Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация клатрином эндоцитоза из G-белками в Single-событий резолюции через TIRF микроскопии

70.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 октября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

В этой статье

Краткое содержание

Клатрин-опосредованный эндоцитоз, быстрый и высокодинамичный процесс, интернализует многие белки, включая сигнальные рецепторы. Описанный здесь протокол непосредственно визуализирует кинетику отдельных эндоцитарных событий. Это важно для понимания того, как основные члены эндоцитарного аппарата координируются друг с другом и как белковый груз влияет на этот процесс.

Аннотация

Многие важные сигнальные рецепторы интернализуются через хорошо изученный процесс клатрин-опосредованного эндоцитоза (CME). Традиционные клеточные биологические анализы, измеряющие глобальные изменения в эндоцитозе, выявили более 30 известных компонентов, участвующих в CME, а биохимические исследования создали карту взаимодействия многих из этих компонентов. Тем не менее, становится все более очевидным, что CME является высокодинамичным процессом, регулирование которого является сложным и деликатным. В данной рукописи мы описываем использование флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF) для прямой визуализации динамики компонентов клатрин-опосредованного эндоцитарного механизма в реальном времени в живых клетках на уровне отдельных событий, которые опосредуют этот процесс. Этот подход необходим для выяснения тонких изменений, которые могут изменить эндоцитоз без его глобального блокирования, как это видно при физиологической регуляции. Мы сосредоточимся на использовании этого метода для анализа области, представляющей растущий интерес, а именно роли состава груза в модулировании динамики отдельных ям, покрытых клатрином (CCP). Этот протокол совместим с различными широко доступными флуоресцентными зондами и может быть применен для визуализации динамики многих молекул груза, которые интернализуются с поверхности клетки.

Введение

Процесс клатрин эндоцитоза (CME) зависит от своевременного прибытия многих компонентов клатрин опосредованного эндоцитоза машин для сбора грузов и манипулировать плазматическую мембрану в пузырьки 1-3. CME инициируется мембрана деформации и грузо-адаптера белков, которые приходят вместе в зарождающихся сайтов эндоцитоза 1. Эти белки набирать клатрин белка оболочки, который собирает в клетку-подобную структуру, которая образует клатриновых яму (КПК) 4. После того, как КПК полностью собран в сферическую форму, мембраны разрыва, в первую очередь через действия большого GTPase, динамина, генерирует свободные клатриновых везикулы (CCVS) 5,6. Это вызывает интернализацию быстрому распаду в клатрин покрытия, что позволяет компонентам быть повторно использован для множества циклов CME.

Открытие и характеристика белков, участвующих в CME была корни в традиционной Biochemical, генетические и методы микроскопии 4-6,8. Эти анализы выяснены роли и точки взаимодействия этих эндоцитотических компонентов. Хотя очень полезно для определения основных компонентов торговли машинами, эти анализы весьма ограничены в захвате динамического поведения компонентов CME или концентрации грузов. Это очень важный ограничение, так как CME движет хореографии сборке комплектов белковых модулей в определенных шагов, и, так как небольшие изменения в динамике отдельных эндоцитотических событий может иметь большие совокупные последствия эндоцитоза. Кроме того, недавние данные показывают, что отдельные ККТ могут отличаться как по составу, так и в поведении, предполагая, что физиологическое регулирование этого процесса весьма пространстве и во времени ограничены 9-14. Визуализация отдельных эндоцитотических события, поэтому, очень важно понять, почему существует несколько избыточные белки, участвующие в CME и как эти белки могут контролироваться бу физиологические сигналы для регулирования грузовой интернационализации.

Здесь мы опишем использование полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) наблюдать CME на уровне динамики отдельных ККТ в живых клетках. TIRFM опирается на разность показателей преломления между покровным стеклом и жидкую окружающую среду клеток 15,16. Когда возбуждающий свет направлен клеток на более, чем критический угол, она внутреннее отражение, создавая затухани волн, который поддерживает тонкую область освещения, проходящую приблизительно 100 нм выше покровного стекла. Это гарантирует, что только флуоресцентных молекул в этой узкой области возбуждены. Практически, это позволяет возбуждение флуоресцентных молекул на территории или вблизи плазматической мембраны, и сводит к минимуму флуоресценции из внутренних частей клетки. Это обеспечивает значительно более высокий коэффициент сигнал-шум и ось г разрешение для визуализации событий на плазмалеммы, товарищескойmpared для наиболее часто используемых режимах, таких как обычной эпифлуоресцентной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Мы также описать, в вступительного и практическом уровне, использование широко применяемого платформы анализа изображений для анализа и количественного простые морфологические особенности и динамику отдельных событий грузов эндоцитотических.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Выражение флуоресцентно меткой CME компонентов в культивируемых клетках

НЕК293 полезные модели клетки, которые были использованы широко изучать GPCR биологию и эндоцитоз, и поэтому используются в качестве моделей в этом протоколе. Используйте любой протокол трансфекции, обеспечивающую равномерное выражение без избыточной экспрессии и низкой цитотоксичности.

  1. Ручка все культуры клеток в стерильной ламинаре. Заполните 4 лунки 12-луночного планшета с 1 мл модифицированной по Дульбекко Essential медиа (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). С сливной T25 колбу НЕК293 разбавить 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, соответственно, в каждом из 4 скважин.
    1. Кроме того, семена клетки многолуночном пластины нужного размера в, в соответствии с инструкциями изготовителя. Семенной 0,4 - 2 х 10 4 клеток в 12-луночного планшета. Вырастить клеток в течение ночи в стерильном 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что рост гАтеш варьируются в зависимости от условий и клеточных линий, было бы предпочтительнее, чтобы отобрать несколько скважин для обеспечения идеального слияния для трансфекции на следующий день или возможность выполнения трансфекций в двух экземплярах.
  2. На следующее утро, выбрать Хорошо, что это ~ 70% сливной для трансфекции (см рисунок 1b). Если нет хорошо достигло этого состояния, ждать еще один день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 70% слияния идеально подходит для НЕК293. Трансфекции клеток, которые являются более редкие приводит к гибели клеток и токсичности. Трансфекции более-сливной клеток приводит к плохой выражения.
  3. Добавить 60 мкл буфера EC (от трансфекции комплекте), 400 нг плазмиды, кодирующие помечены GPCRs и / или компоненты клатрин техники и 2,4 мкл Enhancer в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, как описано в инструкции производителя. Vortex в течение 2 сек, чтобы обеспечить достаточное перемешивание, и спина в микроцентрифуге в 2000 мкг в течение 2 сек для сбора жидкости в нижней части.
  4. Добавить6 мкл Effectene, как описано в инструкции производителя. Вихревые в течение 2 сек, и спина в 2000 мкг в течение 2 сек в микроцентрифуге для сбора жидкости в нижней части. Подождите 20 минут, чтобы позволить для формирования трансфекции сложных мицеллы.
  5. Аспирируйте СМИ от скважины для трансфекции. Осторожно добавляют 0,8 мл среды DMEM с 10% FBS с реагента для трансфекции смеси и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз медленно, чтобы уменьшить нарушение мицеллы. Добавить СМИ и трансфекции смеси в скважине очень медленно со стороны. Добавить оставшуюся трансфекции смесь из трубки микроцентрифужных к колодцу с помощью микропипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно добавить дополнительные 0,5 мл DMEM с 10% FBS, чтобы трансфектированную хорошо, чтобы дать клеткам дополнительное питание, что приводит к более мягким трансфекции и нижней временной экспрессии.
  6. Вернуться клетки в 37 ° C инкубаторе в течение 5 часов.
  7. Аспирируйте СМИ, содержащие трансфекции смесь. Заменить 1 мл DMEM с 10% FBS. Разрешитьклеткам расти в течение ночи.
  8. На следующий день, проходят клетки с непокрытыми покровные, ранее стерилизованных в автоклаве.
    1. Добавить 0,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с 1 мМ ЭДТА в каждую лунку. Кроме того, использование 0,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Оставьте в инкубаторе в течение 1 мин.
    2. Поместите 3 раунд, стерильные 25 мм покровные в отдельные лунки 6-луночного планшета. Заполните каждую лунку по 2 мл СМИ. Аккуратно нажмите на покровное вниз к нижней части скважины, чтобы предотвратить клетки от растет в нижней части покровного стекла.
    3. Вручную агитировать хорошо стартовать клетки со дна колодца. Добавить 1 мл DMEM с 10% FBS ресуспендировать. Распределите подняли клетки от 1 лунку 12-луночного планшета с равномерно среди 3 покровные. Кроме того, пластины клеток на 3 прозрачным дном посуды.
  9. Разрешить клетки растут на покровные, по крайней мере 48 часов, после чего визуализации. Убедитесь, что клетки разбросаны и помещения.

2.Изображений КПК и грузовые Динамика Использование TIRFM

  1. Конъюгат M1 анти-FLAG антитела с Alexa красителей с использованием Alexa Fluor комплект Белок маркировка в соответствии с протоколом изготовления. В качестве альтернативы, предварительно конъюгированные антитела могут быть приобретены.
  2. Предварительно инкубируют клетки с антителами в разведении 1: 1000 в 1 мл подогретого Лейбовиц среде с 10% FBS, или Opti-MEM с 50 мМ HEPES, рН 7,4, и 10% FBS в течение 10 мин при 37 ° С (томография среда), для обозначения FLAG-меткой GPCRs на клеточной поверхности. Перейти следующие действия, если генетически кодируемые флуоресцентные белки, такие как GFP, используются в качестве меток (см обсуждение для деталей).
  3. Трансфер покровное к камере изображений живых клеток. Кроме того, для стеклянным дном посуды, аспирации антитела маркировки СМИ и добавить 700 мкл подогретого среды визуализации.
    1. Используйте пару щипцов и согните кончик 25 иглы в крюк.
    2. Держите пару щипцов в доминирующей рукой. Держите согнутую иглу в дрэ. Поверните иглу до кривых крюк вниз к стеклу. Осторожно перетащить иглы, крючок стороной вниз, в нижней части 6-луночного планшета, пока он не перехватывает на покровное. Позаботьтесь, чтобы не поцарапать поверхность покровного стекла, как это будет отделить клетки. Аккуратно поднимите покровное со дна колодца. Весы покровное к стене колодца для поддержки.
    3. С помощью пинцета, чтобы понять, близко к краю покровного стекла и перейти на сторону покровное клеток до камере формирования изображения, и собрать камеру. Добавить 700 мкл (или соответствующее количество) из подогретого среды визуализации. Ручка покровные тщательно без давления, чтобы предотвратить растрескивание или разрыв.
  4. Передача камеру к микроскопу и поддерживать температуру клеток при 37 ° С с использованием стадии нагреватель или закрытый инкубатор.
  5. Принесите клеток в фокусе, используя 100X или 60X TIRF масло-иммерсионный объектив (1,45 NA или выше). Image клетки в обычной эпифлуоресцентной или конкоординационные режимы освещения (т.е. не TIRFM) для идентификации клеток, экспрессирующих соответствующие конструкции. Нет в фокусе клетки почти невидимым в тонкой глубине TIRF освещения делает его трудно найти в фокальной плоскости и клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые системы используют одни и те же лазеры для TIRFM к изображению в обычном эпифлуоресцентной, перемещая угол падения выше критического угла лазера. В качестве важного предосторожности безопасности, всегда быть в курсе угла лазерного луча, и всегда направлять его от наблюдателя.
  6. Фокус вниз к нижней поверхности клетки, экспрессирующей, пока контур плазматической мембраны вокруг клетки не исчезает, и появляется в центре ячейки. Это наиболее очевидно с плазменной мембранного белка локализованы грузов, таких как μ-опиоидных рецепторов (см рис 2А).
  7. Переключение в режим визуализации TIRF.
    1. Если, используя те же лазеры для визуализации в обычной эпифлуоресцентной, увеличить угол падениялазер до из-из-фокус флуоресценции в глубь ячейки исчезает, и нет наброски мембране вокруг клетки не видно. (Сравните фиг.2с данным 2А и 2В)
      ПРИМЕЧАНИЕ: В TIRFM, двигаясь в фокальной плоскости вызывает образ идти полностью в фокусе и / или тусклым, и общий уровень флуоресценции уменьшается за счет меньшей глубине освещения. Поэтому, альтернативный метод, чтобы переключиться на TIRFM освещения является первым акцентом на центр ячейки в конфокальной / традиционная эпифлуоресцентной, затем увеличить угол падения, пока не потеряет большую часть флуоресценции, а затем сосредоточиться до плазменной мембране.
    2. После того, как в TIRFM, обеспечения лазерного возбуждения отражает обратно через объектив и не видна над целью. Подтвердите это, проверяя, если лазерное пятно видно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В обычных эпифлуоресцентной или конфокальной режимов, лазерный освещения видна над целью,например, на потолке.
    3. Уточните фокус, чтобы получить четкое изображение. Основными компонентами эндоцитотического машин, таких как клатрина, будут видны в Puncta. Настройте фокус на отлично, поэтому Puncta являются круглыми, как это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для мембраной локализованы груза, регулировать точной фокусировки, пока филоподии не появятся различны.
    4. Используйте программу приобретения, чтобы сохранить все параметры изображения, такие как зеркала и углом TIRF. Сделайте это для всех необходимых длин волн.
  8. Сканирование вокруг покровного найти клетки, экспрессирующие все желаемые эндоцитотических маркеры: на μ-опиоидных рецепторов и адаптер β-arrestin в примере, показанном на рисунке 3А. Выберите ячейки, которые выражают, но не чрезмерно, выражающие. Смотреть обсуждение для деталей.
  9. После того, как клетки идентифицируют, получать изображения каждые 3 секунды в течение 10 мин. Этого достаточно, чтобы захватить время жизни КПК, так как средний срок службы КПК в НЕК293 отображенных в этих условиях является Aroунд 40 сек 10-11. Это позволяет приблизительно 12-14 кадров для наблюдения КПК. Например Просмотреть фильм 1. Повторите все шаги для изображения дополнительных ячеек.

3 Анализ эндоцитотических Dynamics по ручной проверки

Хотя руководство проверка КПК жизни значительно ограничены по количеству ККТ, которые могут быть обнаружены, она по-прежнему остается точное средство обнаружения Невзирая на глобальные изменения в изображения и обнаружения артефактов. Смотреть обсуждение для деталей.

  1. Откройте файл в ImageJ. Изображения сохраняются в виде единого стека файлы TIFF с перемежающихся каналов. Преобразование изображения в hyperstacks. К Image> Hyperstacks> Стек для HyperStack. Введите число каналов покупки (если изображений β-arrestin и μ-опиоидных рецепторов, введите 2), введите 1 для Z стека (TIRFM является одной плоскости), и количество кадров фильма (т.е. 10 мин фильм на 1 кадр каждые 3 секунды яс 200) в всплывающем окне.
  2. Формат HyperStack дает окно с двумя полосами прокрутки. Используйте верхнюю панель для перемещения по каналам и нижней части, чтобы перемещаться по времени. Прокрутка к каналу белка которого время жизни будет анализировали.
  3. Перемещение к кадру 10 или 15 фильма, чтобы уменьшить включение уже существующих ККТ, вся продолжительность не видны. Нарисуйте окно ROI вокруг пятна выбранного наугад.
  4. Подсчитайте количество кадров пятно видно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 3B и 3C примеры трех морфологических категорий эндоцитотических событий 10,11,16-19.

4 Анализ эндоцитотических Dynamics по объективным признанием

Задача распознавания позволяет обнаружить практически все отображаемого ККТ в клетке, но могут быть подвержены ошибкам за счет ложного обнаружения ошибочных структур. Смотреть обсуждение для деталей весом преимущества и недостатки еМетод ACH. Несколько программ, в том числе заказных алгоритмов, могут быть использованы для объективной обнаружить ККТ. Этот протокол описывает объективную признание ККТ с использованием Imaris, в программное обеспечение анализа изображений (см Материалы).

  1. Для начала откройте файл необработанного снимка в программе анализа изображений. По умолчанию, появляется объединенная цветное изображение. Используйте окно «Настройка дисплея", чтобы отрегулировать яркость канала. Нажмите на название канала для изменения отображаемого цвета. Снимите флажок на канал, чтобы предотвратить его дисплей (См рисунок 4А).
  2. Создание "Spots", нажав на иконку с оранжевыми пятнами. Смотрите рисунок 4B. Выберите области интереса (ROI) вокруг клетки. Смотрите рисунок 4C. Используйте ROI исключить области, которые будут неправильно обнаружить яркие передние кромки и бляшки. Проанализируйте несколько ячеек с различными уровнями экспрессии отдельно.
  3. Измерить диаметр пятна в PROVIде первоначальные оценки для алгоритма. Переключение в режим «Разрез», и нажмите на полярных концах месте, чтобы измерить его диаметр. Смотрите рисунок 4E. Делайте это в течение 4 или 5 круглых пятен, которые выглядят свидетельствует о КПК в разгар его стабильности, то после формирования и до разрыва. Используйте эти измерения для расчета среднего диаметра до ближайшей десятой доли микрона.
  4. Обнаружение пятен. Возврат в режим "превзойти". Выберите подходящий канал для обнаружения. Введите среднее измеренное диаметр, как правило, 0,3 или 0,4 мкм. Нажмите на синюю стрелку вперед для количественного определения пятна. Смотрите рисунок 4E. Если диаметр пятна недооценивается, паразитные точки флуоресценции будут определены как пятна. Если диаметр слишком велик, настоящие пятна будут проигнорированы. Когда не уверены, оценить чуть ниже, и отфильтровать неверные обнаружений позже.
  5. Фильтр пятна на качество. Отрегулируйте фильтр, чтобы захватить как много мест, как это возможно без спинкиземля. Фильтр Качество выбран по умолчанию 20. Смотрите рисунок 4F.
    1. Используйте кривую «Качество», в качестве руководства для установки соответствующего порога. Перемещение нижнего порога фильтра с левой кнопкой мыши, чтобы этот первый провал в кривой. Это хорошая отправная точка для фильтра, как эта позиция, как правило, уточняет определение к только видимых пятен. Смотрите рисунок 4F.
    2. Обнаруженные пятна появляются на фильме, как сферы или центра пикселей. С помощью вкладки "Colors", настроить цвет пятна на контрастного цвета, чтобы сделать его легче увидеть их. Прокрутка фильма пересмотреть мест в каждом кадре. Цель состоит в том, чтобы обнаружить, как много мест, как это возможно для полноты их жизни.
    3. Ликвидировать тусклые пятна или вручную соединить их в непрерывные треков позже, так как они не обнаружены хорошо через ходе своей жизни.
    4. Удалить яркие таблички с «Intensity» филтер, если требуется. Нажмите на зеленую плюс, чтобы добавить новый фильтр. Смотрите рисунок 4F. Создайте Intensity фильтр для фильтрации или уменьшения пятна заданной флуоресцентных сигналов. Используйте созданный Intensity кривую, (аналогично качества Curve обсуждается в 4,5), чтобы установить порог. Используйте левую кнопку мыши, чтобы удалить крайнюю левый конец кривой, которая представляет самые яркие пятна.
      Примечание: Большие бляшки структуры, как правило, среди ярких элементов в клетке, и они легко исключить с этим фильтром.
    5. Прокрутка фильма для того, чтобы ЦКА не обнаружено, как пятна и яркие бляшки больше не обнаружено. Рис 3D показана ячейка, где обнаружение ККТ (обозначается белыми сферах) был оптимизирован с качеством фильтра и бляшки были исключены с качеством фильтр.
    6. Уменьшите яркие края ячейки с качеством фильтра. Яркие объекты, возможно, нужно удалить вручную, на следующем этапе. Продолжить с голубойстрелка.
    7. Удалить аномальные пятна на экране Edit пятен. Перейти к "Выбрать" режим. Нажмите на месте. Это станет желтой. Нажмите кнопку "Delete". Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжать строить алгоритм. Смотрите рисунок 4G.
  6. Мера треков. Установите песни в "броуновское движение". КПК должен не наблюдается никакого направленное движение, только минимальный дрейф через плазматическую мембрану. Этот алгоритм является наиболее подходящим для этого движения. Смотрите рисунок 4Н.
    1. Установите Максимальное расстояние до небольшой величины, такие как 0,7 мкм. Смотрите рисунок 4Н.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установка на небольшое расстояние минимизирует подключение соседних пятен и еще позволяет продолжать отслеживание пятна клеток через КПК или клеточного движения.
    2. Установите Макс Gap Размер до 1, что позволяет дорожку, чтобы продолжить, если есть только один кадр отсутствует подряд. Нажмите на синюю стрелку, чтобы вычислить следы. Смотрите рисунок 4Н.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Gп. размеры более 3 причин различных треков, которые будут неправильно соединены.
    3. Переключить трек просмотра в "Dragon Tail.» Прокрутка фильма наблюдения качества обнаружения. Если соседние пятна находятся на стадии подключения, уменьшить Максимальное расстояние ниже 0,7 мкм. Если пятна нарушаются слишком легко, увеличить Макс Gap Размер. Нажмите на синюю стрелку, чтобы создать треки. Это приводит к экрану фильтр треков. Смотрите рисунок 4Н.
  7. Фильтр треков и экспорта данных. Используйте «интенсивность» фильтр для удаления дополнительных ярких бляшки. Используйте «смещения», фильтр для удаления эндосомы, что выйти на поле TIRF. Будьте осторожны, так как длинные Пятна будет иметь больше перемещений, а также. Нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить работу над протоколом. Смотрите рисунок 4I.
    1. Используйте вкладку Edit Tracks, с значок карандаша, чтобы удалить ошибочного определения треков, которые не могут быть удалены с помощью фильтров. Проверьте DISCONTinuities или ложные соединения. Для соединения двух треков, выберите их с помощью Ctrl-Left-Click, нажмите "Connect" в окне редактирования треков. Чтобы отключить треки в отдельных пятен, выберите трек и нажмите "Отключить". Выберите несколько пятен с Ctrl + Left-Click и нажмите "Connect", чтобы создать новый трек. Метод является одинаковым для редактирования роликов, описанных в 4.5.7. Смотрите рисунок 4J.
    2. Для экспорта данных, перейдите на вкладку статистики. Кликните на одной иконе дискеты экспортировать выбранной статистики. Нажмите на иконку, которая выглядит как серия дискет для экспорта всех статистических данных. "Длительность записи" статистика содержит длину эндоцитотических треков. Смотрите рисунок 4K.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование живых клеток TIRF микроскопии мы записали эндоцитотического динамику μ-опиоидных-рецептора (МЖД), G-белком рецептор (GPCR) и его эндоцитотический адаптер белок β-arrestin. Β-arrestin конструкцию временно трансфицировали в клетки, стабильно экспрессирующие линии MOR, используя протокол, описанной на фигуре 1, и отображаемого 96 ч позже. MOR в стабильной клеточной линии является N-терминальной помечены с рН-чувствительной GFP. Этот флуоресцентный белок флуоресцирует только в нейтральной внек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем использование TIRFM визуализировать клатрином опосредованный эндоцитоз (CME) на уровне индивидуальной ККТ в живых клетках в реальном времени. CME является быстрым и очень динамичным событием посредничестве кумулятивного эффекта многие пространстве и во времени отдельных индивидуальных событий. Большинство анализов, которые в настоящее время используются, такие как биохимических измерений интернализации с использованием поверхности биотинилирование или связывание лиганда, проточной цитометрии или фиксиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить докторов К. Шалински, Х. Тенга и М. Брухеза за помощь с Имарисом, Р. Вистейна и Д. Шиварски за техническую помощь и советы, а также д-ра М. фон Застрова, д-ра Т. Кирххаузена, д-ра Д. Друбина и д-ра В. Алмерса за реактивы и полезную дискуссию. Финансирование, предоставленное грантом T32, NS007433 SLB и NIH DA024698 и DA036086 MAP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/High Glucose с L-глутамином и пируватом натрияFisher Scientific 
Фосфатно-солевой буфер (DPBS), без кальция, без магнияGibco, от Life Technologies21600-010
EDTA Free AcidAmresco0322-500G
Фетальная бычья сывороткаGibco, от Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, без фенола красногоGibco, от Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, от Life Technologies
HEPESCellPURE от Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425реагент для трансфекции
25 мм покровное стеклоFisherScientific 12-545-86
Колбы, обработанные культурой клеток Corning, 25 см<суп>2Fisher Scientific10-126-28
Клеточная культура 6-луночный планшетGreiner Bio-One, по VWR82050-896
Моноклональный ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin ацетатная соль (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Набордля мечения белкаLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Программное обеспечение для анализа изображенийBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, для автоматизированного анализа
инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti и необходимые аксессуары, включая фильтрующие кубы и фильтрыNikon
TIRF arm с необходимыми адаптерами для Nikon Eclipse TiNikonДля регулировки угла падения
фотоаппарата iXon+ EMCCD и адаптеровAndor
SH3024301

Ссылки

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Клатрин-опосредованные эндоцитозные ямкифлуоресцентная микроскопияанализ изображенийвизуализация живых клетокдинамика эндоцитозасостав переносимых молекул
Визуализация клатрином эндоцитоза из G-белками в Single-событий резолюции через TIRF микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.