Summary
Vi presenterar en mikroflödesbaserad elektro biochip för DNA-hybridisering detektering. Efter ssDNA sond funktion är specificiteten, känslighet och detektionsgräns studeras med kompletterande och icke-komplementära ssDNA mål. Resultaten illustrerar inverkan av DNA-hybridiserings-händelser på den elektrokemiska systemet, med en detektionsgräns av 3,8 nM.
Abstract
Miniatyrisering av analytiska stationärförfaranden i den mikroskala ger betydande fördelar i fråga om att reaktionstiden, kostnad och integrering av pre-processteg. Med hjälp av dessa enheter mot analysen av DNA hybridiseringshändelser är viktigt eftersom det ger en teknik för realtids bedömning av biomarkörer vid point-of-care för olika sjukdomar. Men när enheten fotavtryck minskar dominansen av olika fysiska fenomen ökar. Dessa fenomen påverkar tillverkningsprecision och driftsäkerhet hos anordningen. Det finns därför ett stort behov av att noggrant tillverka och driva dessa enheter i ett reproducerbart sätt för att förbättra det totala resultatet. Här beskriver vi de protokoll och de metoder som används för tillverkning och drift av en mikroflödesbaserad elektro biochip för noggrann analys av DNA hybridiseringshändelser. Den biochip består av två delar: ett mikroflödes chip medtre parallella mikrokanalerna tillverkade av polydimetylsiloxan (PDMS), och en 3 x 3 anordnade elektromikrochips. De DNA hybridiseringshändelser detekteras med hjälp av elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS) analys. EIS analysen möjliggör övervakning variationer av egenskaperna hos den elektrokemiska system som dominerar vid dessa längdskalor. Med möjligheten att övervaka förändringar av både laddningsöverföring och diffusion motstånd med biosensor visar vi selektivitet till komplementära ssDNA mål, en beräknad detektionsgräns på 3,8 nM, och en 13% korsreaktivitet med andra icke-komplementära ssDNA efter 20 min av inkubation. Denna metod kan förbättra prestanda för miniatyriserade enheter genom att belysa på beteendet hos diffusion på mikroskala regimen och genom att möjliggöra studier av DNA hybridiseringshändelser.
Introduction
Microfluidic lab-on-a-chip (LOC) enheter ger många fördelar i klinisk diagnostik, miljöövervakning och biomedicinsk forskning. Dessa enheter använder mikroflödessystem kanaler för att styra vätskeflödet till regioner i chip där olika förfaranden kan ske inklusive reagensblandning, affinitetsbaserad bindning, signaltransduktion, och cell odling 1-4. Microfluidics ger många fördelar jämfört med konventionella kliniska diagnostiska verktyg såsom mikroplattläsare eller elektro gel skiftanalyser. Mikrofluidikanordningar kräver 2 till 3 storleksordningar (nanoliter i motsats till mikroliter) färre reagens för att utföra liknande analyser. Dessutom kan dessa anordningar öka hastigheten med vilken vissa biologiska händelser inträffa på grund av den mindre inneslutning av arterna inom kanalerna 5,6. För det tredje kan sensorer vara integrerade i mikrofluidanordningar som använder litografi och etsningstekniker, som kan förse etiketten fritt detection. Slutligen är dessa anordningar är billig att producera och kräver lite arbete på den del av teknikern för att driva 7-10.
Tillverkare fritt detekterings typiskt utförs med användning av en optisk eller elektrisk givare. Optiska enheter kan presentera bättre avkänning prestanda på grund av lägre interferens med analyter i provet. Ändå är deras prestanda komprometteras i fall där provet har en bakgrund har samma resonansvåglängden som sensorn 11. Det finns många fördelar med att använda elektriska signaler för att utföra biologisk och kemisk detektion i mikrofluidiska system. Tillverkningen är i sig mindre komplicerat eftersom dessa sensorer normalt endast kräver mönstrade elektroder för att fungera. Dessutom kan elektriska signaler direkt gränssnitt med de flesta mätutrustning medan andra signal formerna kan kräva en omvandlare för att omvandla signalen 12-15. Elektriska sensorer mäter vanligen förändringar i impedance 16,17, kapacitans 18, eller redoxaktivitet 19. Men nya utmaningar presenteras som dessa system miniatyriserade. De viktigaste utmaningar att övervinna är: provberedning och blandning av vätskor (på grund av den låga provvolym och Reynolds tal), fysikaliska och kemiska effekter (inklusive kapillärkrafter, ytjämnhet, kemisk interaktion mellan byggmaterial och analyter), låg signal- till-brusförhållandet (producerat av den reducerade ytarea och volym) från 20 till 23, och risk för störningar från elektroaktiva analyter i komplexa biologiska prover (t.ex. blod och saliv). Ytterligare undersökning av dessa effekter kommer att resultera i riktlinjer för en korrekt tillverkning och drift av dessa enheter i ett reproducerbart sätt som skulle förbättra deras samlade resultat.
DNA-hybridisering detektering används i stor utsträckning för att diagnostisera genetiska sjukdomar 24,25 och olika former av cancER 26. Varje år flera stammar av influensa identifierats hos patienter som använder resultat från DNA hybridiseringstekniker 27. Influensavirus ensamt står för 36.000 dödsfall varje år i USA 28. Sådana exempel skulle kunna gynnas av en bänk-topp mikrofluidikanordning som kan utföra samma analystekniker som en plattläsare eller gelskiftanalys med låg provvolym och till en bråkdel av kostnaden utan att offra känslighet eller specificitet. På grund av de många fördelarna med etikettfria elektrokemisk avkänning, har den använts i stor utsträckning för detektion av DNA hybridiseringshändelser 29,30. En installation där makroskala elektroder (i millimeterområdet) doppas i bägare med lösningen av intresse kan användas för att ge mycket känsliga uppgifter om de bindande kinetik enkelsträngade DNA-sekvenser i sina matchande komplementära sekvenser. Nyligen har det funnits några framsteg i att införliva elektroanalys i MICRofluidics för DNA-hybridisering. Studier har utförts avseende hybridiseringskinetik 31 och integration av sensorer för detektion 15 i mikroflödessystem kanaler. Dock finns det fortfarande ett behov av en snabb hög genomströmning mikroflödessystem enhet som kan analysera DNA hybridiseringshändelser parallellt utan komplicerade provberedningssteg.
Enheten som presenteras i detta arbete ger en plattform som gör det möjligt för flera interaktioner som ska screenas parallellt och utan komplicerade provberedningssteg. Vår protokoll visar hur mikroflödesbaserade elektrokemiska biochips är mikrofabricerad med mikroelektromekanisk system (MEMS) teknik 32,33. Vi beskriver tillverkningsprocessen av både mikrofluidchip, tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS), och den elektrokemiska chip, som består av en matris av elektroder. Den kemiska funktionalisering av biochip med ssDNA sonder tas också upp. Slutligen Abilhet av biosensor att specifikt upptäcka och analysera ssDNA mål demonstreras. Totalt sett är mikroflödesbaserade elektro biochip en snabb och hög genomströmning analysteknik. Den kan användas för att undersöka interaktioner mellan biologiska molekyler och ledande givare, och kan användas i en mängd olika tillämpningar lab-on-a-chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Mikro av mikroflödes Chip
- Förbered Elektrokemisk Chip
- Mönster Guld Elektroder
- Skölj en tom 4 '' kiselwafer (prime kvalitet) med aceton, metanol och isopropanol ("AMI" ren). Skölj isopropanolen från skivan med avjoniserat vatten (DI), följt av torkning med N 2 pistol.
- Odla en 1 mm tjock SiO 2 passiveringsskikt med plasmaförstärkt kemisk ångavsättning (PECVD) verktyg. Avsätta ett 200 Å tjockt skikt av krom följt av ett 2000 Å tjockt skikt av guld med en DC-sputtring verktyg.
- Spin "PR1" positiv fotoresist (spinning parametrar: 3.000 rpm, 1000 rpm / sek, 30 sek) för att skapa en enhetlig film ~ 1.6 nm tjockt. Pre-baka skivan under 1 min vid 100 ° C på en värmeplatta.
- Exponera rån med 190 mJ / cm 2 vid 405 nm våglängd genom en fotomask. Utveckla rånet i 30 sekunder i 352 developer och skölj skivan med DI och torka med N2 pistol.
- Etsa guld med guldetsningsmedel i 1,5 minuter. Etsa krom med krom etsningsmedel för ~ 30 sek. Skölj skivan med DI och torka med N2 pistol.
- Skala av fotoresist med "AMI" clean förfarande.
OBS: starkt oxidationsmedel och explosiva. - Rengör skivan med 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2-blandning ("Piranha" ren) för 1 min. Skölj skivan med DI och torka med N2 pistol.
- Mönster platinaelektroder
- Spin "PR2" positiv fotoresist (spinning parametrar: 3.000 rpm, 1000 rpm / sek, 30 sek) för att skapa en enhetlig film ~ 1.4 nm tjockt. Pre-baka skivan under 1 min vid 100 ° C på en värmeplatta.
- Exponera skivan med 30 mJ / cm 2 vid 405 nm våglängd genom en fotomask. Baka wafern för 45 sek vid 125 ° C på en värmeplatta. Flood utsättawafern med 1000 mJ / cm 2 vid 405 nm våglängd utan en fotomask. Utveckla rånet för 2 min i 6: 1 AZ400K utvecklare och skölj wafern med DI och torr med N 2 pistol.
- Avsätta ett 400 Å tjockt skikt av titan följt av ett 1600 Å tjockt skikt av platina genom att använda en E-stråleförångning systemet.
- Lyft av fotoresist i ett ultraljud aceton i 5 minuter följt av sköljning med aceton och isopropanol. Skölj skivan med DI och torka med N2 pistol.
- Mönster Guld Elektroder
- Förbered Assay Kanaler
- Förbered Mold för analys kanaler
- Skölj en tom 4 '' kiselskiva (provkvalitet) med "AMI" clean förfarande. Skölj isopropanolen från skivan med DI följt av torkning med N 2 pistol.
- Spin "PR3" negativ fotoresist (2-steg spinning parametrar:. Steg ett - 600 rpm, 120 rpm / sek, 10 sek Steg två - 1.150 rpm, 383 rpm / sek,27 sek) för att skapa en enhetlig film ~ 100 | im tjock. Pre-baka rånet på en värmeplatta (2-steg bakning parametrar:. Steg ett - ramp upp från rumstemperatur till 65 ° C vid 300 ° C / h och håll temperaturen i 10 minuter Steg 2 - ramp upp till 95 ° C vid 300 ° C / h och håll temperaturen under 30 min).
- Exponera skivan med 2500 mJ / cm 2 vid 405 nm våglängd genom en fotomask. Post-baka wafern rampas upp till 95 ° C vid 300 ° C / h och håll temperaturen under 10 min på en varm platta. Develop wafern för 10 min i propylenglykolmonometyleter-acetat (PGMEA) utvecklare. Skölj skivan med isopropanol och torka med N2 pistol.
- Tillverka Assay Kanaler
- Bered 10: en polydimetylsiloxan (PDMS)-blandning (20 g elastomer, 2 g härdare) och fullständigt avgasa i en vakuumkammare för 20 min.
- Definiera en inhägnad runt formskiva med aluminiumfolie och långsamt häll ohärdade PDMSöver formen.
- Baka formen med PDMS i en låda ugn (2-stegs bakning parameters:. Steg ett - 5 minuter ramp upp från rumstemperatur till 80 ° C Steg 2 - håll vid 80 ° C under 17 min).
- Skala bort PDMS från formen och lägg på aluminiumfolie. Skär analys marker med en kirurg kniv, definierar hål med en biopsi stansverktyg.
- Förbered Mold för analys kanaler
2 Montera Device
- Anpassa manuellt PDMS analyskanaler med arbetselektroderna på den elektrokemiska chip. PDMS pinnar väl till den elektrokemiska chip, tätning kanalerna och förhindra läckage.
- Anslut en flexibel slang (OD 0,087 '"och id 0,015' ') till en plast armbåge eller rak koppling med hjälp av en kort flexibel slang som en adapter (OD 0,1875'" och ID 0,0625 ''). Fäst kontakter för att var och en av hålslagna inlopp i enheten.
- Anslut en spruta på den andra änden avslangen och placera sprutan på en sprutpump. Alternativt ändra uppsättningen en spruta, ett rör och en kontakt efter önskad förfarandet steget i avsnitt 3 och dess motsvarande lösning.
3 Analysera DNA hybridisering
OBS: Införa varje lösning långsamt in i kanalen vid en flödeshastighet av 200 | il / timme tills hela kanalen är fylld.
- Funktionalisera varje vertikal mikrokanal med en annan ssDNA sondsekvens (utför parallellt med de tre separata vertikala mikrokanaler):
- Fyll varje mikrokanal med en annan ssDNA sond inkubation lösning (10 mM fosfatbuffert, 100 mM NaCl, 10 uM tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP), och 1 ^ iM sond ssDNA) och inkubera under 1 h följt av sköljning mikrokanalen med PBS.
- Fyll de mikrokanal med en lösning innehållande 1 mM av 6-merkapto-1-hexanol (MCH) i en buffert av 10 mM PBS, 100 mM NaCl och 1,395 mM TCEP, och incubate för 1 h följt av sköljning mikrokanalen med PBS.
- Lyft bort PDMS, roteras 90 ° till en horisontell orientering, och lägg ner för att exponera separata rader av reaktionskammare med varje rad innehåller en unik räknare och referenselektrod (Figur S1).
- Fyll mikrokanaler med mätning kontrollösning av 4x koncentrerad saltlösning-natriumcitrat (SSC)-buffert, och inkubera under 20 min.
- Bakgrund mätning: Fyll mikrokanaler med 5 mM ferricyanid / 5 mM ferrocyanid i PBS-lösning och registrera impedansvärdena i den elektrokemiska system för olika frekvenser (elektro impedansspektroskopi, EIS) med hjälp av en potentiostat ansluten till arbets, disken och referenselektroder ( EIS parametrar: frekvensområde från 1 MHz till 0,1 Hz, 10 frekvensdatapunkter per årtionde, 25 mV amplitud, 5 mV polariserings kontra referenselektrod). Upprepa denna mätning för varje arbetselektrod i mikrokanaler. Mät DNA-hybridisering (utför för varje icke-kompletterande och komplementär ssDNA mål).
- Fyll mikrokanaler med målet ssDNA mätning lösning av 4x koncentrerad SSC-buffert innehållande 1 | iM av mål-ssDNA, och inkubera under 20 min. Mät DNA enligt steg 3,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kontrollerbar och exakt tillverkningsprocess för den experimentella anordningen är väsentlig inom forskningen. Det tillåter forskare att få reproducerbara och hög genomströmning experiment. Här har vi visat en hög avkastning, hög reproducerbarhet mikrofabrikation process av en mikroflödesbaserad elektro biochip (Figur 1). Med en låg felfrekvens, har några anordningar visat bindnings frågor som leder till lösning läckage. För att validera den elektrokemiska aktiviteten hos biochip, är cykliska mätningar voltammetri göras i mikrokanaler är fyllda med en elektro-aktiv redoxpar ferricyanid / ferrocyanid. Figur 2 visar reproducerbar elektrokemisk reaktion av nio olika arbetselektrod på chipet. Dessa resultat visar att den elektrokemiska aktiviteten är densamma i alla nio kammare i biochip möjliggör hög genomströmning mätningar.
De flesta DNA-hybridisering sensorer immobilisera ssDNAsonder på en sensoryta. Eftersom guld används för att mönstret avkänningselektroderna för mikroflödessystem enheter, tioler är goda kandidater för att bilda starka kovalenta bindningar med sensorn ytorna 34. En vanlig konjugering teknik involverade tillsats av en funktionell tiol (-SH) grupp vid en ände av ssDNA. SS disulfidbindning skyddar fri tiolgrupp från oxidation tills den är klar att användas. När disulfiden reduceras av tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) Dessutom, den fria tiol (-SH) blir tillgänglig för att binda DNA till en guldyta. Utan TCEP kommer disulfidbindningar i ssDNA även montera på elektroden, men obligationen är mycket svagare än den tiol-guld band och kommer inte att förbli stabil under hela experimentet. I detta arbete har en stabil ssDNA monolager för hybridisering detektion uppnåtts med inkubationstider mellan en och två timmar. När ssDNA sonder har monterats på elektroden, är 6-merkapto-1-hexanol (MCH) brukade passivera eny exponerade områdena på ytan för att minska icke-specifika bindningseffekter 35. MCH s tiolgrupp möjliggör självsammansättning på guld och hydroxylgruppen minskar icke-specifik adsorption av ssDNA i lösning. Den höga TCEP koncentration används för att minska de tiolgrupper som kan ha oxiderats till bildning av disulfidbindningar. Utan den höga TCEP innehållet i bufferten, skulle MCH bilda instabila monoskikt och de impedansdata skulle variera i enlighet därmed på grund av variationer med ytladdningen. MCH har en annan viktig funktion när du använder den som passive med ssDNA-molekyler. Den oxidativa adsorptionsprocess av MCH injicerar elektroner in i elektroden och minskar ytpotential. Detta orsakar en elektrostatisk kraft med anjoniska sond ssDNA redan immobiliserade och ssDNA står upprätt bort från elektroden 36. Upright sonder ökar kraftigt hybridiseringseffektiviteten sedan målet ssDNA strängar har mycket lättare tillgång till entire längden av sondsekvensen. Denna passive steg är avgörande för att skapa en stabil impedans baslinje mätning av sensor, minska falska positiva signaler och ta bort eventuella svagt bundna molekyler från ytan.
Den biosensing mekanismen för DNA-hybridisering händelser bygger på repulsionskrafter mellan negativt laddade DNA och andra elektroaktiva molekyler. När en hybridisering händelse inträffar starkare repulsionskrafterna mellan den hybridiserade DNA och de elektroaktiva molekyler gör det svårare för de elektroaktiva species att diffundera mot elektroden 37. Här använder vi ett ferricyanid / ferrocyanid par som redox arter indikator för dessa repulsionskrafter, som mäts med elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS). Vi använder den här biosensing mekanism i mikroflödesbaserade elektro biochip, och visa sin förmåga att upptäcka DNA hybridiseringshändelser 33. Figur 3 visar denselektivitet av biosensorn genom illustrerande impedansvariationer som ett resultat av hybridiseringsbetingelser händelser mellan tre ssDNA-sonder och deras komplementära ssDNA målet. En 13% korsreaktivitet med andra icke-komplementära ssDNA efter 20 min av inkubation har påvisats. Dessa resultat visar att genomförbarheten av mikrofabricerade anordning för att mäta DNA-hybridisering händelser i ett reproducerbart och hög genomströmning sätt. Vi har också visat hur känslig biosensor genom att införa olika koncentrationer av komplementär ssDNA mål att sonden. Figur 4 visar funktionaliteten hos biosensorn med en trend av ökande impedansvärdena högre ssDNA målkoncentrationer. Efter beräkningar av den begränsade diffusion motståndet 33 för olika koncentrationer av komplementär ssDNA mål, ledde en linjär regressionsanalys i en teoretisk detektionsgräns på 3,8 nM vid beräkningen av motsvarande ssDNA målkoncentrationen för bakgrundssignalen. Sammantaget visar biochip förmågan att snabbt känna av närvaron av DNA hybridiseringshändelser.
Figur 1 Fotografera av förpackat mätobjektet (chip dimensioner: 3,5 cm x 3,5 cm, mikrohöjd är 100 nm och 500 nm i bredd).
Figur 2 Elektro validering. Cykliska voltammogram av 9 (3 x 3 rutnät) arbetselektroder i närvaro av ferrocyanid / ferricyanid redox par. Reproducerbarheten bland de mönstrade elektroderna visas med liknande form, topphöjderna och toppseparation för alla elektroderna."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Specifika uppgifter om biosensor. Effekterna av hybridiseringshändelser mellan olika ssDNA mål och tre olika ssDNA sonder på laddningsöverföringsmotståndet. Vid DNA-hybridisering händelsen, desto starkare repulsion kraften mellan negativt laddade dubbelsträngat DNA och de negativt laddade ferrocyanid / ferricyanid molekyler ger högre laddningsöverföringsmotstånd.
Figur 4 Funktionalitet av biosensor. Nyquist plotelektrokemiska impedans spektroskopi mätningar efter införandet av 0,01, 0,1, 1, och 1 ^ M mål ssDNA (pil indikerar ökande ssDNA målkoncentrationer). De ökade impedansvärdena vid låga frekvenser (~ 15 Hz) för högre mål ssDNA halterna beror på starkare repulsionskrafter mellan dsDNA och ferrocyanid / ferricyanid molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Våra rutiner visar tillverkningen av en mikroflödesbaserad elektro biochip och dess användning för DNA hybridiseringshändelser analys. Genom en hög avkastning kontrollerad mikrofabrikation process utvecklar vi en anordning som består av mikroskala kanaler integreras med en mängd elektrokemiska givare. Vi har tagit fram kontrollerade processparametrar för fotolitografi förfarandet för den elektrokemiska chip och mikroflödeskanalen formen genom en iterativ metod. Dessa steg ger riktlinjer för framtida skapande av andra miniatyriserade analytiska enheter. Viktigt är att de ger en metod för att optimera olika biosensing parametrar såsom signal-brus-förhållande, stabilitet och känslighet. Efter Komponentframställning, vi funktionalisera de elektrokemiska givare med ssDNA sond som bioreceptor, ger en unik analys syfte. Även om dessa förfaranden visar låga enhet felfrekvens, visar lösning läckage vara en major frågan efter montering av anordningen och under utförandet av DNA-hybridisering analys. Ytterligare undersökning av bindnings fel i sådana anordningar skulle förbättra utbytet av processen och gör den idealisk för mikro bio-system studie.
I våra studier, visar vi förmågan hos biochip att exakt och specifikt känna av DNA-hybridiserings-händelser. Som en del av designparametrar för ett nytt analytiskt mikro enhet, bör man ta hänsyn till tillverkningen av produkten, vilket kräver en iterativ metod för att optimera tillverkningsparametrar (t.ex. fotolitografiska parametrar, mikrokanaldimensioner, typ av deponerade metallen). För att effektivt detektera DNA hybridiseringshändelser, ssDNA sondenheten och hybridiseringsvillkor måste optimeras också (t.ex.., Inkubationstid, buffertkoncentration, sondkoncentration, förebyggande av ospecifik adsorption).
Förmågan att snabbt screena for vissa DNA-sekvenser är mycket fördelaktigt inom cancerforskningen, upptäckt influensa och genteknik. Mest klädd detektionsmetoder använder en etikett för att producera signalen och använda flera tvätt och inkuberingssteg. Med användning av de föreslagna mikrofluidikanordningar, kommer DNA-hybridisering utföras med högt antal av DNA-sekvenser i samma anordning utan behov av etiketter av något slag. Vi ser framför oss den närmaste tiden applikationer som integrerar mer avancerade funktionerna i biochip för att förbättra dess prestanda och modularitet. Till exempel har ventil-baserade mikroflödes potential att ge biochip med automatiska och kontrollerade förmågor analys. Ett annat exempel är funktionalisering av enheten med andra bioreceptors, ger unika avkänning egenskaper som kan användas i ett bredare spektrum av applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner Robert W. Deutsch Foundation, Reduction Agency Defense Threat (DTRA) och National Science Foundation Emerging Frontiers i forskning och innovation (EFRI) om finansiellt stöd. Författarna tackar också Maryland Nanocenter och dess Fablab för renrum anläggning stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
