Introduction
Аксонов отсек нейронов показывает большую степень функциональной независимости от сомато-дендритных отсека. В проекционных нейронов, аксоны содержат большую часть нейронов 1,2 белка. Изучение физиологии и патофизиологии аксонов набрало обороты в неврологии сообщества, потому что недавние исследования показали, что раннее аксонов дисфункция, кажется, общая черта нейродегенеративных заболеваний и нервно-психических расстройств 3. Вполне вероятно, что лучшее понимание аксонов эксклюзивные механизмов при нормальных и патологических условиях прольет свет на ранних событий, которые ведут дисфункции.
Настоящий протокол описывает, как использовать культуру вставки подшипника пористую мембрану (фильтр), чтобы получить большие количества чистого аксонов материала, который подходит для биохимических и иммуноцитохимическая анализирует. Использование фильтра вставляет учиться аксонов биология была впервые реализована на Стюард иколлеги 4 и далее, разработанные Twiss и коллег 5 к ее нынешней конфигурации. Техника находится сейчас в текущей использования групп, изучающих различные аспекты аксонов и дендритов биологии, с небольшими изменениями в каждом конкретном случае для размещения для населения нейронов исследованных, лечение, выполняемые и тип биохимических анализов используется 6-9. Настоящий Протокол не намерен разместить всех альтернатив для такого разнообразия приложений, а скорее обеспечить простой подход, который подходит для большинства приложений. В частности, протокол, описанный здесь использует тройную покрытие, которое максимизирует аксонов выход для биохимических анализов и наиболее подходит для изучения дегенерация аксонов-другой покрытий, описанных в литературе производится меньше аксоны, что убираться и вырождающиеся быстрее, когда лишены трофических факторов 9.
В этой процедуре, нейронные органы клеток остаются изолированными на вершине Wh фильтровИль аксоны проходят через поры и расти вдоль его нижней поверхности. Чистые аксоны (свободные глии и нейронов загрязнений тела клетки), которые растут на нижней поверхности фильтра могут быть собраны для биохимических анализов или могут быть зафиксированы на месте и рассмотрены иммуноцитохимических методов 9. Процедура основана на использовании эмбриональных сенсорных нейронов из спинного ганглиев (DRG). Эмбриональные DRGs широко используются для изучения аксонов биологии, потому что нейритов из этих клеток претерпевают быстрый и устойчивый рост в пробирке, когда поддерживается в фактор роста нервов (NGF), а потому что они быстро дегенерируют когда лишены этого фактора. Кроме того, DRG нейроны не имеют дендриты, так что все невриты, собранные с помощью этого метода являются чисто аксоны.
Фильтровать вставки представляют большое преимущество по сравнению с другими подходами, используемыми для изучения аксоны. Исследования, основанные на принципе использования микроскопии дифференцировать процессы, происходящие в клетке сомы из тех, кто вXons обеспечивают ограниченную биохимический информацию. В качестве другого примера, узконаправленных систем культуры (например, Campenot камеры 10 или микрожидкостных устройств 11) полезны для подходов изображений и дифференцированного режима клеточных отсеках, но обеспечивают лишь небольшое количество аксонов материала, исключая применение этих методов для биохимических анализов, которые требуют относительно большие количества образца. Кроме того, их использование требует значительной подготовки, а также специализированные устройства, и они занимают много времени. Другой подход часто используется для изоляции аксонов от эксплантов является вручную удалить эксплантате центр (содержащий нейронные тела клетки) перед аксонов сбора проб. Хотя это может производить большое количество аксонов обогащенный препаратов, аксоны в этом препарате может быть, завернутые в глии и быстрого удаления тела 20 эксплантатов в последовательно от 6 скважин (в качестве примера минимального эксперимента) занимает много времени и на пределе возможности.
В противоположность этому, метод, представленный здесь производит обильные и чистые аксонов препараты, которые затем могут быть проанализированы с помощью практически любого биохимический метод, который обычно используется для анализа цельной клеточных лизатов, как вестерн-блоттинга, иммунопреципитации 6, Нозерн-блот-5 масс-спектрометрии 6, очистки РНК 7,12,13, среди других. Кроме того, протокол может быть применен к иммунофлюоресценции техники (If), как можно исправить аксоны, растущие в нижней стороне фильтра для дальнейшего изучения их IF. Такой подход значительно облегчает анализ аксонов конкретных процессов, так как нет клеточных тел в окончательной подготовки. Это значительное преимущество, так как высокая иммунофлуоресцентный сигнал от клеточных тел часто подрывает обследование и анализ более слабым сигналом, происходящих из тонких структур, таких как аксонов.
Два приложения метода культуры для изучения дегенерация аксонов арэ описано; модель обрезки развития и модели травмы-индуцированной дегенерации (обычно называют валлеровский дегенерации). Моделирование обрезки развития основана на том, что сенсорные нейроны в естественных условиях конкурировать для ограничения количества целевой полученных NGF и те не в состоянии получать достаточно нейротрофический поддержки вырожденный 14. Это явление можно имитировать в эмбриональных культурах DRG путем удаления NGF из культуральной среды, которая, как это происходит в естественных условиях, инициирует дегенерацию аксонов с последующим разрушением клеток тела. Для моделирования валлеровский дегенерации, верхняя сторона фильтра с клеточных тел разгреб. Аксоны, выросшие на нижней стороне фильтра стать физически отделен от клеточных тел и после этого пройти быструю и стереотипное дегенеративный процесс, известный как валлеровский дегенерации 15, имени А. Waller, которые впервые сообщили явление в 1850 году 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Канадского совета уходу за животными. Все усилия по минимизации боль и страдания животных во время выполнения процедур.
1. Покрытие Фильтры
Примечание: Когда культура фильтрующие элементы размещены в лунки мульти-луночных планшетах, два отсека определены: верхний отсек область над пластиной и нижний отсек один ниже вставки Рисунок 1A.ab. Эксплантаты высевают в верхнем отсеке, где они придают верхней стороне фильтра; многие аксоны расти через фильтр и продлить на нижней стороне фильтра, в нижний отсек Рисунок 1A.c. Стандартные рабочие объемы (то есть для нанесения раствора покрытия, моет, питательных сред, и т.д.) 2 мл на нижнее отделение и 1 мл для верха и будут говорится в протоколе как "; Стандартные объемы ". Добавить решения, начиная со нижний отсек, помещая наконечник пипетки в промежутке между вставкой и боковой скважины. Кроме того, наклон вставку в одну сторону в то время как введения раствора, чтобы предотвратить пузыри от захваченных на нижней части фильтра.
- Начните покрытия фильтры накануне обшивки. Под стерильной капот культуры ткани, поместите 24 мм фильтр вставки в 6-и принимающей пластины. Инкубируйте пластины с поли-D-лизина в воде (1 мг / мл) в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием стандартных томов: 2 мл в нижний отсек и 1 мл в верхней части.
- Аспирируйте поли-D-лизина и промыть один раз водой. Аспирируйте воды, закройте крышку и оставить тарелки сушить на капот O / N. Во время аспирации жидкостей, убедитесь, чтобы удалить остатки жидкости, которая попадает в ловушку прямо под фильтром.
- На следующее утро, разбавленные ламинин в воде (10 мкг / мл), перемешивают и тепло при 37 ° С Выдержите вставки с ЛАМИНИНА 1 час в челл-инкубатор при 37 ° С, с использованием стандартных объемов.
- Аспирируйте ламинин и коллаген добавить в воде (0,1 мг / мл) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В этом случае используют 2 мл на нижнем отсеке и 2 мл на верхнем отсеке.
- Аспирируйте коллагена и мыть один раз стерильной водой. Фильтры теперь готов к приему питательных сред и DRG эксплантов, как описано в пункте 3.
2. Пройдя Эмбриональные Спинной ганглий корень (DRG) Экспланты
- Обезболить 13-дневный беременной женщины мышь с помощью IP-инъекции Avertin (250 мг / кг). Подождите 10-15 минут и проверьте отсутствие роговицы и педали рефлексов отмены. После того, как рефлексы отсутствуют, выполните шейки дислокации.
- Лечить все хирургические инструменты и женский живот с 70% этанола. Разрешить инструменты, чтобы высохнуть. Держите кожу живота и прорезать кожи и мышечных слоев, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Удалить матку, отсоединив от шейки матки и яичников. В Steriле капот, удалить эмбрионов из матки с помощью ножниц и собирать их в чашку Петри, наполненную ледяной L15 СМИ. Держите на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. предыдущие технических отчетов для получения более подробной информации о том, как получить эмбрионы 13 дней беременности 17,18. - Под микроскопом, лежал зародыш на стороне и использовать небольшие весенние ножницы, чтобы удалить голову. Сделать надрез вдоль боковых сторон отказаться от груди, живот, конечности и хвост. Держите спину содержащий позвоночник, лежал брюшной стороной вверх и удалите все внутренних органов.
- При небольших весенних ножницами, разоблачить всю спинной мозг путем разрезания позвоночник от его вентральной стороне вдоль средней линии. Держите тушку вниз с одной парой щипцов (# 3) и использовать вторую пару провести спинной мозг на самом ростральной аспект.
- Медленно и осторожно потяните шнур вдали от позвоночного полости и отщипнуть ДРГ из спинного мозга с использованием ультра-тонкие щипцы (# 5). Группа в ДРГ должны быть собраны нав нижней части блюда.
- Сбор сгруппированных ДРГ путем аспирации с кончика пипетки 200 мкл, разрезанные чтобы увеличить ее открытие. Поместите ДРГ в трубке и выйти на лед, пока коллекция DRG не закончится.
ПРИМЕЧАНИЕ: белый / прозрачный советы являются предпочтительными, поскольку DRGs не прилипают к стенкам этот совет (по сравнению со стандартными желтых кончиков). Промывка советы со средствами массовой информации перед использованием дополнительно предотвращает ДРГ от прилипания к его стенам.
3. Посев и обслуживание ганглия дорсального корня эксплантов на Фильтры
- Добавить полную DRG СМИ при 37 ° С до покрытых вставок с использованием стандартных объемов. Дополнение нижнюю отсека СМИ с 15 нг / мл NGF, сохраняя верхнюю отсек ФРН-бесплатно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, ФРН эффективно рассеивает на фильтре и его концентрация в равновесие в течение нескольких часов, мы наблюдали, что применение NGF в нижний отсек непосредственно перед посевом значительно увеличивает аксонов выход на бottom поверхности фильтра. - Перенесите ДРГ из трубки к фильтрам с использованием 1000 мкл пипетки с наконечником подстриженной чтобы увеличить ее открытие.
- Нарисуйте носитель в Совет 2-3x перед сбором ДРГ. Это предотвращает их от прилипания к внутренней стороне наконечника. То же наконечник может быть повторно использован для всех скважин. Использование неокрашенных советы (против стандартных синих советы) снижает DRG прилипания к поверхности наконечника.
- Для передачи ДРГ, установите пипетки на 800 мкл. Аспирируйте около 200 мкл СМИ от верхней стороне фильтра, а затем перейти к DRG содержащих трубки и пипетки небольшой объем вверх и вниз - для ресуспендирования ДРГ, которые опустились на дно. Аспирируйте весь объем и пипеток ДРГ погружение наконечника в середине пластины.
- После того, как все вставки загружены, закройте крышку пластины и вихрем тарелку 10x, нажав на него мягко на капот скамейке между каждым водоворот. Эти движения увеличить аксонов выход, помогая DRG эксплантов раковиной иприкрепить к фильтру. Это также помогает распределить равномерно эксплантов так что аксоны из различных эксплантов не перекрываются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура посева эксплант описано в предыдущих шагах значительно увеличивает общую скорость привязанности эксплантата к подложке (до 75%). Наиболее важно, процедура пипетирования легко предотвращает эксплантов с плавающей на поверхности среды вместо опускаясь на дно вставки. - Для биохимических анализов, семена ДРГ из одного эмбриона (около 30) на фильтр. Для морфологического анализа, использовать либо половину или треть ДРГ из одного эмбриона (10-15). Это решение должно быть принято перед сбором ДРГ в пробирки, так что все ДРГ из трубки высевают в одной скважины (будь то 30, 15 или 10 ДРГ).
- Поддержание культуры в клетке-инкубаторе при 37 ° С, изменение среды каждые 2-3 дня. Чтобы изменить носитель, аспирация верхний отсек первым, а затем нижний отсек. Добавить свежие СМИ в стандартном объемеы начиная с нижнего отсека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения клеток / аксоны от высыхания, не меняют средства массовой информации в более чем 3 вставками в то же время. DRGs, выращенные на фильтрах в присутствии NGF продлит длинные аксоны, идущие до 2 мм после 2 дней в культуре.
4. Трофический фактор Снятие Лечение
ФРН вывод вызывает дегенерацию аксонов с аксонов фрагментации (определяется фазового контраста и β-III-тубулина ИФ), что сначала появляется около 12 часа после выхода. Полное фрагментация достигается на 36 часа. Как долго дегенерация оставляют протекать в течение должен быть выбран конечным пользователем в соответствии с экспериментальной конструкции.
- После 2-дневного аксонов фазе расширения, изменить носитель из верхней и нижней отсеками для СМИ, что не хватает NGF и содержит анти-NGF антител (1 мкг / мл), чтобы изолировать все оставшиеся (или эндогенно производится) NGF.
- Вернуться пластины клеток инкубатор (37 ° C), чтобы позволитьNGF вывод-индуцированной дегенерации протекать в течение желаемого промежутка времени.
- Далее к экстракции белка (шаг 6) для исследования методом вестерн-блоттинга или непосредственно изучать фильтры по ПЧ (этап 7).
5. Аксонов Перерезка, чтобы побудить валлеровский дегенерации
Эта процедура выходит аксоны на нижней стороне фильтра, отделенной от их тела клетки, но в остальном без изменений. После этого, эти аксоны быстро начать валлеровский вырождение. Аксонов фрагментация (о чем свидетельствует фазового контраста или β-III-тубулина ИФ) впервые появляется на 3 часа после перерезки; на 9 часов, аксоны полностью фрагментированы и отдельно от фильтра. Как долго дегенерация оставляют протекать в течение должен быть выбран конечным пользователем в соответствии с экспериментальной конструкции.
- Собрать верхнюю сторону фильтра, содержащий выращенные DRG эксплантов, с сотовым-скребка. Убедитесь, полное удаление верхнего материала, перемещая скребок в X-, Y-и круговойнаправлениях.
- Отменить носитель из верхнего отсека, содержащего плавающие эксплантатов, которые были соскабливают с фильтра и заменить 1 мл подогретого, полное DRG среде, содержащей ФРН (10 нг / мл).
- Возврат к клетке пластину инкубатора (37 ° С), чтобы позволить валлеровский дегенерация протекать в течение от количества времени, выбранного конечного пользователя.
- Далее к экстракции белка (шаг 6) для исследования методом вестерн-блоттинга или непосредственно изучать фильтры по ПЧ (этап 7).
6. Белок Добыча аксонов образцов
- Заполните трубки сбора (1,5 мл) с 75 мкл буфера Лэммли образца. Держите пробирки на лед при уборке аксоны из всего набора фильтров.
- Промыть фильтр DRG эксплантов в PBS и очистить верхнюю сторону фильтра. Выньте вставку из пластины, чистки верхней стороне фильтра с хлопка наконечником аппликатором и аспирации каких-либо дополнительных PBS с верхней и нижней сторон.
- Наведите вставки потенциал ростана верстак и сократить фильтр из изолятора, используя острый скальпель. Держите фильтр пинцетом, снизу вверх. Сделать разрез от окружности к центру фильтра с ножницами.
- Место фильтр в верхней части пробирку, и щипцами, нажмите на центр фильтра вниз трубы. При этом, воронка должна стать. Нажмите воронкообразную фильтра к нижней части трубы так, что он погружен в буфере выборок Лэммли.
- Полный экстракции белка путем кипячения трубки в течение 4 мин. Извлеките фильтр с помощью пинцета, чтобы поместить его вверх-вниз в верхней части трубки и выполнения краткого спин (2000 х г в течение 15 сек). Откажитесь от сухих фильтров.
- Устранение 10 мкл аксонов белкового препарата в SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга для обнаружения белков, представляющих интерес.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве эталона, аксонов препарат из 20 эксплантов, выращенных в течение 2 дней и лизированных в 100 мкл RIPA буфера для лизиса будет иметь концентрацию белка 4-6мкг / мкл.
7. Иммунофлуоресценции Экспертиза Аксоны на Фильтры
Следующие шаги описаны основные манипуляции для выполнения ЕСЛИ окрашивания на фильтрующих вставок, на примере обнаружения β-III-тубулина. Фиксирующий, инкубационные времена, концентрации и другие данные должны быть оптимизированы для других антиген-антитело пар.
- Использование ранее используемые тарелки 6-а, тщательно очистить, для следующих моет и инкубации вставок.
- Кратко мыть вставки в PBS. Исправить их в свежеприготовленного 4% параформальдегида в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере.
- После фиксации очистить и убрать верхнюю сторону пластины для сбора аксоны, которые росли исключительно на нижней поверхности фильтра. Продолжайте стандартных инкубации для IF.
- Инкубировать вставки в блокирующем растворе (TBS, 0,05% Tween 20, 5% обезжиренное молоко), с использованием стандартных объемов, в течение 1 часа при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
- Передача вставляет к первичным антителом, разведенным в блокирующем буфере (анти-β-III-тубулина, 1:5000), с использованием стандартных объемов. Инкубировать O / N (~ 18 ч) при 4 ° С при осторожном встряхивании.
- Промыть первое антитело дважды в PBS (2 х 10 мин при комнатной температуре).
- Передача вставляет в люминесцентных конъюгированного с вторичными антителами разбавленных в блокирующем буфере (козий анти-мышь, 1:2000), с использованием стандартных объемов. Инкубировать покрыты от света в течение 2 ч при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
- Промыть 3 раза вторичного антитела в PBS (3 × 10 мин при комнатной температуре).
- После ЕСЛИ завершена, принять вставить вне, вылить PBS от последней промывки и чистки верхней стороне фильтра с хлопка наконечником аппликатором. Аспирируйте любую жидкость из верхней и нижней сторон.
- Место вставить в обратном порядке на скамейке, и сократить фильтр из изолятора с острым скальпелем.
- Держите фильтр пинцетом, недостаток, и разместить на микроскопии слайда. Наложение с покровным и люминесцентные-совместимый муnting СМИ. Дайте высохнуть квартиру в холодной комнате, покрытый от света. Осмотрите и захвата изображений с помощью флуоресцентного микроскопа.
Примечание: при хранении при 4 ° С в защищенном от света, эти препараты могут быть сохранены в течение нескольких недель с минимальной потерей флуоресценции. - ВАРИАНТ: Альтернативно, если может быть выполнена на фильтрах, которые были удалены из вкладыша. Чтобы сделать это, скрести и чистить верхнюю сторону фильтров непосредственно после фиксации.
- Возьмем фильтры из вставок с острым скальпелем и место фильтров аксонов планом на дне шесть-луночного планшета.
- После этого, выполните инкубации для IF, как указано в 7,4-7,8 и 7,11. Преимущество этого варианта является то, что она сохраняет реагенты, так как, например, объемы инкубации может опускаться до 500 мкл (по сравнению с 3 мл используемых при фильтров непосредственно на окрашенных вставками, как показано на 7.1-7.11).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ганглиев дорзальных корешков эксплантаты от мышей E13.5 расти экстенсивно на фильтрах с покрытием последовательно поли-D-лизина, ламинин и коллаген (фиг.1В, слева), достигая до 2 мм в течение 2 дней в культуре. Это сочетание подложки дает особенно буйный рост; другие комбинации дают аксоны, которые значительно короче (Фиг.1В, справа). Кроме того, ДРГ поддерживается на фильтрах расширить больше и дольше аксоны, чем ДРГ, выращенных на пластиковой фиг.1С.
Фильтры с порами 1 мкм в диаметре, используемого в этом протоколе, удерживать клеточных тел на верхней стороне фильтра, позволяя при этом нейритов расти через поры и продлить на нижней поверхности. Это отчетливо видно на эпифлуоресцентной микроскопии фильтров окрашенных ядер (DAPI) и β-III-тубулина рис 1D. В неповрежденных фильтров можно наблюдать клеточные ядра, как из нейронов и не-нервные клетки, сосредоточенные в эксплантата центра и некоторых облучения от него. Однако, когда верхняя сторона фильтра Царапины, ядра исчезли, и только аксоны могут быть обнаружены, на нижней стороне фильтров.
Рисунок 1E показывает пример дно фильтра, который первоначально устойчивого роста приблизительно 17 эксплантатов. В этом примере верхняя сторона была очищена перед фиксацией и, следовательно, сигнал иммунофлуоресцентного представляет собой чистый аксоны на нижней стороне фильтра. Экстракции белка из аксонов препаратов (Нижняя сторона фильтра) лишены ядерных белков Рисунок 1F, демонстрируя, что препарат содержит клеточных тел. Кроме того, при работе с выделения РНК, можно подтвердить чистоту аксонов подготовки путем сравнения присутствие дифференциально локализованных мРНК (т.е. γ-актин) между цельноклеточной клеточных лизатов и аксонов препаратов (как показано другими 5
Развивающие обрезка сенсорных нейронов могут быть смоделированы в фильтрах, подвергнутых трофической фактора депривации. После 2-3 дней расширением аксонов в присутствии ФРН, средства массовой информации изменяется на один недостаток NGF и содержащий анти-NGF антитело, которое будет поглощать все оставшиеся NGF Фигура 2А. На желаемых временных точках, фильтры обрабатываются для биохимии или иммуноцитохимии.
Рисунок 2B показывает типичные примеры нижней стороны фильтров, окрашенных для β-III-тубулина до и после лишения. После 12 часов лишения мало фрагментации аксонов, хотя некоторые аксоны начинают показывать бисером. Однако, обширные дегенерация аксонов достигается после 36 лишения.
Валлеровский дегенерация аксонов, индуцированный перерезки сенсорных нейронов легко смоделированы в эксплантатов, выращенных на фильтрах путем соскабливания верхнюю сторону фильтра, оставив дистального роrtion из аксонов, которые росли на нижней стороне фильтра фиг.3А. фиг.3В показаны типичные примеры нижней стороны фильтров для окрашенных β-III-тубулина до и после фильтра в-аксотомии. В 3 часа после аксотомии, мало фрагментации, хотя некоторые аксоны начинают показывать бисером. По 7,5 ч., большинство аксонов фрагментированы или полностью исчезли. Предварительная обработка эксплантов с никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD +, 5 мМ, 30 мин предварительной обработки) защищает от валлеровский дегенерации, индуцированной на фильтрах, как это происходит в другой в пробирке и в естественных условиях модели 19.
Рисунок 1. Фильтровать вставки образуется большое количество чистых аксонов препаратов. А) Схема вставки (а) вставку в скважине (б) иокончательной конфигурации с DRG эксплантов (с). б) последовательный покрытий из фильтров с поли-D-лизина, ламинин и коллаген приводит к эксплантов, что все более и более длинные аксоны сравнению с теми, выращенных с одним только поли-D-лизин или поли-D -лизина и коллагена. Изображения были получены путем плитки дублирования, с низким уровнем коэффициента увеличения изображений с использованием изображений программное обеспечение. C) В тех же условиях субстрат покрытия, DRG эксплантов поддерживается на фильтрах показывают значительно более буйный рост аксонов, чем эксплантов, выращенных на пластик. D) аксонов препарат, полученный путем соскоба верхняя сторона фильтра лишена клеточных ядер. Е) Пример аксонов, которые произошли из приблизительно 17 эксплантов и выращенных на нижней стороне 24 мм фильтр. Целых 30 экспланты легко расти в этих препаратах, уступая достаточно аксонов материал для общих биохимических подходов. F) Иммуноблоты из лизатов стричь ected с вершин фильтров по сравнению с дном продемонстрировать, что гистона H3, ядерный маркер, приурочен к вершинам фильтров. Общее содержание белка нормализовалась через различных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Исследование дегенерации аксонов индуцируется трофической фактора снятия в фильтрующих вставок. А) Схема изложением типичный эксперимент ФРН-лишение. DRG эксплантов расти обширные аксоны в присутствии ФРН и вырождаться на NGF лишений. B) представительства изображения на различных увеличениях (5x и 20x цели) из аксонов препаратов из эксплантов, эксплуатируемых в ФРН или лишенных NGF на 12 или 36 часов."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Исследование валлеровский дегенерации аксонов, вызванного аксонов перерезки фильтром вставками. А) Схема изложением типичный эксперимент аксотомии. Axon отделени достигается путем соскабливания верхнюю сторону фильтра, в результате чего отрезанные аксоны (лишенные клеточных тел) на нижней стороне. B) Типичные изображения аксонов препаратов из интактных эксплантатов или после 3 или 7,5 ч после рассечения в присутствии или в отсутствие из 5 мм NAD +. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важные параметры, которые следует учитывать при адаптации этой техники включают нейронов населения, которые будут изучены, субстрат, размер пор фильтра и площадь поверхности. Все эти параметры будут влиять на специфичность, качество и количество аксонов препарата, полученного, и, должно быть рассмотрено на конечного пользователя. В примерах, приведенных в данном протоколе, использование DRG нейроны имеет то преимущество, простирающийся только аксоны, что дает чистый (специфические) аксонов препарат.
Рост аксонов из эмбриональных DRG, очень быстро по сравнению с нейронами центральной нервной системы, что позволяет аксонов образцы должны быть подготовлены только после 2 дней в культуре. Размер пор 1 мкм, оказалось достаточно малым, чтобы предотвратить клеточных тел мигрировать в нижнюю поверхность, позволяя эффективное прохождение растущих аксонов. По сравнению с меньших размеров имеющихся (т.е. 0,4 мкм) не накладывает селективность для тонких аксонов.Для изучения DRG эксплантов, 24 мм патрон фильтра (для использования в 6-луночных планшетах) производит достаточное количество аксонов образца белка для большинства методов, в том числе иммунопреципитации, что часто требует большого количества входных белка. Тем не менее, небольшие размеры (т.е. фильтрующие элементы для 12-луночных планшетах) подходят для некоторых приложений, особенно при использовании разложенных клетки и / или иммуноцитохимии.
Хотя фильтрующий эффективно изолирует нейритов из клеточных тел для обследования, важно отметить, что оба отделения одни и те же питательные среды, ограничивая экспериментальные манипуляции на целых клеток обработок. Другие подходы изоляции, в том числе разобщенным камер Campenot или микрофлюидных камер, позволяют дифференциального лечения различных отсеков. Экспериментатор должен определить, какой из этих методов выделения клеток-купе является наиболее подходящим для их собственного особого экспериментального проектирования.
Конечно, способность изоляция фильтрующие элементы могут быть выгодно за дегенерации аксонов. Например, биохимия регенерации роста конусы могут быть легкоучился, очищая нижнюю часть фильтров с взрослыми эксплантатах DRG. В течение нескольких часов, аксотомизированных DRG нейроны будет восстанавливаться конусов роста в нижней стороне фильтров, которые, как описано в данном протоколе, затем может быть выделено для очистки регенерации роста конуса белки. Кроме того, аксонов образцы, полученные с помощью этого метода можно анализировать с помощью биохимических методов, отличных от вестерн-блоттинга. Например, аксоны могут быть лизируют в RIPA или CHAPS лизиса буферов с получением образца белка, который может быть дополнительно подвергают иммунопреципитации или выпадающих экспериментов 9. Кроме того, аксонов образцы могут быть обработаны для экстракции РНК, как описано ранее 5.
Преимущество системы культуры, представленного не ограничивается сенсорных нейронов. Например, корковые нейроны продлит дендритов и аксонов, которые образуют синапсы на нижней стороне фильтра 7. Таким образом, чистые образцы нейритов (обогащенные синапсов) могут быть изолированыред от клеточных тел для детальных биохимических анализов процессов, которые происходят исключительно в синапсах. Использование этой техники прост и не имеет выдающиеся критические шаги. Тем не менее, длина аксонов и морфология весьма чувствительна к качеству покрытия фильтров. Следовательно, необходимо позаботиться, чтобы использовать свежие и однородные решения покрытия для указанных количество времени, чтобы получить надежные и последовательные аксональные образцы. Широкое использование этой техники будет способствовать продвижению наших знаний о физиологии аксонов, при нормальных обстоятельствах и в болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
