Introduction
תא אקסון של נוירונים מראה מידה רבה של עצמאות תפקודית מתא somato-הדנדריטים. בנוירונים הקרנה, אקסונים מכילים את רוב 1,2 החלבון העצבי. חקר הפיסיולוגיה והפתופיזיולוגיה של אקסונים צבר תאוצה בקהילת מדעי המוח, כי מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תפקוד לקוי של אקסון המוקדם נראה כי תכונה משותפת של מחלות ניווניות והפרעות נוירופסיכיאטריות 3. סביר להניח כי הבנה טובה יותר של מנגנוני אקסון בלעדי בתנאים נורמלים ופתולוגית שתשפוך אור על האירועים המוקדמים המניע את חוסר תפקוד.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בתרבות מוסיף נושאות קרום נקבובי (מסנן) כדי להשיג כמויות גדולות של חומר אקסון טהור כי הוא מתאים ביוכימי וimmunocytochemical מנתח. השימוש במסנן מוסיף ללמוד הביולוגיה אקסון יושמה לראשונה על ידי דייל ועמיתים 4 ופותחו עוד יותר על ידי Twiss ועמיתים 5 לתצורתו הנוכחית. הטכניקה היא כעת בשימוש שוטף על ידי קבוצות לימוד היבטים שונים של אקסון והביולוגיה דנדריט, עם שינויים קלים בכל מקרה כדי להתאים לאוכלוסייה של נוירונים למדו, הטיפולים שבוצעו ואת הסוג של ניתוחים ביוכימיים המשמשים 6-9. הפרוטוקול הנוכחי אינו מתכוון להכיל את כל החלופות למגוון כה רחב של יישומים, אלא מספק גישה פשוטה, שמתאימה למרבית היישומים. בפרט, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בציפוי משולש למיקסום תשואת אקסון עבור ניתוחים ביוכימיים והוא מתאים ביותר ללמוד אקסון ציפויי ניוון-אחר המתוארים בספרות המיוצר פחות אקסונים שיחזרו ולהידרדר מהר יותר כאשר נשללו מגורמים תזונתיים 9.
בהליך זה, גופי תא עצביים נותרו מבודדים על גבי עלי לעשות סינוןאקסונים ile לעבור הדרך הנקבוביות ולגדול לאורך המשטח התחתון שלה. אקסונים טהורים (ללא גליה ומזהמים גוף תא עצביים) הגדלים על המשטח התחתון של המסנן יכולים להיות שנאספו עבור ניתוחים ביוכימיים או יכולים להיות קבוע באתר ונבחנו על ידי טכניקות immunocytochemical 9. ההליך מסתמך על השימוש בתאי עצב תחושתי עובריים מהגרעינים הגבי שורש (DRG). DRGs עוברי נמצא בשימוש נרחב ללמוד ביולוגיה אקסון בגלל neurites מהתאים אלה עוברות צמיחה מהירה וחזקה במבחנה, כאשר נשמר בגורם גדילה עצבי (NGF), וכי הם במהירות לעבור ניוון כאשר נשללו של גורם זה. כמו כן, הנוירונים DRG חסרי דנדריטים, כך שכל neurites שנאסף על ידי בשיטה זו הן אך ורק אקסונים.
מוסיף מסנן מייצג יתרון גדול בהשוואה לגישות אחרות המשמשות ללמוד אקסונים. מחקרים להסתמך על השימוש במיקרוסקופ לבדל תהליכים המתרחשים בתא סומה מאלוxons לספק מידע ביוכימי מוגבל. כדוגמא נוספת, מערכות ממודרות תרבות (למשל, תאי Campenot 10 או מכשירי microfluidic 11) שימושיות לגישות הדמיה ולטיפול בהפרש של תאי תאים אלא לספק רק כמויות קטנות של חומר באקסון המונעות את השימוש בטכניקות אלה לניתוחים ביוכימיים אשר דורשים כמויות גדולות היחסי של מדגם. יתר על כן, השימוש בם דורש הכשרה משמעותית, כמו גם התקנים מיוחדים, והם גוזלים זמן. גישה אחרת המשמשת לעתים קרובות לבודד את האקסונים מ explants היא להסיר באופן ידני מרכז explant (המכיל גופי תא עצביים) לפני איסוף דגימת אקסון. למרות שזה יכול לייצר כמויות גדולות של תכשירים מועשר האקסון, ניתן עטפו אקסונים בתכשיר זה בגליה ומהירות הסרת הגופים של 20 explant ברציפות מ -6 בארות (כדוגמא לניסוי מינימאלי) היא זמן רב ועל גבול כדאיות.
לעומת זאת, בשיטה המוצגת כאן מייצרת הכנות אקסון שופעים וטהורות, כי אז יכול להיות מנותחת על ידי כמעט כל טכניקה ביוכימיים המשמש בדרך כלל כדי לנתח lysates כל התא, כמו כתם מערבי, immunoprecipitation 6, כתם צפוני 5 ספקטרומטריית מסה 6, טיהור RNA 7,12,13, בין יתר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על Immunofluorescence טכניקות (IF), כפי שאפשר לתקן אקסונים גדל בצד התחתון של המסנן כדי לבחון אותם עוד יותר על ידי אם. גישה זו מאוד מקלה על הניתוח של תהליכי אקסון ספציפי מכיוון שאין גופי תא בהכנה הסופית. זהו יתרון משמעותי שכן אות גבוהה immunofluorescent מגופי תא לעתים קרובות פוגעת בבחינה וניתוח של אותות חלשים שמקורם במבנים דקים כגון אקסונים.
שני יישומים של שיטת התרבות ללמוד ar ניוון אקסוןדואר תאר; מודל של גיזום התפתחותיים ומודל של ניוון הנגרם פגיעה (המכונות ניוון Wallerian כ). המודלים של גיזום התפתחותי מבוסס על העובדה שתאי עצב תחושתי in vivo להתחרות על הגבלת סכומי NGF-derived יעד ואלו שלא הצליחו לקבל מספיק מנוון תמיכת נוירוטרופי 14. תופעה זו יכולה להיות חיקה בתרבויות DRG העובריים על ידי נסיגת NGF מהתקשורת והתרבות, אשר, כפי שקורה בvivo, יוזם ניוון אקסון אחריו הרס גוף תא. למודל ניוון Wallerian, הצד העליון של המסנן עם גופי התא שרוט משם. אקסונים שצמחו על הצד התחתון של המסנן להיות מופרד פיזי מהגופים התא ולאחר מכן לעבור את התהליך המהיר וסטריאוטיפי ניווניות המכונה ניוון Wallerian 15, על שמו של א 'וולר שדיווח על התופעה ראשונה בשנת 1850 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ההליכים הבאים בהתאם להנחיות שאושרו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל המאמצים נעשים כדי למזער את הכאב ומצוקה של בעלי חיים במהלך הליכים.
1. ציפוי של מסננים
הערה: כאשר מוסיף מסנן התרבות ממוקמים בבארות של צלחות רב גם, שני תאים מוגדרים: התא העליון הוא האזור מעל להוסיף והתא התחתון הוא אחת מתחת להוספת איור 1A.ab. Explants הם זורעים בתא העליון שבו הם מייחסים לצד העליון של המסנן; אקסונים רבים לגדול דרך המסנן ולהאריך בצד התחתון של המסנן, בתוך התא התחתון איור 1A.c. כרכי העבודה סטנדרטיים (כלומר, ליישום פתרון ציפוי, מתרחץ, תקשורת ותרבות, וכו ') הם 2 מיליליטר לתא התחתון ו1 מיליליטר לתא העליון והולכים להיות מכונים בפרוטוקול כ"; כרכים סטנדרטיים ". הוספת פתרונות החל מהתא התחתון על ידי הצבת קצה פיפטה בפער בין ההוספה והצד השני של הבאר. כמו כן, הטה את הכנס לצד אחד ואילו מחלק הפתרון כדי למנוע בועות מלהיות לכוד בחלק התחתון של המסנן.
- התחל ציפוי מסנני היום לפני ציפוי. מתחת למכסה מנוע רקמת סטרילית התרבות, מקום 24 מוסיף מסנן מ"מ בצלחת 6 היטב שקיבלה. דגירה מוסיף עם פולי-D-ליזין במים (1 מ"ג / מיליליטר) במשך שעה 1 ב RT באמצעות כרכים סטנדרטיים: 2 מיליליטר בתא התחתון ו1 מיליליטר בחלק העליון.
- לשאוב פולי-D-ליזין ולשטוף פעם אחת במים. מים לשאוב, לסגור את המכסה ולהשאיר את הצלחות לייבוש בO / נ מכסת המנוע במהלך השאיפה של נוזלים, הקפד להסיר את שארית הנוזל שהופך לכודה ישירות תחת המסנן.
- למחרת בבוקר, לדלל laminin במים (10 מיקרוגרם / מיליליטר), לערבב וחם ב 37 ° C. דגירה מוסיף עם laminin שעה 1 בcelחממת l על 37 מעלות צלזיוס, תוך שימוש באמצעי אחסון סטנדרטי.
- laminin לשאוב ולהוסיף קולגן במים (0.1 מ"ג / מיליליטר) ו דגירה עבור שעה 1 ב RT. במקרה זה להשתמש 2 מיליליטר לתא התחתון ו -2 מיליליטר לתא העליון.
- קולגן לשאוב ולשטוף פעם עם מים סטריליים. המסננים מוכנים כעת לקבל תקשורת התרבות וexplants DRG, כפי שמתוארים בשלב 3.
2. הביתור עוברי הגבי רוט גנגליון Explants (DRG)
- הרדימי נשי עכבר בהריון 13 יום אחר הזרקת ה-IP של Avertin (250 מ"ג / קילוגרם). חכה 10-15 דקות ולבדוק לחוסר רפלקסים נסיגת קרנית ודוושה. ברגע שההחזרים חסרים, לבצע נקע בצוואר הרחם.
- לחטא את כל מכשירי הניתוח והבטן נשית עם 70% אתנול. אפשר למכשירים לייבוש. את העור של הבטן ולחתוך את שכבות עור ושרירים כדי לחשוף את חלל הבטן.
- להסיר את הרחם על ידי ניתוק מצוואר הרחם והשחלות. בsteriמכסה המנוע le, להסיר את העוברים מהרחם עם מספריים ולאסוף אותם בצלחת פטרי מלאה תקשורת L15 קר כקרח. שמור על קרח.
הערה: עיין בדוחות טכניים קודמים לפרטים נוספים בדבר אופן השגה עוברים של 13 ימים של הריון 17,18. - מתחת למיקרוסקופ, להניח את העובר בצד ולהשתמש במספריים באביב קטנים כדי להסיר את הראש. עושה חתך לאורך הצדדים לרוחב כדי לבטל את החזה, הבטן, הגפיים והזנב. שמור על הגב המכיל את עמוד השדרה, להניח בצד הגחון ולהסיר את כל האיברים הפנימיים.
- עם מספריים באביב קטנים, לחשוף את חוט השדרה כולו על ידי חיתוך עמוד השדרה מצד גחונה לאורך קו האמצע. החזק את הפגר למטה עם זוג אחד של מלקחיים (# 3) ולהשתמש בזוג שני כדי להחזיק את חוט השדרה על ידי ההיבט מקורי ביותר שלה.
- לאט ובעדינות למשוך את הכבל מהחלל בחוליות ולצבוט את DRGs מחוט השדרה באמצעות מלקחיים דקים (מס '5). הקבוצה DRGs שייגבהתחתית הצלחת.
- לאסוף DRGs מקובצים לפי aspirating עם קצה פיפטה 200 μl שנחתך להגדלת הפתיחה שלה. הנח את DRGs בצינור ולהשאיר על קרח עד אוסף DRG הוא סיים.
הערה: טיפים לבנים / שקופים הם העדיפו בגלל DRGs לא להיצמד לקירות של קצה זה (בהשוואה לטיפים צהובים סטנדרטיים). טיפים פלאשינג עם תקשורת לפני שימוש נוסף מונעים DRGs להידבק לקירותיו.
3. זריעה ותחזוקה של הגב רוט גנגליון Explants על מסננים
- הוסף מדיה DRG מלאה על 37 מעלות צלזיוס למוסיפה המצופה באמצעות כרכים סטנדרטיים. מוסף מדיה התא התחתון עם 15 / מיליליטר ng של NGF, תוך שמירה על התא העליון NGF-בחינם.
שימו לב: למרות NGF המפזרת ביעילות על פני המסנן וריכוזה equilibrates בתוך שעות, יש לנו ציינו כי החלת NGF לתא התחתון ישירות לפני זריעה מגבירה את התשואה על אקסון ב באופן משמעותימשטח ottom של המסנן. - העבר את DRGs מהצינור למסננים באמצעות פיפטה 1,000 μl עם קצה הגזוז להגדלת הפתיחה שלה.
- צייר מדיה לתוך הקצה 2-3x לפני איסוף DRGs. זה מונע מהם להידבק לצד הפנימי של הקצה. אותו הקצה יכול להיות שימוש חוזר לכל הבארות. השימוש בטיפים צבועים (לעומת טיפים כחולים סטנדרטיים) מפחית דבק DRG אל פני השטח הקצה.
- כדי להעביר DRGs, הגדר את פיפטה ב800 μl. לשאוב כ 200 μl של תקשורת מהצד העליון של המסנן, ואז ללכת לצינור המכיל DRG ו פיפטה נפח קטן למעלה ולמטה - לresuspend DRGs ששקע לתחתית. לשאוב את כל הנפח וDRGs פיפטה הצללה הקצה באמצע הכנס.
- ברגע שנטענים כל מוסיף, לסגור את המכסה הצלחת ולערבל את הצלחת 10x, הקשה על אותו בעדינות על ספסל מכסה המנוע בין כל מערבולת. תנועות אלו להגדיל את תשואת אקסון ידי עוזר explants DRG לשקוע ולצרף למסנן. זה גם עוזר להפיץ explants באופן שווה, כך שהאקסונים מexplants שונה אינם חופפים.
הערה: הליך זריעת explant תואר בשלבים הקודמים מגדיל באופן משמעותי את השיעור הכולל של התקשרות explant למצע (עד 75%). באופן משמעותי ביותר, הליך pipetting בקלות מונע explants מצף על פני השטח בתקשורת במקום לשקוע לתחתית של הכנס. - עבור ניתוחים ביוכימיים, DRGs זרע מעובר אחד (בסביבות 30) למסנן. עבור ניתוחים מורפולוגיים, השתמש באחת וחצי או שליש מDRGs מעובר אחד (10-15). החלטה זו צריכה להיעשות לפני איסוף DRGs לתוך צינורות, כך שכל DRGs של צינור הם זורעים לתוך באר יחיד (אם זה 30, 15, או 10 DRGs).
- לשמור על תרבויות בתא חממה על 37 מעלות צלזיוס, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים. כדי לשנות תקשורת, לשאוב את התא העליון ראשון, ואחריו לתא התחתון. תקשורת טרי להוסיף בנפח סטנדרטיזה מתחיל עם התא התחתון.
הערה: כדי למנוע מתאים / אקסונים מייבוש, לא לשנות את התקשורת בלמעלה מ 3 מוסיף באותו הזמן. DRGs גדל על מסננים בנוכחות NGF ירחיב אקסונים ארוכים, שהגיע עד 2 מ"מ אחרי 2 ימים בתרבות.
4. תזונתי פקטור נסיגת טיפול
נסיגת NGF גורמת ניוון אקסון עם פיצול אקסון (נקבע על ידי ניגוד שלב וβ-III-טובולין IF) שמופיע סביב 12 שעות ראשונה שלאחר נסיגה. פיצול שלם מושגת על ידי 36 שעה. כמה זמן הניוון נשאר להמשיך לצריכה להיות נבחר על ידי משתמש הקצה, בהתאם לעיצוב ניסיוני.
- לאחר שלב הארכת אקסון 2 ימים, לשנות את התקשורת מתאים העליונים ותחתונים לתקשורת שחסרה NGF ומכיל נוגדנים נגד NGF (1 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לעקל כל NGF הנותר (או מיוצר באופן אנדוגני).
- חזרו צלחות חממת תא (37 מעלות צלזיוס) כדי לאפשרNGF ניוון-Induced נסיגה כדי להמשיך לסכום הרצוי של זמן.
- המשך להפקת חלבון (שלב 6) לבדיקה על ידי כתם מערבי או ישירות לבחון את המסננים על ידי IF (שלב 7).
5. אקסון חיתוך רוחב כדי לגרום Wallerian ניוון
הליך זה משאיר את האקסונים בצד התחתון של המסנן המנותק מהגוף התא שלהם, אבל חוץ מזה ללא פגע. לאחר מכן, אקסונים אלה במהירות ליזום ניוון Wallerian. פיצול אקסון (שמעיד בניגוד שלב או β-III-טובולין IF) ראשון מופיע ב -3 שעות לאחר חיתוך רוחב; ב -9 שעות, אקסונים הם מקוטעים לחלוטין ומנותקים מהמסנן. כמה זמן הניוון נשאר להמשיך לצריכה להיות נבחר על ידי משתמש הקצה, בהתאם לעיצוב ניסיוני.
- לגרד את הצד העליון של המסנן, המכיל explants DRG גדל, עם תא מגרד. ודא הסרת חומר העליון מוחלטת על ידי הזזת מגרד בX-, Y-ומעגליכיוונים.
- מחק את התקשורת מהתא העליון המכיל את explants צף כי כבר גרד מהמסנן ולהחליף עם 1 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש, להשלים DRG המכילה NGF (10 ng / ml).
- להחזיר את צלחת לתא חממה (37 מעלות צלזיוס) כדי לאפשר לניוון Wallerian כדי להמשיך לכמות הזמן שנבחרה על ידי משתמש הקצה.
- המשך להפקת חלבון (שלב 6) לבדיקה על ידי כתם מערבי או ישירות לבחון את המסננים על ידי IF (שלב 7).
6. הפקת חלבון של דוגמאות axonal
- מלא צינורות איסוף (1.5 מיליליטר) עם 75 μl של חיץ מדגם Laemmli. שמור צינורות על קרח בעת קצירת אקסונים מכל הקבוצה של מסננים.
- שטוף את המסנן עם explants DRG בPBS ולגרד את הצד העליון של המסנן. הסר את התוסף מהצלחת, לנקות את הצד העליון של המסנן עם המוליך כותנה קצה ולשאוב כל PBS נוסף מהצדדים העליונים ותחתונים.
- הנח הפוך להוסיףעל ספסל וחתך את המסנן מתוך הכנס באמצעות אזמל חד. החזק את המסנן עם מלקחיים, מלמטה למעלה. לעשות חתך מההיקף למרכז של המסנן במספריים.
- מסנן מקום בחלק העליון של צינור האיסוף, ועם מלקחיים, לחץ על המרכז של המסנן במורד הצינור. אמנם עושה את זה, משפך צריך טופס. דחף את המסנן בצורת המשפך לחלק התחתון של הצינור כך שהוא שקוע בחיץ מדגם Laemmli.
- מיצוי חלבון מלא על ידי הרתחת הצינורות למשך 4 דקות. הסר את המסנן באמצעות מלקחיים כדי למקם אותו הפוך לתוך החלק העליון של הצינור וביצוע ספין קצר (2,000 XG במשך 15 שניות). מחק את המסננים המיובשים.
- לפתור 10 μl של הכנת חלבון אקסון ב- SDS ואחריו כתם מערבי כדי לזהות את החלבונים של עניין.
הערה: כהתייחסות, הכנת אקסון מ20 explants גדל במשך 2 ימים וlysed מריפה 100 μl תמוגה חיץ יהיה ריכוז חלבון של 4-6מיקרוגרם / μl.
7. בחינת Immunofluorescence של האקסונים על מסננים
השלבים הבאים מתארים את המניפולציות הכלליות לבצע אם מכתים על מוסיף מסנן, שהודגם על ידי זיהוי של β-III-טובולין. מקבע, פעמים דגירה, ריכוזים ופרטים אחרים צריכים להיות מותאמים לזוגות אנטיגן נוגדן אחרים.
- לנצל צלחות השתמשו בעבר 6 היטב, לנקות ביסודיות, לשוטף וincubations הבאים של מוסיף.
- בקצרה לשטוף מוסיף ב-PBS. לתקן אותם בparaformaldehyde 4% מוכנים טרי בPBS 10 דקות ב RT על שייקר.
- לאחר קיבוע, לגרד ולנקות את הצד העליון של הכנס כדי לאסוף את האקסונים שגדלו אך ורק על המשטח התחתון של המסנן. להמשיך עם incubations הסטנדרטי עבור IF.
- דגירה מוסיף בחסימת פתרון (TBS, 0.05% Tween 20, 5% חלב דל שומן), תוך שימוש באמצעי אחסון רגיל, עבור שעה 1 ב RT עם רעד עדין.
- העברה מוסיפה לנוגדן ראשוני המדולל בחסימת מאגר (אנטי β-III-טובולין, 1:5,000), תוך שימוש באמצעי אחסון סטנדרטי. דגירה O / N (~ 18 hr) על 4 מעלות צלזיוס עם רעד עדין.
- שטוף את הנוגדן הראשון פעמים PBS (2 X 10 דקות ב RT).
- העברה מוסיפה לנוגדנים משני ניאון מצומדות בדילול מלא בחסימת מאגר (עז אנטי עכבר, 1:2,000), תוך שימוש באמצעי אחסון סטנדרטי. דגירה מכוסות מאור לשעה 2 ב RT עם רעד עדין.
- שטוף את 3x משני הנוגדנים ב-PBS (3 x 10 דקות ב RT).
- לאחר IF הוא מוחלט, לקחת הכניסו החוצה, לשפוך משם PBS מהשטיפה האחרונה ולנקות את הצד העליון של המסנן עם המוליך כותנה קצה. לשאוב כל נוזל מהצדדים העליונים ותחתונים.
- מקום להכניס הפוך על ספסל, ולחתוך את המסנן מלהכניס את עם אזמל חד.
- החזק את המסנן עם מלקחיים, חסרון למעלה, ומניח בשקופית מיקרוסקופ. שכבה עם coverslip וmou ניאון תואםתקשורת nting. בואו שטוח יבש בחדר קר, מכוסה מן האור. לבחון וללכוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: כאשר מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור, יכולות להיות כל הזמן הכנות אלה במשך שבועות עם הפסד מינימאלי של הקרינה. - אופציונלי: לחלופין, יכול להתבצע אם על מסננים שהוצאו מהכנס. כדי לעשות זאת, לגרד ולנקות את הצד העליון של המסננים ישירות לאחר קיבוע.
- קח מסנן מתוך מוסיף עם מסנני אזמל ומקום האקסונים-up חד בתחתית צלחת שש היטב.
- לאחר מכן, לבצע incubations כי אם כפי שצוין ב7.4-7.8 ו7.11. היתרון של חלופה זו הוא שזה חוסך חומרים כימיים, שכן, למשל, כרכי דגירה יכולים לרדת ל500 μl (בהשוואה ל 3 מיליליטר משמש כאשר מסננים מוכתמים ישירות על מוסיף כפי שמוצגים ב7.1-7.11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
explants גנגליון שורש הגבי מעכברי E13.5 לגדול בהרחבה על מסננים ברצף מצופה פולי-D-ליזין, laminin וקולגן (איור 1 ב, משמאל), והגיע עד 2 מ"מ בתוך 2 ימים בתרבות. שילוב מצע זה מניב צמיחה במיוחד שופעת; שילובים אחרים יניבו אקסונים שהם הרבה יותר קצרים (איור 1 ב, מימין). יתר על כן, DRGs שמר על מסננים להאריך יותר וארוכים יותר מאשר האקסונים DRGs גדל על 1C איור פלסטיק.
מסננים עם נקבוביות של 1 מיקרומטר בקוטר, שימוש בפרוטוקול זה, לשמור על גופי תא בצדו העליון של המסנן, תוך מתן האפשרות לגדול neurites הדרך הנקבוביות ולהרחיב על המשטח התחתון. זה מוצג בצורה ברורה על ידי מיקרוסקופ epifluorescence של מסננים מוכתמים עבור גרעינים (DAPI) וβ-III-טובולין 1D איור. במסננים בשלמותה ניתן להתבונן גרעין תא, שניהם מתא עצב ושאינותאים עצביים, מרוכזים במרכז explant וכמה הקרנה ממנו. עם זאת, כאשר הצד העליון של המסנן מגורד, גרעינים נעלמו ורק ניתן לאתרם אקסונים, בצד התחתון המסננים.
איור 1E מראה דוגמא של חלק תחתון של מסנן שבמקור שספג את הצמיחה של כ 17 explants. בדוגמא זו, בצד העליון נוקה לפני הקיבעון ולכן אות immunofluorescent מייצגת אקסונים טהורים בצד התחתון של המסנן. הפקת חלבון מהכנות אקסון (בצד תחתון של המסנן) הן נטולות חלבונים גרעיניים איור 1F, הוכחת כי ההכנה היא חופשית של גופי תא. לחלופין, כאשר עובדים עם מיצוי RNA, ניתן לאשר את טוהר הכנת אקסון ידי השוואת נוכחות mRNAs מקומי באופן דיפרנציאלי (כלומר γ-אקטין) בין lysates כל התא והכנות אקסון (כפי שמוצג על ידי אחרים 5
גיזום ההתפתחותי של תאי עצב תחושתיים יכול להיות מודל במסנני נתונים לקיפוח גורם תזונתי. אחרי 2-3 ימים של סיומת האקסון בנוכחות NGF, התקשורת השתנתה לאחד חסר NGF ומכיל נוגדנים נגד NGF שיהיה לעקל את כל איור 2 א שנותר NGF. בנקודות הזמן הרצויות, מסננים מעובדים לביוכימיה או immunocytochemistry.
איור 2 מציג דוגמאות טיפוסיות של צדדים תחתון של מסננים מוכתמים עבור β-III-טובולין לפני ואחרי הקיפוח. לאחר 12 שעות של קיפוח יש פיצול אקסון קטן, למרות שחלקם אקסונים להתחיל להראות אגלים. עם זאת, ניוון אקסון נרחב הושג לאחר 36 של קיפוח.
ניוון Wallerian הנגרם על ידי חיתוך רוחב האקסון של עצב סנסורי הוא מודל בקלות בexplants גדל על מסננים על ידי גירוד בצד העליון של המסנן, והותיר אחרי פו דיסטליrtion של אקסונים שגדלו בצד התחתון של איור 3 א מסנן. איור 3 מציג דוגמאות טיפוסיות של צדדים תחתון של מסננים מוכתמים עבור β-III-טובולין לפני ואחרי axotomy במסנן. ב -3 שעות לאחר axotomy, יש פיצול קטן, למרות שחלקם אקסונים להתחיל להראות אגלים. ב -7.5 שעה, רוב האקסונים מקוטעים או נעלמו לחלוטין. טיפול מקדים של explants עם dinucleotide אדנין nicotinamide (NAD +, 5 מ"מ, 30 מקדים דקות) מגן מפני ניוון Wallerian המושרה על מסננים, כפי שהיא עושה באחרת במבחנה במודלי vivo 19.
איור 1. מוסיף סינון לייצר כמויות גדולות של הכנות אקסון טהורות. א) סכימה של הכנס (א), בכנס בבאר (ב) ותצורה סופית עם explants DRG (ג). ב ') הציפוי הרציף של מסננים עם תוצאות פולי-D-ליזין, laminin וקולגן בexplants שגדלים יותר ויותר אקסונים בהשוואה לאלו גדלו עם פולי-D-ליזין לבד או פולי-D -ליזין וקולגן. התמונות הופקו על ידי ריצוף תמונות באמצעות תוכנת הדמיה. C) תחת תנאי ציפוי המצע זהים חופפות, ההגדלה נמוכה, explants DRG שמר על מסננים להראות צמיחת אקסון הרבה יותר שופעת מ explants גדל על פלסטיק. ד) הכנת אקסון מתקבלת על ידי גירוד הצד העליון של המסנן הוא נטול גרעין תא) דוגמא. E של אקסונים שמקורו בכ 17 explants וגדלו בצד התחתון של מסנן 24 מ"מ. ככל 30 explants יכול לגדול בקלות בהכנות אלה, מניב חומרי אקסון מספיק לגישות ביוכימי משותפות. Immunoblots F) של lysates coll ected מצמרות מסנן לעומת תחתית להוכיח כי H3 היסטון, סמן גרעיני, מוגבל לצמרות המסנן. סך הכל תכולת החלבון הייתה מנורמל על פני המדגמים השונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. המחקר של ניוון אקסון הנגרם על ידי נסיגת גורם תזונתית במוסיף מסנן. א) סכימה המתווה ניסוי NGF-קיפוח טיפוסי. explants DRG לגדול אקסונים רבים בנוכחותם של NGF, ומנוון על NGF קיפוח. ב ') נציג תמונות בהגדלה שונה (5X ו20X יעדים) של הכנות אקסון מexplants נשמר בNGF או נשלל NGF לשעתי 12 או 36."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. המחקר של ניוון אקסון Wallerian הנגרם על ידי חיתוך רוחב אקסון במוסיף מסנן. א) סכימה המתווה ניסוי axotomy טיפוסי. ניתוק אקסון מושגת על ידי גירוד בצד העליון של המסנן, והשאיר את האקסונים נותקו (נטולי גופי תא) בצד התחתון. ב ') נציג תמונות של הכנות אקסון מexplants ללא פגע או אחרי 3 או 7.5 שעות לאחר חיתוך רוחב בנוכחות או עדר של 5 מ"מ של NAD +. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרמטרים חשובים לקחת בחשבון בעת התאמת טכניקה זו כוללים את האוכלוסייה העצבית שתילמד, מצע, גודל נקבובית של המסנן ועל פני שטח. כל הפרמטרים הללו ישפיעו על הספציפיות, איכות וכמות של הכנת neurite שהושגה, ויש לשקול בזהירות על ידי משתמש הקצה. בדוגמאות שהוצגו בפרוטוקול זה, השימוש בנוירונים DRG יש את היתרון של הארכת אקסונים בלבד, ובכך נותנת הכנה (ספציפית) טהורה אקסון.
צמיחת אקסון של DRGs העוברי לעומת מהר מאוד לנוירונים ממערכת העצבים המרכזיות, המאפשרת דגימות אקסון להיות מוכנות רק לאחר 2 ימים בתרבות. הגודל הנקבובית של 1 מיקרומטר הוכיח קטן מספיק כדי למנוע מגופי תא נודדים למשטח התחתון ובמקביל לאפשר מעבר יעיל של האקסונים הולך וגדל. בהשוואה לגדלים זמינים קטנים יותר (כלומר 0.4 מיקרומטר) זה לא לכפות את הסלקטיביות לדק אקסונים. לצורך המחקר של explants DRG, להכניס 24 מ"מ המסנן (לשימוש ב6 צלחות בארות) מייצר כמויות מספיקות של מדגם חלבון אקסון עבור רוב הטכניקות, כולל immunoprecipitation, אשר לעתים קרובות דורשת כמות גדולה של חלבון קלט. עם זאת, בגדלים קטנים יותר (כלומר מוסיף מסנן ל12 גם צלחות) מתאימים ליישומים מסוימים, במיוחד אם משתמש בתאים ו / או immunocytochemistry ניתקו.
למרות שהוספת המסנן ביעילות מבודדת neurites מגופי תא לבדיקה, חשוב לציין כי גם התאים חולקים את אותה תקשורת ותרבות, להגביל את המניפולציות ניסיוני לטיפולים כל התא. גישות אחרות בידוד, כוללים תאי Campenot ממודרים או תאי microfluidic, מאפשרות לטיפול בהפרש של התאים השונים. הנסיין חייב לקבוע אילו טכניקות בידוד תא תא אלה הוא מתאים ביותר לעיצוב הניסיון הספציפי משלהם.
= "Jove_content"> שיטות אלטרנטיבי ילדה להשיג דגימות אקסון טהורות כוללות מערכות ממודרות תרבות כמו תאי Campenot או מכשירי microfluidic או הסרת ידנית מרכז explant (המכיל גופי תא עצביים). הגישות ממודרות לספק רק כמויות קטנות של חומר באקסון. השימוש בם דורש הכשרה משמעותית, כמו גם התקנים מיוחדים, והם גוזלים זמן. מצד השני, הסרת מרכז explant להשיג דגימות אקסון מועשרת אינם מעשי, דורשת מומחיות ומוגבלת לאוכלוסיות נוירונים שניתן לגדל כexplants. לעומת זאת, בשיטה המוצגת כאן מייצרת הכנות אקסון שופעים וטהורות, היא מהיר ואינה דורשת הכשרה מקיפה. בראש ובראשונה, זה גם יכול להתבצע עם נוירונים ניתק.
כמובן, את יכולת הבידוד של מוסיף מסנן יכולה להיות יתרון מעבר לניוון עצב. לדוגמא, ביוכימיה של התחדשות קונוסים צמיחה יכולה להיות בקלותלמד על ידי גירוד בצד התחתון של מסננים עם explants DRG המבוגר. בתוך שעות, הנוירונים DRG axotomized יהיו להתחדש קונוסים צמיחה בצד התחתון של המסננים כי, כפי שתואר בפרוטוקול זה, אז יכול להיות מבודד לטיהור התחדשות חלבונים חרוטים צמיחה. יתר על כן, דגימות אקסון מתקבלות על ידי שיטה זו יכולה להיות מנותחת על ידי שיטות ביוכימיות אחרות מאשר מערבי סופג. לדוגמא, ניתן lysed אקסונים במאגרי תמוגה ריפה או בחורים כדי להשיג מדגם חלבון זה יכול להיות חשוף יותר לimmunoprecipitation או ניסויים הנפתח 9. לחלופין, יכולות להיות מעובד דגימות אקסון להפקת RNA, כפי שתוארו בעבר 5.
היתרון של מערכת התרבות שהוצגה אינו מוגבל לתאי עצב תחושתיים. לדוגמא, תאי עצב בקליפת המוח ירחיבו דנדריטים ואקסונים שיהוו סינפסות בצד התחתון של המסנן 7. לפיכך, דגימות טהורות neurite (מועשרים בסינפסות) ניתן בידוד עאד מגופי תא לניתוחים ביוכימיים מפורטים של תהליכים המתרחשים באופן בלעדי בסינפסות. השימוש בטכניקה זו הוא פשוט ואין לה שלבים קריטיים יוצא מן הכלל. עם זאת, אורך אקסון ומורפולוגיה הוא די רגיש לאיכות הציפוי של המסננים. לפיכך, יש להקפיד להשתמש בפתרוני ציפוי טריים והומוגני לסכומים שצוינו בזמן כדי להשיג דגימות אקסון חזקות ועקביות. השימוש הנרחב בטכניקה זו תסייע לקדם את הידע של הפיסיולוגיה של האקסונים שלנו, בנסיבות רגילות ובמחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
