Summary
C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.
Abstract
Bu protokol, biz gerekli malzemeleri mevcut, ve modifiye C yapmak için prosedür. E Legans Alışma ve Üreme medya (mCeHR). Ayrıca, C teşhir ve acclimatizing için adımlar E. yetiştirilen elegans sıvı ortam aksenik coli açıklanmaktadır. Aksenik C kullanmaktadır Son olarak, alt-deneyler elegans Bu işlemin yararlarını gösterir. C analiz ve tespit yeteneği elegans besin gereksinimi değişen heme konsantrasyonları ile aksenik sıvı ortamda N2 yabani tip solucanlar büyüyen tarafından izah edildi. Bu prosedür, solucan büyüme ve gelişme için optimal konsantrasyonunu belirlemek için ya da ilaç tedavilerinin toksikolojik etkisini saptamak için söz konusu besin ile çoğaltılabilir. Yabani tip solucanlar büyümesi üzerinde çeşitli heme konsantrasyonlarının etkisi niteliksel mikroskopik gözlem yoluyla ve t ölçülmesi ile tespit edilmiştirHer bir heme konsantrasyonda büyüme solucanlar O sayısı. Buna ek olarak, çeşitli besin konsantrasyonlarının etkisi, ilgi konusu besin değişikliklere yanıt floresan sensörler ifade solucan kullanılarak analiz edilebilir. Ayrıca, solucan, çok sayıda mikro-parçacık bombardımanı ile kolayca transgenik C. elegans üretimi için üretilmiştir.
Introduction
Toprak nematod, Caenorhabditis elegans, toksikoloji genetikten çok sayıda çalışmalarda kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu 1 mm boyutu, dört gün, yetiştirme kolaylığı, hızlı bir üretim süresi ve büyük döl numaralarının bir sonucu olarak, bu nematodlar genetik ve farmakolojik ekranlar, 1, 2, bir dizi olarak kullanılmıştır. Araştırmacılar omurgalı sistemlerinde muhafaza molekülleri ve yolları belirlemek için bu solucanın yararlanmak. Bu yollar hücre ölümü sinyalleri, yaşlanma ve metabolizma yolları ve sinir sistemini 3-6 arasındadır. Buna ek olarak, C şeffaflık elegans doğrudan gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonu analiz etmek görselleştirilebilir floresan protein muhabir kullanılarak transjenik nesil için izin verir.
Birçok çalışmada bu nematod nematod büyüme ortamı (NGM) plakalar kullanılarak, bir katı agar-bazlı bir yüzeye veya l kültürlenirJK monitörler kültürler bir besin kaynağı olarak 7,8 Escherichia coli ile tohumlandı. Bu bakteri gıda kaynakları tarafından ürünlerin sonuçların yorumlanmasını etkileyen bakteriyel müdahalesi ile biyokimyasal ve toksikoloji çalışmaları karıştırabilir. , C. Bu bileşik etkileri önlemek için, elegans bir besin kaynağı olarak bakteri yoksun olan bir aksenik sıvı ortam içinde kültive edilebilir. Bu medyayı kullanarak, başarılı birçok standart C için son derece senkronize solucan milyonlarca kültüre C. farklı olarak düzenlenen genlerin dahil olmak üzere, mikro-dizi analizi elegans protokolleri elegans heme farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve gen bombardımanı ile transgenik solucanlar üretimi. Bu ortam, kimyasal olarak tanımlanmış ve Dr Eric Clegg 9 formüle orijinal bir reçete modifiye edilir. Bu mCeHR medyayı kullanarak, başarılı heme homeostazda ilgili genleri tespit ettik, 10 (hrg ler) olarak heme duyarlı genlerin ifade yönelecekE ile ekim yapılmış olan NGM agar plakalar kullanmak normal büyüme koşullarında mümkün olmamıştır coli.
Bu protokolde C tanıtmak ve korumak için prosedürü tarif E. yetiştirilen elegans coli aksenik mCeHR ve transgenik C üretmek için solucan çok sayıda elde etmek için bu yöntem kullanmak mikro-parçacık bombardımanı kullanılarak elegans hatları. C beslenme gereksinimini belirlemek için aksenik medyayı kullanmanın yararını göstermektedir biz de mevcut çalışmalar elegans bir örnek olarak heme kullanılmıştır. Bu çalışmalar mCeHR medya kullanarak C arasındaki bir sayıda hızlı büyüme sağlar olduğunu göstermektedir solucan araştırmacılar tarafından kullanılan birçok downstream uygulamalar için elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Solucan Suşları
- C'yi elde elegans Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) için Bristol N2 ve vahşi tip suşu NGM plakalar üzerinde onları korumak E ile tohumlandı coli suşu OP50 7. Not: Transgenik solucan IQ6011 (Phrg-1 :: GFP), daha önce tarif edildiği gibi 11, kullanılan suşları üretilmiştir. IQ6011 yazara talep edilebilir.
Değiştirilmiş C 2. Hazırlanması elegans yerleşime ve Üreme Orta (mCeHR)
12 aşağıda tarif edildiği gibi mCeHR sıvı ortam hazırlayın. Bu aksenik sıvı medya solucanlar herhangi bir ek gıda kaynakları olmadan büyümeye olanak sağlar. Böyle bir laminer akış kaputu gibi kesinlikle steril koşullar kullanılarak aksenik sıvı medya ve aksenik solucanlar tüm manipülasyonları yürütmek.
- Bir bakkal ultra pastörize yağsız süt alın. Buzdolabında pro kullanınkanal değil, oda sıcaklığında bir ürün. MCeHR orta çizgi olarak agar plakaları Brain Heart İnfüzyonu (BHI) ile ilgili en süt kullanımı ve kısırlık kontrol etmek için, 30 ° C ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe önce. -80 ° C'de 50 ml steril tüpler ve saklamak için süt transfer
- Aşağıdaki bileşenlerin her hazırlamak ve düzen ve mCeHR 1 L hazırlanması için belirli bir miktarda (Tablo 1) içinde bir araya getirilir: 2 mM kolin diasit sitrat 10 mi, vitamin ve büyüme faktörü karışımı, 10 ml (Tablo 1B 'de tarif bakınız), 2.4 mM miyo-inositol, 10 ml, 10 ml 2 mM hemin klorür, deiyonize su 250 ml. 0.22 mikron filtre ünitesi sayesinde emme ve filtre uygulayın.
- Nükleik asit karışımı 20 ml (Tablo 1C'de tarifi), mineral karışımı, 100 ml (Tablo 1D'de tarifi), 170 mg / ml laktalbümin hidrolizat 20 ml, esansiyel amino asitler, 20 mi, gerekli olmayan amino 10 ml ekleme asitler, 450 mM KH 2 PO 4 20 ml,1.45 M D-glükoz, 1 M HEPES, 10 ml, sodyum tuzu, 250 ml deiyonize edilmiş su, 50 mi.
- Bileşenleri sterilize filtre emiş uygulayın. Filtreyi kaldırmak ve 5 mg / ml kolesterol 1 ml ekleyin. Ortamın pH değeri yaklaşık olarak 6-6.5 olduğundan emin olun. Not: Bu çözelti, bir yıla kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Kullanmadan önce mCeHR ortamına% 20 (v / v) organik ultra pastörize kaymağı alınmış süt ekleyin. Süt açma ve aliquoting zaman (bir laminar akış başlığı içinde örneğin) titizlikle steril tekniği kullanarak. 4 ° C'de saklayın Ortamı
3.. C'yi hazırlayın aksenik mCeHR Sıvı Ortamda Kültür elegans
- Birçok gebe solucanlar ve OP50 E. az miktarda vardır kadar on 60 mm NGM plakalar üzerinde solucanlar büyütün plakalar üzerinde coli.
- M9 tampon maddesi (Tablo 1F'de tarifi), 5 ml ile durulanarak, her plakadan solucanlar çıkarın ve 50 ml konik bir tüp içinde bir araya getirir.
- S solucanlar izinettle 5-10 dakika için beklemeye tüp bırakarak daha sonra dikkatli bir şekilde E. içeren süpernatant kaldırmak coli.
- Tekrar prosedürü devam etmeden önce mümkün olduğunca artık bakteri kadar çıkarmak için 3.2 ve 3.3 2x adımları.
- , Üç katı olan bir hacim içinde 0.1 N NaCI içinde yeniden süspanse solucanlar, örneğin 1.5 ml, 3 ml ya da 6 ml olan tek tek solucanlar tüp görülebilir.
- 5 N NaOH ve% 5 sodyum hipoklorit, sonsuz süspansiyona bir 01:02:06 oranında (çamaşır suyu) çözeltisi ekleyerek solucanlar Bleach. Örneğin, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml% 5 sodyum hipoklorit: solucan süspansiyonu 6 ml. Solucan süspansiyonuna eklemeden önce NaOH ve ağartıcı karıştırın.
- Vortex çözelti kuvvetli bir şekilde gebe solucanlar çözülene kadar ve sadece yumurta süspansiyonu (yaklaşık 5-10 dakika) içinde görülebilir. 10X objektif ile bir faz kontrast mikroskop kullanılarak işlemi izler.
- Solucanlar tamamen çözüldükten sonra, pelet hemenyumurta 45 saniye boyunca 800 x g hızında, 4 ° C 'de Süpernatantı ve 4 ° C'de 45 saniye boyunca 800 x g 'de santrifüj ile topak, steril 10 ml su ile iki kez durulama pelet
- Ağartma sonra, 100 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen mCeHR ortam 10 ml içeren, 25 cm 2 doku kültürü şişesine yumurta pelet aktarın. Steril teknikleri kullanarak bu işlemi yürütmek. Arzu edildiği takdirde, aksenik sıvı kültürlerde bakteri gelişimini önlemek için 250 ug / ml nalidiksik asit de dahil olmak üzere, ilave antibiyotikler ekleyin.
- Yaklaşık 70 rpm bir çalkalama inkübatöründe 20 ° C'de, sıvı kültürleri inkübe edin.
- Gelişme aşamasına ve büyüme oranını dikkate günlük solucanlar edin.
Not: Worms başlangıçta yavaş büyür ve gebe olmak için 7 ila 10 gün gerektirir. Solucanlar sıvı ortama alışmak Ancak, nesil zaman vahşitip (N2) solucanlar için yaklaşık 4 gün düşecektir. - Solucanlar deve aldıktan sonrabir konik tüp solucan kültür aktarmak ve, salıncak kovalı bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de topak haline solucanlar, sıvı ortam içindeki sahne gebe miştir.
- Süpernatantı ve yavaşça 0.1 M NaCI eşit hacimde solucan pelletini. Örneğin, mCeHR 10 ml kültür solucanlar için 0.1 M NaCl 10 ml kullanımı. Solucanlar buz üzerinde 5 dakika boyunca yerleşmek için izin verin.
- 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma prosedürü uygulayın ve solucanlar aksenik sıvı ortam maddesi içinde bir ikinci nesil boyunca büyümeye izin verir. Gerekirse, bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için yeniden antibiyotik ekleyin.
- Yine bir senkronize bir popülasyonunun üretilmesi için adımlar 3,5-3,8 de tarif edildiği gibi yeniden ağartıcı, adımlar 3.12 ve 3.13 'te tarif edildiği gibi daha sonra 0.1 M NaCl içinde solucanlar ve pelet tekrar süspansiyon solucanlar gebe olmayı sağlar. Artık antibiyotik olmadan sıvı ortamda L1 larva solucanlar büyür.
Sıvı 4. Senkronizasyon WormsKültür
- Pellet ve adımlar 3.12 ve 3.13 de yukarıda tarif edildiği gibi, 0.1 M NaCl içinde solucanlar tekrar süspansiyon. 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma.
- M9 tampon, 10 ml yumurta pelletini ve larvalar döner platformlu sallayıcı üzerinde 20 ° C 'de O / N yumurtadan izin verir. Not: Yumurta L1 larva cünyır olacak, ama daha fazla geliştirmek değil, L1 aşamada solucanlar senkronize.
- Korumak ve alt kültür solucan, 5 dakika boyunca 800 x g'de topak L1 larvalarının, daha sonra 10 ml mCeHR ve bir 25 cm 2 şişesine transfer larvaları için tekrar süspansiyon. Solucanlar dönen bir platform üzerinde 20 ° C'de büyümeye izin verin. Solucanlar için yeterli beslenme sağlamak için 3.000 solucan / ml / cm 2 maksimum yoğunluğunu korumak.
Not: Bu aşamada, antibiyotikler işlemleri bir laminar akış başlığı içinde steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmektedir zaman aksenik koşullarını korumak için gerekli değildir. Worms büyümesini izlemek için her gün kontrol edilmelidir.
5. Bedavaaksenik Orta Kültürler kuvvet ve Çözülme Worms
- Aksenik asenkron solucan kültürleri veya sıvı azot içinde senkronize L1 larva dondurun. 5 dakika boyunca 800 x g Pellet solucanlar daha sonra her bir şişeye 0.5 ml 'si kullanılarak S tamponu (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCI) yeniden süspanse edin. Her bir şişeye,% 30 h / h gliserol, S tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve sıvı N2 içinde uzun süreli depolamadan önce -80 ° C'ye kadar solucanlar aktarın. Her bir şişe içinde, ml başına yaklaşık 1 x 10 6 solucanlar dondurun.
- Hemen hemen tüm buz eriyene kadar yaklaşık 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek şişe solucanlar çözülme. Bir laminar akış başlığı içinde, mCeHR içeren steril bir şişeye solucanlar transferi ve 20 ° C 'de koyun
6.. MCeHR Büyüme ve Üreme üzerine Hemin Konsantrasyon Etkisi belirleyin
- C arasında besin bağımlı büyüme analizi için mCeHR aksenik ortamı kullanın elegans. Etkisi o belirlemeksolucan büyüme ve gelişme üzerinde f hemini konsantrasyon, aksenik N2 solucan veya diğer ilgi suşları senkronize kullanın. Bölüm 4'te yukarıda tarif edildiği gibi L1 larvalarının senkronize.
- Ertesi gün, pelet ve senkronize L1 larvaları saymak ve aksenik medya ul başına 1 solucan sulandırmak üzerine. 0.3 M NH4 OH 10 mM hemin klorid yapın ve konsantre HCI kullanılarak pH 8'e ayarlanır.
- Bir 24-yuvalı plaka mCeHR medya 800 ul ekleyin. Ortam 100 ul her bir oyuğa 100 solucanlar ekleyin. 0 uM, 1.5 uM, üç kopya halinde 1.000 uM arasında değişen konsantrasyonlarda her bir göze hemin klorür ekleyin. Tüm çukurlar 0.3 M NH4 OH aynı konsantrasyonunu içeren emin olun. Yavaşça 100 L1 larvalarının her bir göze ilave emin olmak için pipetleme önce solucanlar yeniden süspansiyon haline getirildi.
- Günlük solucanlar inceleyin ve her bir konsantrasyonda her bir büyüme not edin. Inkübasyon 9 gün sonra solucanların sayısını ve her bir heme tekabül solucanlar / ml sayısını arsakonsantrasyonu, (Şekil 1).
Heme Sensör Worms Hemin Konsantrasyon 7. Etkisi
- 4 içeren mCeHR senkronize L1 heme sensörü solucanlar (Phrg-1 :: GFP) inkübe ilM, 8 uM, 10 uM ve 20 uM hemin.
- Floresan konfokal mikroskopi, 48 saat sonrası inkübasyon (Şekil 2) kullanılarak görüntü solucanlar.
8. Transgenik C oluşturmak için mCeHR kullanmak elegans mikropartikül bombardımanı ile
Not: Şekil 3 13'te gösterilmiştir üreten ve unc-119 (ED3) mCeHR yetiştirilen solucanlar kullanılarak mikro-parçacık bombardımanı gerçekleştirilmesi için prosedür.
- Solucan Hazırlık
- Bir 175 cm2 şişeye bir hafta önce bombardımanı için mCeHR ortam 90 ml, yaklaşık 1 x 10 6 uyumsuz unc-119 (ED3) solucanlar aktarın. Solucanlar 20 ° C o büyümeye izinna 70 rpm (Şekil 3-1) ~ at platformu sallayarak.
Not: Bir hafta sonra, solucan yoğunluk birçok yetişkin gebe solucanlar ile önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Yaklaşık 3 x 10 7 solucanlar mikropartikül bombardımanı için gerekli olacaktır. - Chill JM109 E. coli buz üzerinde 10 cm NGM plakaları seribaşı.
- Iki 50 ml konik tüplere aksenik solucanlar aktarın ve 2 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj solucanlar. Süpernatan aspire ve M9 tamponu (Şekil 3-2), 50 ml bir tüp içinde, her solucanlar tekrar süspansiyon.
- Büyütülmüştür buz üzerinde 10-15 dakika boyunca yerçekimi ile pelet izin verin.
Not: 2 ml Pelet şimdi>% 90 erişkin solucanlar içermelidir. Bu pelet 2 ml, yaklaşık 5 x 10 6 solucanlar ve bir mikropartikül bombardımanı için yeterli olmalıdır. - Coat soğutulmuş JM109 tüm yüzeyi solucanların 2 ml pelet NGM plaka tohumlandı. Tamamen emilecek sıvı daha sonra plaka terk Veren(Şekil 3-3) geçmeden önce, buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı.
- Bir 175 cm2 şişeye bir hafta önce bombardımanı için mCeHR ortam 90 ml, yaklaşık 1 x 10 6 uyumsuz unc-119 (ED3) solucanlar aktarın. Solucanlar 20 ° C o büyümeye izinna 70 rpm (Şekil 3-1) ~ at platformu sallayarak.
- Altın partikülleri hazırlanması
- Bir silikon mikrosantrifüj tüpüne altın partiküllerinin 30 mg tartılır. 1 ml% 70 etanol ekleyin ve 5 dakika için tüp vorteks.
- Tüp altın parçacıkları pelet 10 saniye boyunca 6000 x g'de santrifüj, ardından 15 dakika boyunca bekletin. Dikkatli bir altın parçacıklarına tüp ters tarafına ucu dokunarak bir pipet kullanarak süpernatantı.
- 1 dakika boyunca steril 1 ml su, girdap ile altın parçacıkları yıkayın ve kısa bir süre için 10 saniye boyunca 6000 x g'de santrifüj tüpü. Daha sonra steril% 50 gliserol, 0.5 ml altın parçacıkları tekrar süspansiyon, iki kez yıkama adımı tekrar edin.
Not: altın parçacıkları son konsantrasyonu, 60 mg / ml olacak ve 4 ° C sıcaklıkta 1-2 ay boyunca saklanabilir
- DNA-altın partikül karışım hazırlayın
- 10 ve istenilen plazmid DNA 10 ug birleştirin# 956, bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde unc-119 kurtarma plazmid g. DI su 50 ul ve de yeniden süspansiyon haline getirildi altın partikül çözelti daha sonra 1 dakika boyunca vorteks 100 ul ekle.
- 2.5 M CaCI2 150 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca çözelti yine vorteks. Bu çözeltiye, 3-5 dakika boyunca 0.1 M spermidin ve vorteks 60 ul ekle.
- Pulse 10 sn boyunca 6.000 xg'de çözümü santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 300 ul ekleyin. Vortex de 1 dakika boyunca, 6000 x g'de santrifüj puls,% 100 etanol içinde 170 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. Şiddetle 5 ila 10 dk sonra santrifüj nabız ve süpernatant kaldırmak için çözüm vorteks.
- Bombardıman (Şekil 3-3)
Not: Bu protokol, Malzeme / Ekipman Tablosunda belirtilen partikül teslim sistemi ile gerçekleştirilir. Mevcut parçacık teslim enstrüman için yönergeleri izleyin.- <li> 15 cm tabak içine doku bir kağıt yerleştirin. Cımbız kullanarak, ayrı ayrı% 100 etanol içine yedi macrocarriers daldırma ve kurumaya dokusu üzerinde onları yatıyordu.
- ,% 70 etanol ile biyolistik odası, makro-taşıyıcı tutucu, ve hedef plaka temizleyin. Temiz ve her bombardımanı işlem öncesi durdurma ekranları otoklav.
- Oturma aracını kullanarak tutucu içine cımbız ve basın kullanarak tutucuya macrocarrriers yükleyin.
- Eşit her bir makro taşıyıcı merkezinde DNA kaplı altın partiküllerinin 20 ul yayılır ve daha sonra çözelti, tamamen kurumaya bırakın.
- Etanol ile basınç bölücünün iki parçalarını temizleyin ve etanol temizlenmiş kopma diskler ile birleştirin. Bombardıman odasına monte basınç bölücü ve kopma diskleri vida.
- Macrocarrier sahibinin bir otoklava durdurma ekran birleştirin ve metal gerekli raf ve yerinde kilitlemek için aparat yerleştirin.
- Monte Macr kaydedinocarrier basınç altında ayrılmış bölücünün yuvasına biyolistik odasına cihaz ve basınç bölücü aynı hizaya gelir.
- Hedef plakası raf üzerine solucanlar ile açık NGM plaka bantla ve odasının kapısını kapatın.
- , Solucanlar bombardıman kopma diskleri kırmak için gerekli için basıncını ayarlamak için. , Hg basınç 28 inç vakum açın diskler delinmesine kadar sonra yangın düğmesine basın.
- Vakum bırakın ve aparattan NGM plaka çıkarın. Plakadan solucanlar yıkayın ve JM 109 E ile seribaşı yirmi 10 cm NGM plakaları yeniden dağıtma coli (Şekil 3-4).
- Solucanlar 25 ° C'de 10-14 gün boyunca büyümeye ve plakalar açlıktan izin verin. Unc-119 kusur kurtarıldı Worms normal hareketi olacak ve şu anda tespit edilebilir. Bu bağımsız transgenik satırları (Figür temsil olarak daha fazla analiz için ayrı levhalar en az 10 "Yabanitip" solucanlar almake 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C Kültürleme E. tarafından üretilen ikincil metabolit müdahalesi olmaksızın, solucan için gerekli olan besin belirlenmesinde aksenik sıvı ortam yardımcıları elegans coli. Yabanitip N2 solucanlar üç kuşak içinde mCeHR ortama alışmak ve NGM bakteriyel plakalar üzerinde yetiştirilen solucanlar karşılaştırılabilir büyüme göstermektedir. Nitekim, bu solucanlar OP50 bakteriler üzerinde yetiştirilen solucanlar için 3.5 gün ile karşılaştırıldığında 4 gün içinde gebe olur.
MCeHR kullanmanın bir avantajı, bu solucanlar 14 tesisinin ihtiyacı besin çalışmalarında incelenmiştir görülmüştür. Şekil 1 solucanlar mCeHR 1 mM'ye kadar, heme artan miktarları ile takviye büyütüldü. Bu solucanların L4 solucanları gözlemler larva aşamaya geliştirmek değil mCeHR içinde dokuz gün sonra gebe aşamasına ilerleme için mümkün olan, 4 uM altındaki konsantrasyonlarda heme büyümede belirgin bir gecikme gösterdi. 10 uM ve 20 konsantrasyonlarda56; M heme solucanlar 4 gün içinde gebe sahneye geliştirmek ve döl sayıda üretmek. Solucanlar 20 uM heme içeren mCeHR büyütüldü zaman döl fazla sayıda görülmüştür. Worms 100 um ve 500 mcM heme de döl geliştirmek ve üretmeye devam etti. Bununla birlikte, döl larva sayısı önemli ölçüde 20 uM Heme uygun hema konsantrasyonda yetiştirilen solucan ile karşılaştırıldığında düşmüştür. 800 uM'deki veya yukarıdaki Heme konsantrasyonları bu hem konsantrasyonları solucanlar toksik olduğunu göstermiştir L3 larva aşamasında, bodur, hastalıklı solucanlar sonuçlandı.
Uygun heme konsantrasyon ve C üzerinde heme yoksunluk ve heme toksisite etkisinin belirlenmesi ek olarak, elegans büyümesi, heme haberci soylar dolaylı olarak daha küçük bir konsantrasyon aralığında, solucanın hema durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. IQ6011 solucan bir heme duyarlı transkripsiyon muhabiri ifade eden transgenik bir solucan, P HRG-1 Şekil 2'de görüldüğü gibi, bu yanıt, heme bol olduğu koşullar altında tersine döner. GFP ekspresyon 20 uM heme da bastırılmış ve heme konsantrasyonu artar azaltılır. Heme konsantrasyon artımlı değişiklikler doğru mCeHR medya gen tepki ve ifade ile ilişkili olabilir.
Dikkatle solucan sağlanan besin maddesi konsantrasyonlarının kontrol edebilmeye ek olarak, mCeHR aksenik ortam senkronize solucanlar çok sayıda etkili bir büyüme sağlar. Bu özellik mikrotanecik bombardımanı (Şekil 3) için istismar edilebilir. En az bir adet entegre satır bu prosedür kullanılarak gerçekleştirilir, her mikro-parçacık bombardımanı (Tablo 2) için geliştirilmiştir.
Şekil 1. C. elegans heme büyüme eğrisi. Worms 9 gün boyunca mCeHR 1.000 uM 0 uM dan heme bir konsantrasyon aralığı içinde büyütüldü. Her bir konsantrasyon solucanlar sayısı sayılmış ve çizilmiştir. 1.5 'iM heme konsantrasyonları solucanlar L4 ve daha da geliştirmek için koyamadık. 800 uM heme de solucanlar L2-L3 aşamalarında bodur ve hem toksisite etkiler göstermiştir.
MCeHR farklı heme konsantrasyonlara heme sensörünün Şekil 2.. Yanıtı (Phrg-1 :: GFP) suşu. Senkronize transgenik C. elegans ifade HRG-1 :: GFP mCeHR 4 ile takviye edilmiş ortam, 8, 10, ya da 48 saat boyunca 20 uM heme yetiştirildi. Görüntüler Zeiss LSM 710 confoca ile alındıl mikroskop. Ölçek çubuğu 100 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. C'de mikropartikül bombardımanı şematik elegans mCeHR yetiştirilen unc-119 solucanlar kullanılmıştır. (1) yaklaşık 3 x 10 7 unc-119 (ED3) solucanlar 90 ml mCeHR ortam içerisinde büyütülür. (2) Gravids 50 ml konik tüp içinde 10-15 dakika boyunca buz üzerinde çökmelerine izin verilir. (3) yaklaşık olarak 5 x 10 6 gravid solucanlar A 2 ml pelet bir giremeyen NGM plaka üzerine düz bir şekilde yayıldı. Solucanlar altın parçacıkları ile unc-119 kurtarma plazmidin 12 çıkar plazmid ug ve 6 ug ile bombardıman edilmiştir. (4) To solucanlar E ile tohumlandı yirmi 10 cm tabak üzerine ayrıldı bombardıman coli suşu JM109. (5) 25 ° C 'de 2 hafta inkübe edildikten sonra, vahşi tip solucanlarla plakaları transgen sentezleme güç ve ayrılma oranları analizi için seçildi.
| Tablo 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| Steril teknik ve bir 1 L (0.22 um) vakumlu filtre ünitesi kullanılarak, tarif amacıyla, stok çözeltileri, su içinde aşağıdaki miktarlar filtre. | |
| Kolin Diasit sitrat | 10 mi |
| Vitamin ve büyüme faktörü mix | 10 mi |
| miyo-inositol | 10 mi |
| Hemin klorür | 10 mi |
| Deiyonize su | 250 ml |
| Nükleik asit karışımı | 20 mi |
| Mineral Mix | 100 mi |
| Laktalbümin hidrolizat | 20 mi |
| Esansiyel Amino Asit Mix | 20 mi |
| Non-esansiyel amino asit Mix | 10 mi |
| KH 2 PO 4 | 20 mi |
| D-Glucose | 50 mi |
| HEPES, sodyum tuzu | 10 mi |
| Deiyonize su | 250 ml |
| Ses, bu noktada 800 ml olacak Eklemek sonra vakum filtre ünitesini çıkarın: | |
| Kolesterol | 1 mi |
| Ultra pastörize yağsız süt | 200 mi |
| Tablo 1B | |
| Vitamin ve büyüme faktörü karışımı, 100 ml | |
| Çözüm 1: Su add 60 ml için: | |
| N-asetil-α-D-glukosamin | 0.15 g |
| DL-alanin | 0.15 g |
| Nikotinamid | 0.075 g |
| D-Pantethine | 0.0375 g |
| DL-pantotenik asit, hemi kalsiyum tuzu | 0.075 g |
| Folik asit | 0.075 g |
| Piridoksamin 2HCl | 0.0375 g |
| Piridoksin HCl | 0.075 g |
| Flavin mononükleotid, sodyum tuzu | 0.075 g |
| Tiamin hidroklorür | 0.075 g |
| Çözelti 2: 5 ml 1 N KOH, aşağıdaki kimyasal hazırlayın: | |
| p-aminobenzoik asit | 0.075 g |
| D-biotin | 0.0375 g |
| Siyanokobalamin (B12) | 0.0375 g |
| Folinik asit, kalsiyum tuzu | 0.0375 g |
| Nikotinik asit | 0.075 g |
| Piridoksal 5-fosfat | 0.0375 g |
| Çözelti 3: 0.0375 g (±) α-L-lipoik asit, 1 ml etanol içindeki oksitlenmiş form: | |
| Çözümleri 1, 2, ve 3 birleştirin ve 100 ml son hacim getir. 4 ° C de karanlıkta saklayın veya -20 ° C'de dondurularak alikotları Hızla kullanılır böylece bu karışımı için stokların küçük hacimli olun. | |
| Tablo 1C | |
| Nükleik asit bir karışım, 100 mi | |
| Su add 60 ml için: | |
| Adenosin, 5 '-monofosfat, sodyum tuzu | 1.74 g |
| Sıtıdın 5 '-fosfat | 1.84 g |
| Guanozin 2 '- ve 3'-monofosfat | 1.82 g |
| VEYA | |
| Guanozin 5 '-fosfat | 2.04 g |
| Üridin 5'-fosfat, disodyum tuzu | 1.84 g |
| Timin (son ekleyebilirsiniz) | 0.63 g |
| 4 ° C'de karanlıkta 100 ml ve saklamak için bir çözüm getirmek veya -20 ° C'de dondurularak alikotları Hızla kullanılır böylece bu karışımı için stokların küçük hacimli olun. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl2 • 6H 2 O | 4.1 g |
| Sodyum sitrat | 2.9 g |
| Potasyum sitrat monohidrat | 4.9 g |
| CuCl 2 • 2 O 2H | 0.07 g |
| MnCl2 • 4H 2 O | 0.2 g |
| ZnCl2 | 0.1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O | 0.6 g |
| CaCl2 • 2H 2 O (her zaman son ekleyebilirsiniz) | 0.2 g |
| Hızla kullanılır böylece bu karışımı için stokların küçük hacimli olun. | |
| Diğer Bileşenler | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Kolin di-asit sitrat | 2 mM |
| miyo-inositol | 2.4 mM |
| D-Glucose | 1.45 M |
| Hemin klorür | 0.1 N NaOH, pH 8.0, 2 mM |
| HEPES, sodyum tuzu | 1 M stok solüsyonu |
| Kolesterol | Etanol içinde 5 mg / ml |
| Laktalbümin hidrolizat enzimatik | 170 mg / ml |
| Tablo 1F | |
| M9 Tampon, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H 2 O | 1 L |
| Otoklav 30 dakika | |
| 1 M MgSO 4 (steril) | 1 mi |
Tablo 1. Tarifler mCeHR ve mCeHR bileşenleri için.
| Bombardıman | Yabani tip kurtarma ile Hatları | Kurtarma / transgen ile hatlar | Kararlı hat |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Ortalama | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tablo 2. AveraTransgenik C. ge sayısı elegans mikropartikül bombardımanı kullanılarak oluşturulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde hızlı C. sağlayan bir modifiye aksenik sıvı medya mCeHR sunmak solucanlar, çok sayıda üretim elegans üretimi. Solucanlar E. kirletmeden yetişir gibi bu ortam birçok avantajları göstermektedir coli veya bakteriyel yan ürünleri ve beslenme ve toksikolojik çalışmalar istismar edilebilir. E. kullanılması E. coli ya da bu tür çalışmalarda diğer bakterilerin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, bakterilerin büyümesi çeşitli koşullar altında değiştirebilir ve bakteriler sonuçların yorumunu karıştırıcı, tahlil edilmektedir molekülleri metabolize olabilir. Bu nedenle, bu çalışmalar yapılarak tanımlanmış bir ortamın geliştirilmesi son derece avantajlıdır.
Her ne kadar C. elegans önceki çalışmalarda 15, C yetiştirilen solucanlar sıvı ortam içinde büyümüş olan elegans bakım ortamı (CEMM) biz obse aksine ne nesil zamanlarda 16 ayrı bir gecikme göstermekmCeHR ortam içinde rve. Bizim asıl amacımız C yararlanmaya oldu Heme ve metal metabolizması üzerinde özel vurgu ile besin homeostazını çalışma elegans. Buna bağlı olarak, mCeHR ve grup tarafından oluşturulan modifikasyonlar bu amacı gerçekleştirmek ve doğrudan solucan heme homeostazinin muhafaza edilmesi ve sonuçta omurgalı model sistemler 17, 18 için gerekli olan genlerin bir dizi tanımlanmasına yol açmıştır. Reformüle mCeHR-1 medya da Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila ve C dahil olmak üzere diğer nematod türlerinin istismar edilebilir remanei. Ayrıca düşük metal formülasyonlar mCeHR-2 ve mCeHR-3 ağır metal toksisitesi ve gereksinimleri 12 inceleyerek çalışmalar istismar edilebilir.
Önceki iklimlendirmeden, N2 solucanlar mCeHR medya içerisinde, yaklaşık 7-10 gün daha uzun bir üretim zamanı sergiler. Solucanlar alt kültürlenir, bu kuşak kez OP5 yetişen solucanlar edilene benzer bir 4 gün için azalır0 bakteriler. Ancak, üretim süresi makul çünkü beslenme, hareket, ya da belirli besin gereksinimleri kusurları, belirli mutant solucanlar için daha uzun olabilir.
Aksenik sıvı ortam kullanırken titiz steril teknikler kullanılmaktadır önemlidir. Genellikle, antibiyotik kullanımının en aza indirilmesi ve solucanlar ortama alışmak ve kalan bakteriler ortadan kalkar gibi sonunda elimine. Antibiyotikler başlangıçta solucan kültürleri korkutur kalan bakterilerin büyümesini engeller olarak kurulmuş zaman kültürler aksenik olmasını sağlamak için gereklidir. Beyazlatmanın iki ardışık tur sonra, antibiyotikler sadece maskeler bir laminer akış kabini bu teknikleri kullanarak. Aksenik biçimde solucanları yetiştirmek için gerekli olan yoksul aseptik teknikler, yazarlar aksenik biçimde solucanlar büyümek mümkün olmuştur antibiyotik sürekli kullanımı gibi kültürlerden çıkarılana kirlenme olmadan. Med ilave olarak, uygun saklamaia ve parçaları solucan bakım ve büyümesi için gereklidir. Solucanlar büyüme oranı için kontrol ve temel besin tükenmiş olarak Dauer oluşumuna yol açabilir kalabalıklaşmayı önlemek için, alt kültür olmalıdır. Bu solucanlar yoğunluğu 3,000 solucanlar / ml / cm 2 aşmaması sağlanarak engellenebilir. C büyüyen yeni Araştırmacılar elegans aksenik biçimde günlük solucanlar kontrol ve haftalık solucanlar sayarak bunu başarabilirsiniz.
C. elegans araştırmacılar gen ifadesi ve protein yerelleştirme görselleştirme için izin floresan etiketli belirteçlerin ifade transgenik solucanlar üreterek şeffaf özelliklerinden yararlanmak. Transgenik enjeksiyon 19 kullanılarak üretilen ekstra kromozomal diziler ile ve yüksek gen ekspresyonunun sorunları önlenir düşük kopya bütünleyicilerin üretimi için izin verilen kullanmak biyolistik bombardımanı kaydetti. Kullanılarak üretilmesi transgeniklerinin önce, bir dezavantajıC. mikropartikül bombardımanı elegans prosedürü 20 için gerekli unc-119 (ED3) solucanlar çok sayıda üretmek için yumurta plaka hazırlık için gereksinimi oldu. Her bir dönüşüm gerekli kurtların sayısı için 20 yumurta levhaları gereklidir. MCeHR aksenik sıvı bir kültürün kullanarak daha etkili bir büyüme ve daha sonra bombardıman için daha solucan sağlar. Buna ek olarak, bombardımanının unc-119 (ED3) solucanlar 21 kullanarak önlemek için ilaç seçimi ile bağlantılı olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarları veya çıkar çatışması vardır beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma HealthGrants DK85035 ve DK074797 (İH) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
