Vi presentiamo un biochip elettrochimico basato microfluidica-per la rilevazione ibridazione DNA. A seguito di ssDNA sonda funzionalizzazione, la specificità, sensibilità, e il limite di rilevazione sono studiati con obiettivi ssDNA complementari e non complementari. I risultati illustrano l'influenza degli eventi di ibridazione DNA sul sistema elettrochimico, con un limite di rilevazione di 3,8 nM.
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Articolo metodologico
Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis
In questo articolo
Sommario
Abstract
La miniaturizzazione delle procedure analitiche da banco in micro-scala offre vantaggi significativi per quanto riguarda il tempo di reazione, costi, e l'integrazione delle fasi di pre-elaborazione. Utilizzando questi dispositivi verso l'analisi degli eventi di ibridazione del DNA è importante perché offre una tecnologia per la valutazione in tempo reale dei biomarcatori presso il punto di cura per varie malattie. Tuttavia, quando l'impronta dispositivo diminuisce il dominio di vari aumenti di fenomeni fisici. Questi fenomeni influenzano la precisione di fabbricazione e l'affidabilità di funzionamento del dispositivo. Pertanto, vi è una grande necessità di fabbricare accuratamente e farli funzionare in modo riproducibile al fine di migliorare le prestazioni complessive. Qui, descriviamo i protocolli ei metodi utilizzati per la fabbricazione e il funzionamento di un biochip elettrochimica microfluidica-based per l'analisi accurata di eventi di ibridazione DNA. Il biochip è composto di due parti: un chip microfluidica contre micro-canali paralleli fatti di polidimetilsilossano (PDMS), e un Arrayed microchip elettrochimica 3 x 3. Gli eventi di ibridazione DNA vengono rilevati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) analisi. L'analisi EIS consente variazioni di monitoraggio delle proprietà del sistema elettrochimico che sono dominanti in queste scale di lunghezza. Con la possibilità di monitorare le variazioni sia di trasferimento di carica e la resistenza diffusionale con il biosensore, dimostriamo la selettività di obiettivi ssDNA complementari, un limite di rilevazione calcolato di 3,8 nM, ed una cross-reattività 13% con altri ssDNA non complementare dopo 20 min di incubazione. Questa metodologia può migliorare le prestazioni dei dispositivi miniaturizzati da chiarire sul comportamento di diffusione al regime micro-scala e consentendo lo studio di eventi di ibridazione DNA.
Introduzione
Lab-on-a-chip microfluidica (LOC) dispositivi offrono numerosi vantaggi in diagnostica clinica, il monitoraggio ambientale e la ricerca biomedica. Questi dispositivi utilizzano canali microfluidici per controllare il flusso del fluido alle regioni del chip dove una varietà di procedure può avvenire compresa la miscelazione dei reagenti, affinità di base vincolante, trasduzione del segnale, e la cella coltura 1-4. Microfluidica offre molti vantaggi rispetto ai tradizionali strumenti diagnostici clinici, quali lettori di piastra Elisa o elettroforetica saggi di gel shift. Dispositivi microfluidici richiedono 2 o 3 ordini di grandezza (nanolitri al contrario ....
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Protocollo
1 Microfabbricazione del Microfluidic Chip
- Preparare elettrochimica Chip
- Modello Oro Elettrodi
- Risciacquare un vuoto 4 '' wafer di silicio (qualità di prima qualità) con acetone, metanolo e isopropanolo ("AMI" clean). Sciacquare il isopropanolo dal wafer con acqua deionizzata (DI), seguita da asciugatura con N 2 pistola.
- Crescere uno spesso strato di SiO 2 1 micron con passivazione chimica da fase vapore deposizione al plasma (PECVD) strumento. Depositare uno strato spesso 200 di cromo seguito da uno strato spesso un 2000 d'oro con uno strumento di sputtering DC.
- Spin "PR1" photoresist....
- Modello Oro Elettrodi
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Risultati
Un controllabile e accurato processo di fabbricazione per il dispositivo sperimentale è essenziale nella ricerca. Esso consente ai ricercatori di ottenere esperimenti riproducibili e di throughput elevati. Qui abbiamo dimostrato un rendimento elevato, processo microfabbricazione alta riproducibilità di un biochip elettrochimica microfluidica-based (Figura 1). Con un tasso di fallimento basso, pochi dispositivi hanno mostrato problemi di incollaggio che portano a perdite di soluzione. Al fine di validare.......
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Discussione
Le nostre procedure dimostrano la fabbricazione di un biochip elettrochimica basata microfluidica e il suo utilizzo per l'analisi di eventi di ibridazione del DNA. Attraverso un processo di microfabbricazione alta resa controllata sviluppiamo un dispositivo costituito da canali microscala, integrato con un insieme di trasduttori elettrochimici. Abbiamo ideato parametri di elaborazione controllate per la procedura di fotolitografia del chip elettrochimica e lo stampo canale microfluidica attraverso un approccio itera.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il Robert W. Deutsch Fondazione, la Defense Threat Reduction Agency (DTRA), e la National Science Foundation Emerging frontiere della ricerca e innovazione (EFRI) per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano anche il Maryland Nanocenter e il suo Fablab per il supporto impianto di camera bianca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Wafer di silicone da 4'' | Ultrasil | 4-5664 | Lato singolo lucidato; tipo P; Boro drogato; Orientamento 1-0-0; Spessore 500 micron; Resistenza 10-20 ohm· cm |
| Shipley 1813 fotoresist ("PR1") | Microchem | fotoresist positivo | |
| AZ5214 fotoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | fotoresist positivo | |
| SU-8 50 ("PR3") | Microchem | fotoresist negativo | |
| etchant | Transene | TFA | Nessuna diluizione |
| Mordenzante al cromo | Transene | 1020AC | senza diluizione |
| Dow Corning | 3097366 1004 | ||
| Agente indurente PDMS | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Strumento di punzonatura per biopsia | Healthlink | BP20 | |
| Tygon | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon adattatore flessibile | Cole Parmer | 06417-41 | da 0,0625" |
| 1 ml | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Fluka | 1551139 | |
| Fosfato di potassio bibasico anidro | Sigma | RES20765-A7 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carbossietil)fosfina | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-esanolo | Aldrich | 451088 | |
| 20x tampone salino-sodio citrato concentrato | Sigma | 93017 | |
| Esacianoferrato di potassio (III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementare ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3' |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3' |
| Complementare ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3' |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3' |
| Complementare ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5'-TCATCATGGGTCTAACTACTACT GGATCTAGGT-3' |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Pressione della camera 1,000 mTorr, Tempreture 200 ° C, potenza RF 20 W, Gasses: a) portata N2O 710 scmc; b) una composizione del 5% di SiH4 e del 95% di N2 velocità di flusso dei gas 170 sccm, SiO2 tasso di crescita 690 Å/min. |
| Unità di sputtering DC | AJA International | ATC 1800-V | Per Chrome: Pressione della camera 10 mTorr, Portata di argon 20 sccm, Potenza DC fornita 200 W, Velocità di sputtering 10 nm/min. Per l'oro: pressione della camera 10 mTorr, portata di argon 20 sccm, potenza CC fornita 200 W, velocità di sputtering 36 nm/min. |
| Sistema di evaporazione E-beam | Denton | Costruito su misura | per il titanio: Pressione della camera < 2 x 10-6 Torr, Potenza fornita all'e-gun 7,5 kW, Corrente di filamento 150-200 mA, Velocità di evaporazione 6-10 Å/sec. Per il platino: pressione della camera < 2 x 10-6 Torr, Potenza fornita all'e-gun 7,5 kW, Corrente di filamento 150-200 mA, Velocità di evaporazione 2-3 Å/sec. |
| Potenziostato | CH Instruments | 660D | |
| Pompa a siringa | KD Scientific | KDS230 |
Riferimenti
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
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Ristampe e permessi
Tag
Biochip elettrochimico microfluidicospettroscopia di impedenza elettrochimicamicrocanali in polidimetilsilossanofabbricazione di elettrodi d orodeposizione di elettrodi di platinosonde di DNA a singolo filamentoresistenza al trasferimento di caricalimite di rilevamento del biosensorediagnostica point of care
