Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Published: September 10, 2014 doi: 10.3791/51797
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

نقدم بيوشيب القائم ميكروفلويديك الكهروكيميائية للكشف عن تهجين الحمض النووي. التالية ssDNA التحقيق functionalization، يتم دراسة خصوصية وحساسية، والحد من الكشف مع أهداف ssDNA تكميلية وغير تكميلية. وتوضح النتائج أن تأثير الأحداث تهجين الحمض النووي على النظام الكهروكيميائية، مع حد الكشف عن 3.8 نانومتر.

Abstract

التصغير من الإجراءات التحليلية في الفوق الصغيرة الحجم يوفر مزايا هامة في ما يخص وقت رد الفعل، والتكلفة، والتكامل من الخطوات السابقة للتجهيز. استخدام هذه الأجهزة نحو تحليل الأحداث تهجين الحمض النووي هو مهم لأنه يقدم تكنولوجيا لتقييم الوقت الحقيقي من المؤشرات الحيوية في نقطة من الرعاية لمختلف الأمراض. ومع ذلك، عندما يقلل من البصمة جهاز هيمنة مختلف الظواهر الفيزيائية الزيادات. هذه الظواهر تؤثر على دقة تصنيع وموثوقية تشغيل الجهاز. ولذلك، هناك حاجة كبيرة لافتعال بدقة وتعمل هذه الأجهزة بطريقة استنساخه من أجل تحسين الأداء العام. هنا، نحن تصف البروتوكولات والأساليب المستخدمة لتصنيع وتشغيل بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتحليل دقيق للأحداث تهجين الحمض النووي. يتكون بيوشيب من جزأين: شريحة ميكروفلويديك معثلاث قنوات صغيرة موازية مصنوعة من (PDMS) polydimethylsiloxane، و 3 × 3 العريض الكهروكيميائية الدقيقة رقاقة. تم الكشف عن الأحداث تهجين الحمض النووي باستخدام مقاومة الكهروكيميائية الطيفي (EIS) التحليل. تحليل EIS يتيح مراقبة التغيرات في خصائص النظام الكهروكيميائية التي هي المهيمنة في هذه المقاييس طول. مع القدرة على رصد التغيرات في كل من تهمة نقل والمقاومة الأنتشارى مع جهاز الاستشعار البيولوجي، ونحن لشرح الانتقائية لأهداف ssDNA التكميلية، حد كشف حساب من 3.8 نانومتر، و 13٪ عبر التفاعل مع غيرها من ssDNA غير التكميلية التالية 20 دقيقة من الحضانة. هذه المنهجية يمكن تحسين أداء الأجهزة المنمنمة التي كتبها توضيح على سلوك نشر في النظام الصغيرة الحجم وذلك من خلال تمكين دراسة الأحداث تهجين الحمض النووي.

Introduction

المختبر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة (LOC) توفر مزايا عديدة في التشخيص السريري، والرصد البيئي والبحوث الطبية الحيوية. هذه الأجهزة تستخدم قنوات ميكروفلويديك للسيطرة على تدفق السوائل لمناطق رقاقة حيث مجموعة متنوعة من الإجراءات يمكن أن تأخذ مكان بما في ذلك خلط الكاشف، استنادا تقارب ملزمة، نقل الإشارة، وزراعة الخلايا 1-4. ويوفر مزايا عديدة أكثر على microfluidics أدوات التشخيص السريرية التقليدية مثل القراء لوحة microwell أو الكهربي المقايسات تحول جل. تتطلب أجهزة ميكروفلويديك 2 إلى 3 أوامر من حجم (nanoliters بدلا من ميكرولتر) أقل الكواشف لإجراء فحوصات مماثلة. أيضا، يمكن لهذه الأجهزة أن تزيد من السرعة التي تحدث بعض الأحداث البيولوجية بسبب الحبس أصغر من الأنواع داخل القنوات 5،6. ثالثا، وأجهزة الاستشعار يمكن دمجها داخل الأجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية والحفر، والتي يمكن أن توفر خالية من التسمية detectioن. وأخيرا، وهذه الأجهزة غير مكلفة لإنتاج وتتطلب القليل من العمل من جانب فني للعمل 7-10.

كشف خالية من التسمية عادة ما يتم تنفيذ باستخدام المفاتيح الضوئية أو الكهربائية. يمكن للأجهزة البصرية يقدم أداء أفضل الاستشعار بسبب التدخل أقل مع التحاليل في العينة. ومع ذلك، فإن خطر أدائهم في الحالات التي يكون فيها خلفية العينة لها نفس الطول الموجي للصدى وأجهزة الاستشعار 11. هناك العديد من المزايا لاستخدام الإشارات الكهربائية لإجراء الكشف البيولوجي والكيميائي في أنظمة ميكروفلويديك. تلفيق هي بطبيعتها أقل تعقيدا منذ هذه المجسات عادة لا تتطلب سوى أقطاب نمط التشغيل. بالإضافة إلى ذلك، إشارات كهربائية يمكن ربطه مباشرة مع معظم معدات القياس في حين طرائق إشارة أخرى قد تتطلب محول لتحويل إشارة 12-15. أجهزة الاستشعار الكهربائية عادة قياس التغيرات في impedancه 16،17، 18 السعة، أو الأكسدة النشاط 19. ومع ذلك، وتعرض كما هي المنمنمة هذه النظم تحديات جديدة. أهم التحديات للتغلب على ما يلي: إعداد العينات وخلط السوائل (بسبب حجم العينة منخفض وعدد رينولدز)، والتأثيرات الفيزيائية والكيميائية (بما في ذلك القوات الشعرية، خشونة السطح، والتفاعلات الكيميائية بين مواد البناء والتحاليل)، وانخفاض signal- نسبة إلى الضجيج (التي تنتجها المنطقة السطحية وخفض حجم) 20-23، والتدخل المحتمل من التحاليل الكهربائية نشط في العينات البيولوجية المعقدة (مثل الدم واللعاب). سوف مزيد من التحقيق في هذه الآثار تؤدي إلى المبادئ التوجيهية لتصنيع دقيق وتشغيل هذه الأجهزة بطريقة استنساخه التي من شأنها تحسين على أدائها العام.

ويستخدم على نطاق واسع كشف تهجين الحمض النووي لتشخيص الاضطرابات الوراثية 24،25 ومختلف أشكال ملغاةإيه 26. كل عام، ويتم تحديد سلالات متعددة من الانفلونزا في المرضى الذين يستخدمون النتائج من تقنيات تهجين الحمض النووي 27. فيروس الانفلونزا وحده مسؤولا عن 36،000 حالة وفاة سنويا في الولايات المتحدة 28. هذه الأمثلة يمكن أن تستفيد من مقعد بين كبار جهاز ميكروفلويديك التي يمكن أن تؤدي تقنيات فحص نفس قارئ لوحة أو هلام تحول الفحص مع انخفاض حجم العينة وعلى جزء صغير من التكلفة دون التضحية حساسية أو خصوصية. بسبب العديد من المزايا من خالية من التسمية الاستشعار الكهروكيميائية، وقد استخدم على نطاق واسع للكشف عن الأحداث تهجين الحمض النووي 29،30. الإعداد حيث انخفضت أقطاب المستوى الكلي (في حدود المليمتر) في الأكواب مع الحل من الفائدة يمكن استخدامها لتوفير البيانات الحساسة للغاية فيما يتعلق حركية ملزمة واحدة من تسلسل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل لمطابقة تسلسل التي تكمل بعضها بعضا. مؤخرا، كان هناك عدد قليل من التقدم في دمج الاستشعار الكهروكيميائية في ميكرofluidics لتهجين الحمض النووي. وقد أجريت دراسات فيما يتعلق حركية تهجين 31 ودمج أجهزة استشعار للكشف عن 15 في قنوات ميكروفلويديك. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة للحصول على إنتاجية عالية جهاز ميكروفلويديك السريع الذي يمكن تحليل الأحداث تهجين الحمض النووي بالتوازي دون خطوات إعداد العينات المعقدة.

الجهاز الواردة في هذا العمل يوفر منصة تسمح للتفاعل متعددة ليتم فحص بالتوازي وبدون خطوات إعداد العينات المعقدة. يقدم بروتوكول لدينا كيف ميكروفلويديك القائم وmicrofabricated biochips الكهروكيميائية مع النظم الكهروميكانيكية الدقيقة (MEMS) التكنولوجيا 32،33. وصفنا عملية تصنيع كل من رقاقة ميكروفلويديك، مصنوعة من polydimethylsiloxane (PDMS)، ورقاقة الكهروكيميائية، تتألف من مجموعة من الأقطاب الكهربائية. وتناولت أيضا functionalization الكيميائية للبيوشيب مع تحقيقات ssDNA. وأخيرا، فإن أبيويتجلى إيتي لجهاز الاستشعار البيولوجي للكشف على وجه التحديد وتحليل الأهداف ssDNA. وعموما، فإن بيوشيب الكهروكيميائية القائم ميكروفلويديك هي تقنية سريعة وتحليل الإنتاجية العالية. ويمكن استخدامه للتحقيق في التفاعلات بين الجزيئات البيولوجية ومحولات إجراء، ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختبر على واحد في رقاقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التصنيع الدقيق للرقاقة ميكروفلويديك

  1. إعداد الكهروكيميائية رقاقة
    1. نمط الذهب أقطاب
      1. شطف فارغة 4 '' رقاقة السيليكون (درجة الجودة الأولية) مع الأسيتون، والميثانول، والأيزوبروبانول ("AMI" نظيفة). شطف الأيزوبروبانول من الرقاقة مع الماء منزوع الأيونات (DI)، يليه التجفيف مع N 2 بندقية.
      2. تنمو 1 ميكرون سميكة شافي 2 طبقة التخميل مع ترسيب الأبخرة الكيميائية محسنة البلازما (PECVD) الأداة. إيداع 200 طبقة سميكة من الكروم تليها 2،000 طبقة سميكة من الذهب مع أداة DC الاخرق.
      3. تدور "PR1" مقاوم الضوء الإيجابي (معلمات الغزل: 3،000 دورة في الدقيقة، 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية، 30 ثانية) لإنشاء فيلم موحد ~ 1.6 ميكرون سميكة. قبل خبز الرقاقة لمدة 1 دقيقة في 100 درجة مئوية على طبق ساخن.
      4. فضح رقاقة مع 190 ميغا جول / سم 2 في 405 نانومتر الطول الموجي من خلال الضوئية الرئيسية. تطوير رقاقة لمدة 30 ثانية في 352 ديفeloper وشطف الرقاقة مع DI والجافة مع N 2 بندقية.
      5. حفر الذهب مع منمش الذهب مقابل 1.5 دقيقة. حفر الكروم مع الكروم لمنمش ~ 30 ثانية. شطف الرقاقة مع DI والجافة مع N 2 بندقية.
      6. تجريد مقاومة للضوء مع "AMI" الإجراء نظيفة.
        ملاحظة: مؤكسد قوي وقابلة للانفجار.
      7. تنظيف رقاقة مع 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 خليط ("سمكة البيرانا" نظيفة) لمدة 1 دقيقة. شطف الرقاقة مع DI والجافة مع N 2 بندقية.
    2. نمط البلاتين أقطاب
      1. تدور "PR2" مقاوم الضوء الإيجابي (معلمات الغزل: 3،000 دورة في الدقيقة، 1،000 دورة في الدقيقة / ثانية، 30 ثانية) لإنشاء فيلم موحد ~ 1.4 ميكرون سميكة. قبل خبز الرقاقة لمدة 1 دقيقة في 100 درجة مئوية على طبق ساخن.
      2. فضح رقاقة مع 30 ميغا جول / سم 2 في 405 نانومتر الطول الموجي من خلال الضوئية الرئيسية. خبز الرقاقة لمدة 45 ثانية في 125 درجة مئوية على طبق ساخن. الفيضانات فضحالرقاقة مع 1،000 ميغا جول / سم 2 في 405 نانومتر الطول الموجي بدون الضوئية الرئيسية. تطوير رقاقة لمدة 2 دقيقة في 6: 1 AZ400K المطور وشطف الرقاقة مع DI والجافة مع N 2 بندقية.
      3. إيداع 400 طبقة سميكة من التيتانيوم تليها طبقة سميكة 1600 ألف من البلاتين باستخدام نظام التبخر E-شعاع.
      4. رفع قبالة مقاومة للضوء في حمام الأسيتون ultrasonicated لمدة 5 دقائق تليها شطف مع الأسيتون والأيزوبروبانول. شطف الرقاقة مع DI والجافة مع N 2 بندقية.
  2. إعداد القنوات الفحص
    1. إعداد قالب لقنوات الفحص
      1. شطف فارغة 4 '' رقاقة السيليكون (اختبار درجة الجودة) مع "AMI" الإجراء نظيفة. شطف الأيزوبروبانول من الرقاقة مع DI تليها تجفيف مع N 2 بندقية.
      2. تدور "PR3" مقاوم الضوء السلبية (2 خطوة المعلمات الغزل: خطوة واحدة - 600 دورة في الدقيقة، 120 دورة في الدقيقة / ثانية، 10 ثانية الخطوة الثانية - 1،150 دورة في الدقيقة، 383 دورة في الدقيقة / ثانية،27 ثانية) لخلق فيلم موحد ~ 100 ميكرون سميكة. قبل خبز الرقاقة على طبق ساخن (معلمات الخبز خطوة 2: خطوة واحدة - تكثيف من درجة حرارة الغرفة إلى 65 درجة مئوية في 300 درجة مئوية / ساعة وعقد في درجة الحرارة لمدة 10 دقيقة الخطوة 2 - المنحدر تصل إلى 95 ° C في 300 درجة مئوية / ساعة ودرجة الحرارة عقد لمدة 30 دقيقة).
      3. فضح الرقاقة مع 2،500 ميغا جول / سم 2 في 405 نانومتر الطول الموجي من خلال الضوئية الرئيسية. بعد خبز الرقاقة من خلال زيادة تصل إلى 95 درجة مئوية في 300 درجة مئوية / ساعة وعقد في درجة الحرارة لمدة 10 دقيقة على طبق ساخن. تطوير رقاقة لمدة 10 دقيقة في بروبيلين جلايكول الأثير Monomethyl خلات (PGMEA) المطور. شطف الرقاقة مع الأيزوبروبانول والجافة مع N 2 بندقية.
    2. افتعال قنوات الفحص
      1. إعداد 10: 1 polydimethylsiloxane (PDMS) خليط (20 غرام من المطاط الصناعي، 2 غرام من وكيل علاج) وديغا تماما في فراغ الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      2. تحديد ضميمة حول رقاقة العفن مع رقائق الألومنيوم وتصب ببطء PDMS غير مخمرعلى العفن.
      3. خبز القالب مع PDMS في فرن مربع (2 المعلمات الخبز خطوة: خطوة واحدة - 5 دقائق ستزيد من درجة حرارة الغرفة إلى 80 درجة مئوية الخطوة 2 - عقد في 80 درجة مئوية لمدة 17 دقيقة).
      4. قشر بعيدا PDMS من العفن ومكان على رقائق الألومنيوم. قطع رقائق فحص بسكين الجراح، وتحديد الثقوب مع أداة خزعة اللكم.

2. تجميع جهاز

  1. محاذاة قنوات فحص PDMS مع أقطاب العمل على رقاقة الكهروكيميائية يدويا. PDMS العصي بشكل جيد لشريحة الكهروكيميائية، وختم القنوات ومنع التسرب.
  2. توصيل أنابيب مرنة (OD 0.087 'وID 0.015') إلى الكوع البلاستيك أو موصل مستقيم باستخدام أنبوب مرن قصيرة كما محول (OD 0.1875 'و0.0625 ID' '). إرفاق وصلات إلى كل من مداخل اللكم ثقب في الجهاز.
  3. ربط حقنة على الطرف الآخر منالأنابيب ووضع الحقنة في ضخ حقنة. بالتناوب تغيير مجموعة من حقنة، أنبوب، وموصل وفقا لالخطوة الإجراء المطلوب في الفرع 3 و حل المناظر له.

3. تحليل الحمض النووي التهجين

ملاحظة: إدخال كل حل ببطء في قناة بمعدل تدفق 200 ميكرولتر / ساعة حتى يتم شغل القناة بأكملها.

  1. Functionalize كل متناهية العمودية مع مختلف تسلسل ssDNA التحقيق (أداء بالتوازي مع 3 microchannels عمودية منفصلة):
    1. ملء كل متناهية مع حل ssDNA التحقيق حضانة مختلفة (10 ملي العازلة الفوسفات، و 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ميكرومتر تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)، و 1 ميكرومتر التحقيق ssDNA)، واحتضان لمدة 1 ساعة تليها الشطف متناهية مع برنامج تلفزيوني.
    2. ملء متناهية مع محلول يحتوي على 1 ملم من 6 mercapto-1-HEXANOL (صحة الأم والطفل) في منطقة عازلة من 10 ملي PBS، 100 مم كلوريد الصوديوم و1.395 ملي TCEP، وincuيليه باتي لمدة 1 ساعة قبل الشطف متناهية مع برنامج تلفزيوني.
  2. رفع قبالة PDMS، وتناوب 90 درجة إلى اتجاه أفقي، ووضع أسفل لفضح صفوف منفصلة من غرف رد فعل مع كل صف يحتوي على عداد فريدة والإلكترود المرجعي (الشكل S1).
  3. تعبئة و microchannels مع حل قياس السيطرة على 4X تتركز سيترات الصوديوم المالحة (SSC) العازلة، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
  4. قياس الخلفية: إملأ و microchannels مع 5 ملي فيري سيانيد / 5 ملي فيروسيانيد في محلول PBS وتسجيل القيم مقاومة للنظام الكهروكيميائية للترددات مختلفة (الكهروكيميائية الطيفي مقاومة، EIS) باستخدام potentiostat متصلة العمل، ومكافحة، وأقطاب المرجعية ( EIS المعلمات: نطاق الترددات من 1 ميغاهيرتز إلى 0.1 هرتز، 10 نقاط البيانات تردد في العقد الواحد، 25 فولت السعة، 5 بالسيارات الاستقطاب مقابل الإلكترود المرجعي). تكرار هذا القياس لكل العاملين في القطب و microchannels. قياس تهجين الحمض النووي (أداء لكل هدف ssDNA غير التكميلي والتكميلي).
    1. تعبئة و microchannels مع الهدف ssDNA حل قياس 4X تتركز عازلة SSC تحتوي على 1 ميكرومتر من الهدف ssDNA، واحتضان لمدة 20 دقيقة. قياس الحمض النووي وفقا للخطوة 3.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عملية التصنيع السيطرة عليها ودقيقة للجهاز التجريبي ضروري في مجال البحوث. فإنه يسمح للباحثين بالحصول على التجارب التي مرت استنساخه والعالية. هنا نكون قد أظهرت عالية الغلة، وعملية التصنيع الدقيق استنساخ عالية من بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك (الشكل 1). مع انخفاض معدل الفشل، وقد أظهرت بعض الأجهزة القضايا الربط التي تؤدي إلى تسرب الحل. من أجل التحقق من صحة النشاط الكهروكيميائية من بيوشيب، تتم القياسات voltammetry دوري في شغل و microchannels مع الكهربائية نشط زوجين الأكسدة فيري سيانيد / فيروسيانيد الشكل 2 يوضح استجابة الكهروكيميائية استنساخه من تسعة القطب عمل مختلفة على الرقاقة. وتبين هذه النتائج أن النشاط الكهروكيميائية هو نفسه في جميع غرف تسعة من بيوشيب السماح قياسات الإنتاجية العالية.

معظم أجهزة الاستشعار تهجين الحمض النووي شل ssDNAتحقيقات على سطح جهاز الاستشعار. كما يستخدم الذهب لنمط الأقطاب الاستشعار لأجهزة ميكروفلويديك، التجولات هي جيدة المرشحين لتشكيل الرابطة التساهمية قوية مع استشعار السطوح 34. تشارك مؤسسة واحدة تقنية الاقتران المشتركة مضيفا مجموعة ثيول الوظيفي (-SH) في واحدة من نهاية ssDNA. السندات ثاني كبريتيد SS يحمي مجموعة ثيول خالية من الأكسدة حتى انها مستعدة لاستخدامها. مرة واحدة يتم تقليل ثاني كبريتيد بواسطة تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) بالإضافة إلى ذلك، ثيول مجانا (-SH) يصبح متاحا لسندات DNA على سطح الذهب. دون TCEP، فإن السندات ثاني كبريتيد من ssDNA التجمع أيضا على القطب، ولكن السندات أضعف بكثير من السندات ثيول والذهب ولن تبقى مستقرة في كافة مراحل التجربة. في هذا العمل، تم تحقيق أحادي الطبقة ssDNA مستقرة للكشف عن التهجين مع أوقات الحضانة بين ساعة وساعتين. مرة واحدة تم تجميعها تحقيقات ssDNA على القطب، يتم استخدام 6-mercapto-1-HEXANOL (صحة الأم والطفل) إيقاف فاعلية وذ المناطق المعرضة على السطح للحد من آثار ملزمة غير محددة 35. تتيح مجموعة ثيول على صحة الأم والطفل للالتجميع الذاتي على الذهب ومجموعة الهيدروكسيل يقلل من امتصاص غير محدد من ssDNA في الحل. يستخدم تركيز TCEP عالية للحد من جماعات ثيول التي قد تتأكسد لتشكيل السندات ثاني كبريتيد. دون نسبة عالية TCEP في المنطقة العازلة، فإن صحة الأم والطفل تشكل الطبقات الوحيدة غير مستقرة وان البيانات مقاومة تختلف وفقا لذلك بسبب الاختلافات مع التهمة السطح. لصحة الأم والطفل لديه وظيفة هامة أخرى عند استخدامه كما التخميل مع جزيئات ssDNA. عملية الامتزاز التأكسدي للصحة الأم والطفل يقحم الإلكترونات إلى القطب ويقلل من إمكانية السطح. هذا يسبب تأثير الكهربائي مع التحقيق ssDNA أنيوني يجمد بالفعل وssDNA تقف تستقيم بعيدا عن القطب 36. تحقيقات تستقيم زيادة كبيرة في كفاءة التهجين منذ الهدف ssDNA فروع لها أسهل بكثير الوصول إلى البريدطول ntire من تسلسل التحقيق. هذه الخطوة التخميل أمر حاسم لإقامة مستقر قياس مقاومة خط الأساس من أجهزة الاستشعار، والحد من اشارات ايجابية كاذبة وإزالة أي جزيئات ملزمة ضعيفة من على سطح الأرض.

وتستند آلية biosensing الأحداث تهجين الحمض النووي على قوات التنافر بين الحمض النووي سالبة الشحنة وغيرها من الجزيئات الكهربائية النشط. عند حدوث حدث التهجين، قوات التنافر أقوى بين تهجين الحمض النووي والجزيئات الكهربائية نشطة تجعل من الصعب على الأنواع الكهربائية نشط لمنتشر نحو القطب 37. نحن هنا استخدام فيري سيانيد / زوجين فيروسيانيد كمؤشر الأنواع الأكسدة لهذه القوات التنافر والتي يتم قياسها باستخدام التحليل الطيفي الكهروكيميائية مقاومة (EIS). نحن الاستفادة من هذه الآلية biosensing في بيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك، وإثبات قدرتها على اكتشاف الأحداث تهجين الحمض النووي 33. الشكل 3 يبينالانتقائية للجهاز الاستشعار البيولوجي التي توضح الاختلافات مقاومة نتيجة الأحداث التهجين بين ثلاثة تحقيقات ssDNA والهدف ssDNA مكملة لها. وقد أظهر 13٪ عبر التفاعل مع ssDNA غير تكميلية أخرى بعد 20 دقيقة من الحضانة. تظهر هذه النتائج مدى جدوى الجهاز microfabricated لقياس الأحداث تهجين الحمض النووي بطريقة استنساخه وعالية الإنتاجية. نحن أيضا أظهروا حساسية جهاز الاستشعار البيولوجي من خلال إدخال تركيزات مختلفة من الهدف ssDNA مكملا للمسبار الاستشعار الشكل 4 يوضح وظائف جهاز الاستشعار البيولوجي مع وجود اتجاه لزيادة القيم مقاومة لارتفاع تركيزات الهدف ssDNA. الحسابات التالية للمقاومة الأنتشارى مقيدة 33 لتركيزات مختلفة من الهدف ssDNA التكميلي أدت تحليل الانحدار الخطي في الحد النظري للكشف عن 3.8 نانومتر بواسطة حساب المقابلة ssDNA تركيز الهدف للإشارة الخلفية. عموما، يبين بيوشيب القدرة على الإحساس بسرعة وجود أحداث تهجين الحمض النووي.

الشكل 1
الرقم 1. الصورة من جهاز تعبئتها تحت الاختبار (أبعاد رقاقة: 3.5 سم × 3.5 سم، ارتفاع متناهية هو 100 ميكرون و 500 ميكرون في العرض).

الشكل 2
الشكل 2. الكهروكيميائية التحقق من الصحة. voltammograms دوري من 9 (3 × 3 الشبكة) أقطاب العمل بحضور فيروسيانيد / فيري سيانيد زوجين الأكسدة. يظهر استنساخ بين أقطاب منقوشة من شكل مماثل، مرتفعات الذروة، وفصل الذروة لجميع الأقطاب."https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" الهدف = "_ على بياض"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. خصوصية جهاز الاستشعار البيولوجي. تأثير الأحداث التهجين بين الأهداف ssDNA مختلفة وثلاثة تحقيقات ssDNA مختلفة على المقاومة نقل المسؤول. على الحدث تهجين الحمض النووي، وقوة التنافر أقوى بين سالبة الشحنة تقطعت بهم السبل الحمض النووي المزدوج والجزيئات المشحونة سلبا النتائج فيروسيانيد / فيري سيانيد في أعلى تهمة مقاومة النقل.

الرقم 4
الرقم 4. ظائف جهاز الاستشعار البيولوجي. مؤامرة نيكويستقياسات المعاوقة الكهروكيميائية الطيفي بعد إدخال 0.01، 0.1، 1، و 1 ميكرومتر الهدف ssDNA (السهم يشير إلى زيادة تركيزات الهدف ssDNA). زيادة القيم مقاومة في الترددات المنخفضة (~ 15 هرتز) لتركيزات أعلى ssDNA الهدف ومن المقرر أن قوات التنافر أقوى بين dsDNA والجزيئات فيروسيانيد / فيري سيانيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تثبت إجراءاتنا تصنيع وبيوشيب الكهروكيميائية القائم ميكروفلويديك واستخدامه لتحليل الأحداث تهجين الحمض النووي. من خلال عملية التصنيع الدقيق عالية الغلة تسيطر علينا تطوير جهاز تتألف من قنوات الميكروسكيل متكاملة مع مجموعة واسعة من محولات الطاقة الكهروكيميائية. لقد وضعت معايير للرقابة لمعالجة الإجراء ضوئيه من الشريحة الكهروكيميائية والعفن قناة ميكروفلويديك من خلال نهج تكرارية. توفر هذه الخطوات مبادئ توجيهية لخلق المستقبل من غيرها من الأجهزة التحليلية المنمنمة. الأهم من ذلك، أنها توفر وسيلة لتحسين مختلف المعلمات biosensing مثل نسبة الإشارة إلى الضوضاء والاستقرار والحساسية. بعد تصنيع الجهاز، نحن functionalize محولات الطاقة الكهروكيميائية مع ssDNA التحقيق باعتباره bioreceptor، وتوفير الغرض التحليلي فريدة من نوعها. على الرغم من أن هذه الإجراءات تظهر انخفاض معدل فشل الجهاز، يظهر تسرب حل ليكون ماخوالقضية التالية ص تجميع الجهاز وأثناء أداء فحص تهجين الحمض النووي. سوف مزيد من التحقيق في فشل الترابط في هذه الأجهزة تحسين العائد من هذه العملية وجعلها مثالية لدراسة النظم البيولوجية الدقيقة.

في دراساتنا، وتبين لنا قدرة بيوشيب إلى دقة وتحديدا الشعور الأحداث تهجين الحمض النووي. كجزء من المعلمات تصميم لجهاز التحليلي الجزئي الجديد، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار تصنيع الجهاز، الذي يطالب نهج تكرارية لتحسين المعلمات تصنيع (على سبيل المثال، المعلمات ضوئيه، أبعاد متناهية، ونوع المعدن أودعت). من أجل الكشف عن كفاءة الأحداث تهجين الحمض النووي، ssDNA التجمع التحقيق والظروف التهجين يجب أن يكون الأمثل وكذلك (على سبيل المثال، فترة حضانة، وتركيز العازلة، تركيز التحقيق، ومنع امتصاص غير محددة).

القدرة على الشاشة بسرعة FOص معينة تسلسل الحمض النووي هو مفيد جدا في مجالات أبحاث السرطان، والكشف عن الإنفلونزا والهندسة الوراثية. طرق الكشف الأكثر المحتشدة تستخدم تسمية لإنتاج إشارة واستخدام عدة الغسيل وحضانة الخطوات. الاستفادة من الأجهزة ميكروفلويديك المقترح، سيتم تنفيذ تهجين الحمض النووي مع عدد كبير من تسلسل الحمض النووي في نفس الجهاز دون الحاجة للتسميات من أي نوع. نحن نتصور التطبيقات على المدى القريب دمج قدرات أكثر تطورا إلى بيوشيب لتحسين أدائها ونمطية. على سبيل المثال، على microfluidics القائم على صمام لديه القدرة على توفير بيوشيب مع التلقائي والتحكم قدرات التحليل. مثال آخر هو functionalizing الجهاز مع bioreceptors البعض، تقدم خصائص فريدة الاستشعار التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

المؤلفون تقر مؤسسة روبرت دبليو الألمانية، ووكالة الدفاع لتقليص التهديد (DTRA)، ومؤسسة العلوم الوطنية الناشئة حدود في البحث والابتكار (EFRI) للحصول على الدعم المالي. شكرا الكتاب أيضا ماريلاند Nanocenter وFablab من أجل دعم مرفق غرف الأبحاث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'' Silicon wafer Ultrasil 4-5664 Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1") Microchem positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2") Hoechst Celanse positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3") Microchem negative photoresist
Gold etchant Transene TFA No dilution
Chromium etchant Transene 1020AC No dilution
PDMS elastomer Dow Corning 3097366 1004
PDMS curing agent Dow Corning 3097358 1004
Biopsy punching tool Healthlink BP20
Tygon flexible tubing Cole Parmer  R 3603 0.015"
Tygon flexible adapter Cole Parmer  06417-41 0.0625"
1 ml syringe Beckton-Dickenson 301025
Monobasic potassium phosphate Fluka 1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous Sigma RES20765-A7
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine Aldrich C4706
6-mercapto-1-hexanol Aldrich 451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer Sigma 93017
Potassium hexacyanoferrate(III) Aldrich 455946
Complementary ssDNA #1 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3 Integrated DNA Technologies (IDT) 100 nmole DNA oligo 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) Oxford Instruments PlasmaLab System 100 Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit AJA International ATC 1800-V For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system Denton Custom-built For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat CH Instruments 660D
Syringe pump KD Scientific KDS230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
  2. Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
  3. Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
  4. Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
  5. Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
  6. Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
  7. Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
  8. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
  9. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
  10. Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
  11. Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
  12. Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
  13. Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
  14. Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
  15. Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
  16. Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
  17. Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
  18. Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
  19. Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
  20. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
  21. Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
  22. Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
  23. Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
  24. Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
  25. Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
  26. Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
  27. Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
  28. Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
  29. Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
  30. Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
  31. Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
  32. Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
  33. Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
  34. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
  35. McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
  36. Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
  37. Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 91، الكهروكيميائية مقاومة الطيفي، تهجين الحمض النووي، وجهاز الاستشعار البيولوجي، بيوشيب، على microfluidics، كشف خالية من التسمية، نشر مقيدة، التصنيع الدقيق
وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H.,… More

Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Gordonov, T., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51797, doi:10.3791/51797 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter