单独的培养皿，并将培养皿置于冰上保存。
- 根据机构规定对动物进行麻醉。
- 为每只动物将 7 ml 含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM（完全 DMEM）预热至 37 °C 水浴。注意：对于5只小鼠，步骤1.1.1–1.1.4将耗时约15分钟。
- 组织采集
- 按照机构规定处死新生小鼠（出生1-3天）。
- 将解剖剪从乙醇中取出，使其自然沥干，然后从脊髓至鼻部沿颅骨表面的皮肤做矢状切口。
- 沿矢状缝从脊髓端开始向嗅球前方延伸，在颅骨上做一切口。操作时应注意使剪刀尖端紧贴颅骨内表面，以尽量减少对脑组织的损伤。
- 使用弯头镊子，轻轻地将颅骨的每个半侧从大脑两侧剥离。
- 使用直型显微镊子，轻轻夹去每个大脑半球的背侧部分，并将其放入含有HBSS的组织培养皿中。注意避免触及小脑和嗅球，不要取胼....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们开发了一种nGEM模型系统，该系统采用来自携带floxed条件性致癌等位基因的新生GEM的皮层星形胶质细胞和NSC，可进行表型表征 体外 和 体内 (图1). 为了专门研究癌基因突变在皮层星形胶质细胞中的影响 体外, 首先对星形胶质细胞进行富集至关重要。皮层星形胶质细胞收获物中包含小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）和神经元的混合物，但可通过机械和遗传方法实现星形胶质细胞的富集。在常规培养条件下，神经元会死亡，而小胶质细胞和少突胶质细胞可通过过夜震荡去除41,43此外，针对GFAP的floxed致癌等位基因的遗传重组+ 使用 Ad5GFAPCre 可富集星形胶质细胞。我们采用该方法感染 Rb1 的皮层组织收获物loxP/loxP 带有 Nf1 基因条件性等位基因的小鼠幼崽loxP/loxP 和/或 PtenloxP/loxP 等位基因。Ad5GFAPCre 感染在重组的 GFAP 中导致增殖优势+<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
确保正确收获和培养皮层星形胶质细胞最关键的步骤包括：1）切除大脑皮层时避免取到胼胝体下方的组织，2）彻底去除脑膜，3）充分解离细胞，以及4）富集GFAP阳性细胞。+ 星形胶质细胞。尽管我们采用了机械法（振荡）和遗传学方法（利用Ad5GFAPCre载体限制基因重组或使用显性转化转基因）TgGZT121）在下 GFAP 启动子对照）方法富集GFAP+ 星形胶质细胞，其他技术已被用于纯化皮层星形胶质细胞。例如，可通过用有丝分裂抑制剂处理汇合培养物，随后加入L-亮氨酸甲酯，以去除污染的微胶质细胞47在含血清培养基中通过机械法纯化并培养的星形胶质细胞，其形态和表达谱与急性分离的星形胶质细胞存在差异，前者被认为可能代表较不成熟的星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型48,49最近，已开发出一种免疫筛选方法，可前瞻性地纯化皮层啮齿类动物星形胶质细胞，当在添加生长因子且不含血清的培养基中培养时，其表达谱更接近于急性分离纯化的星形胶质细胞49传统机械法与近期发展的免疫pan.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
CRM 是 Damon Runyon-Genentech 临床研究员。本工作部分由 Damon Runyon 癌症研究基金会（CI-45-09）、美国国防部（W81XWH-09-2-0042）以及北卡罗来纳大学癌症研究基金（UCRF）向 CRM 提供的资助支持。作者感谢 Daniel Roth 在小鼠饲养方面提供的协助。作者还感谢 Hannah Chae、Carter McCormick、Demi Canoutas、Stephanie Gillette 和 Susannah Krom 在组织培养和免疫荧光实验方面提供的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM高糖培养基（1X） | Invitrogen | 11995065 | DMEM也可从其他供应商购买，包括GIBCO Sigma和Cellgro |
| 胎牛血清，常规型 | Cellgro | 35-010-CV | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Invitrogen | 15140122 | |
| 尖头解剖剪刀 | Fisher Scientific | 08-395 | |
| 弯头软骨镊 | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 型珠宝镊，精细，4号 | Miltex | 17-301 | |
| 乙醇（200 proof） | Decon Labs | 2710 | |
| 剃须刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS）（1x），液体 | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express（1x），含酚红 | Invitrogen | 12605-010 | 其他胰蛋白酶溶液也适用于皮层星形胶质细胞的分离与培养 |
| 培养皿，60 × 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml 离心管 | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml 离心管 | BD Biosciences | 352070 | |
| 腺病毒原液 | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | 分装为5 µl 每管，-80 °C保存。具有危险性。需采用BSL2级安全防护措施 |
| 硫酸钠（Na2SO4） | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| 硫酸钾（K2SO4） | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| 氯化镁（MgCl2） | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 氯化钙（CaCl2） | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES钾盐 | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington | LS003127 | |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| 注射器滤器（0.22 µm 孔径） | Millipore | SLGP033NS | |
| NeuroCult增殖培养基试剂盒（小鼠） | Stemcell Technologies | 5702 | 该试剂盒包含神经干细胞（NSC）培养所需的NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC补充剂 |
| 0.2% 肝素溶液 | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS）（10x） | Invitrogen | 14185-052 | |
| 硫酸镁（MgSO4） | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | 用DMSO配制成10 mM储存液，-20 °C保存 |
| 6孔板 | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| 细胞筛（40 µm 孔径） | Corning | 352340 | |
| 干细胞解离溶液 | Stemcell Technologies | 5707 | 也可使用温和的酶解溶液，如Accutase |
| 甲基纤维素 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| DMEM培养基 2x | Millipore | SLM-202-B | 用于配制5%甲基纤维素溶液 |
| 1.7 ml 带盖微量离心管 | Corning | 3620 | |
| Hamilton微量注射器，250 µl LT，无针头 | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 抗原分配器 | Hamilton | 83700 | |
| 一次性18 G针头 | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27号，1/2" 鲁尔接头针头 | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-三溴乙醇（Avertin） | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 聚维酮碘 | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| 普拉露眼用软膏 | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 立体定位仪 | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | 组织粘合剂 |
| 利多卡因 | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS） | Promega | G3580 | |
| 抗Sox2抗体 | Millipore | AB5603 | |
| 兔多克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体 | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | 用于in vivo成像 | |
| D-荧光素钾盐生物发光底物 | PerkinElmer | 122796 | 用于in vivo生物发光成像 |
| EdU成像试剂盒 | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV 荧光素酶 PGK-潮霉素抗性载体 | Addgene | 18782 |
参考文献
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
