Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Zusammenfassung

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Zusammenfassung

Die meisten morphogenetische Prozesse in der fetalen Darm haben von Dünnschnitten von fixierten Gewebe entnommen worden, die Bereitstellung Schnappschüsse von Veränderungen über die Entwicklungsstadien. Dreidimensionale Informationen aus dünnen Serienschnitten kann eine Herausforderung sein, wegen der Schwierigkeit der Rekonstruktion Serienschnitte perfekt und die Aufrechterhaltung der richtigen Ausrichtung des Gewebes über Serienschnitte zu interpretieren. Jüngsten Erkenntnisse Grosse et al., 2011, die Bedeutung der dreidimensionalen Informationen für das Verständnis der Morphogenese der Entwicklungs Zotten des Darms ^1. Dreidimensionale Rekonstruktion des einfach markierten Darmzellen zeigte, dass die Mehrheit der intestinalen Epithelzellen treten sowohl die apikale und basale Oberflächen. Weiterhin dreidimensionale Rekonstruktion des Aktin an der apikalen Oberfläche des Epithels zeigte, dass die Darmlumen kontinuierlich ist und dass die sekundäre Lumen ein Artefakt sectioning. Diese zwei Punkte, zusammen mit dem Nachweis der interkinetic Kernwanderung im Darmepithel, definiert die Entwicklungs Darmepithel als mehrreihigen Epithel und nicht wie bisher angenommen geschichtete ^1. Die Fähigkeit, das Epithel dreidimensional beobachten war wegweisend für demonstriert diesen Punkt und die Neudefinition epithelialen Morphogenese in der fetalen Darm. Mit der Entwicklung der Mehrphotonen-Bildgebungstechnik und dreidimensionale Rekonstruktionssoftware, die Fähigkeit zu visualisieren intakt Entwicklungsorgane rasch verbessert. Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht weniger schädliches Eindringen tiefer in Gewebe mit hoher Auflösung. Zwei-Photon-Imaging und 3D-Rekonstruktion der gesamten fötalen Mausdarm in Walton et al., 2012, half, das Muster der Zotten Auswuchs ² definieren. Hier beschreiben wir eine ganze Organkultursystem, das ex vivo Entwicklung der Zotten und Erweiterungen dieser Kultur-System ermöglicht, damitder Darm dreidimensional in ihrer Entwicklung dargestellt werden.

Einleitung

Jeder Darmzotten besteht aus zwei Hauptgewebekompartimenten: einer epithelialen Oberflächenschicht und einem mesenchymalen Kern. Der Dünndarm der Maus wird am embryonalen Tag 10 gebildet, wenn sich eine Endodermschicht schließt und zu einer Epithelröhre versiegelt, die von mesenchymalen Zellen umgeben ist³. Diese flache Epithelröhre durchläuft eine schnelle Proliferation, wächst sowohl in der Länge als auch im Umfang und erfährt dramatische Umlagerungen, die mit dynamischen Veränderungen der Zellform einhergehen¹. Gleichzeitig durchläuft das umgebende Mesenchym auch viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Bildung des Gefäßplexus, der Diffe....

Protokoll

HINWEIS: Alle Mäuse wurden mit human Protokolle, die von der University of Michigan Medical School Einheit für Labortiermedizin zugelassen und nach den Richtlinien der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren behandelt.

1. Vollorgankultursystem

1. Herstellung der Medien und Kulturplatten
   1. In einer Gewebekultur Haube, entfernen 5 ml BGJb Medien aus der Flasche und 5 ml Pen / Strep. Bereiten Sie einen Arbeitsvorrat von Medien in einem 50 ml konischen Röhrchen, durch Zugabe von 1 ml 5 mg / ml Ascorbinsäure bis 49 ml BGJb Medien (mit Pen / Strep).
   2. Bereiten Sie eine 6-Loch-Kulturplatte durch Zugabe von ....

Ergebnisse

Kultur ganzer fötaler Explantate Darm ermöglicht die Analyse der Lage, die Verteilung, und die Dauer der Signalmoleküle, die Darmentwicklung zu koordinieren, da dieses System ermöglicht die Bearbeitung der Signalisierungs pharmakologische Reagenzien oder rekombinante Proteine. Die Transwell-Kultursystem (1A, von Walton et al wiedergegeben., 2012) ² stellt ein Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle, die es ermöglicht, Wirkstoff-oder Protein getränkt Agarosekügelchen auf das Gewebe zu platzie.......

Diskussion

Die Dynamik und komplexe Gewebe-Wechselwirkungen der Entwicklungs Darm erfordert 3D-Visualisierung, um eine volle Anerkennung dieser morphogenetischen Ereignisse. Mit der Entwicklung der Imaging-Technologie, die Fähigkeit villus Morphogenese im Detail entwickelt / verbessert und mit ihr wird das Verständnis der räumlichen Kommunikation und Interaktion während der Organogenese stark verbessert zu prüfen.

Alternative Methoden zur Kultivierung ganze Darm wurden auch getestet worden, aber die Tr.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Feine Präparierzange	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11254-20	2 Paar
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6-Well-Platten	Costar	3516
24-Well-Platten	Costar	3524
Petrischalen 60 x 15 mm	Falcon
Transwell-Platten, 24 mm Einsätze, 8,0 mm Polycarbonat-Membranen	Corning Costar	3428	6 Einsätze pro Platte
BGJb Medien	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10.000 U/ml Penicillin; 10.000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbinsäure	Sigma	A0278	5 mg/ml Brühe herstellen, filtrieren, aliquotieren und bei -20 &° lagern; C
Mundpipette (Drummond 1-15 Zoll Absaugrohrbaugruppe)	Fisher	21-180-10	Entfernen Sie die Absaugbaugruppe und ersetzen Sie sie durch eine 1.000 µ l Pipettenspitze, die als Adapter zum Einstecken einer 6-Zoll-Pasteur-Glaspipette dient.
6-Zoll-Glaspasteurpipetten
Kapillarrohre	World Precision Instruments	TW100F-4	Ziehnadeln
4% Paraformaldehyd			hergestellt in 1 x PBS, pH bis 7,3
Kulturplatten	Falcon
Feinmaschiges Edelstahlsieb	kaufen im Baumarkt
Polycarbonat-Membranen	Thomas wissenschaftlich	4663H25	alternativ, schneiden Sie Corning Costar 3428 Membranen von Transwell-Stützen
Sofortkleberkauf	im Baumarkt Gel	basierend vorzugsweise
35 x 10 mm	Platten Falcon
7% agarose	Sigma	A9414	Vorbereitung w/v in 1x DPBS, Erhitzen zum Auflösen in einem Wasserbad
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenolrot freie Medien (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazin (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	Basalmembranmatrix, Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei
3-4% Agarose	Sigma	A9414	vorbereiten w/v in 1x DPBS, Erhitzen, um sich in einem Wasserbad aufzulösen
Bildgebung des festen Darms
Name des Materials/Ausrüstung	Firma	Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
Vaseline	Kauf in der Apotheke		zur Herstellung von VALAP verwendet: gleiche Teile Vaseline, Lanolin, Paraffin,
Lanolin	Sigma	L7387	zur Herstellung von VALAP: zu gleichen Teilen Vaseline, Lanolin, Paraffin
, Paraffin	Surgipath	39601006	zur Herstellung von VALAP: zu gleichen Teilen Vaseline, Lanolin, Paraffin
70% Glycerin in 1 x PBS
Focus Clear und Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modelliermasse	kaufen im Kunstbedarfsgeschäft
Doppelklebeband
Wattestäbchen
Kunststoffformen, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
Dias
Deckgläser
Labortuch	Kimberly Clark	34155	fusselfreies Tuch für zarte Aufgaben
Theiler Staging Chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ Downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X Konfokalmikroskop	Leica		Wird für die Durchführung der Live-Bildgebung verwendet
Leica DMI 6000 Standfuß	Leica		Wird für die Durchführung der Live-Bildgebung verwendet
Wässriges Einbettmedium (Prolong Gold)	Molekulare Sonden	P36930
Name des Materials/der Ausrüstung	Firma	Katalognummer	Kommentare/Beschreibung
24-Well-Platte	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	zur Herstellung von Permeabilisierungslösung: 0,5 % Triton X-100 in 1 x PBS
Ziegenserum			zur Herstellung von Blockierungslösung: 4 % Ziegenserum, 0,1 % Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	Nr. P9416

451007353037 ab 351008