Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.
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Articolo metodologico
Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare il tridimensionale (3D), morfologia e struttura cellulare dei tessuti polipo che comprende la costruzione di coralli dei Caraibi barriera corallina Montastraea annularis e M. faveolata. Questi approcci includono microscopia a fluorescenza (FM), blocco di serie faccia di imaging (SBFI), e due fotoni laser microscopio confocale a scansione (TPLSM). SBFI fornisce l'imaging dei tessuti profondi dopo il sezionamento fisico; dettaglia la struttura della superficie del tessuto e la visualizzazione 3D per profondità tissutali di più di 2 mm. FM complementare e resa TPLSM immagini ad altissima risoluzione della struttura cellulare dei tessuti. I risultati sono: (1) identificato precedentemente non dichiarata morfologie del tessuto lobate sulla parete esterna dei singoli polipi corallini e (2) ha creato le prime mappe superficiali della distribuzione e del tessuto 3D densità di cromatofori e endosimbionti dinoflagellato alghe zooxantelle-like. Pisello assorbimento spettraleks di 500 nm e 675 nm, rispettivamente suggeriscono che M. annularis e M. faveolata contiene tipi simili di clorofilla e cromatofori. Tuttavia, M. annularis e M. faveolata presentano differenze significative nella densità dei tessuti e la distribuzione 3D di questi componenti cellulari fondamentali. Questo studio incentrato sui metodi di imaging indica che SBFI è estremamente utile per l'analisi di campioni di grandi dimensioni mm scala di tessuti di corallo decalcificata. FM gratuito e TPLSM rivelano sottili cambiamenti di scala submillimeter nella distribuzione cellulare e la densità in campioni di tessuto del corallo nondecalcified. La tecnica TPLSM offre: (1) la preparazione minimamente invasiva del campione, (2) la capacità sezionamento ottico superiore, e (3) l'assorbimento della luce minima e dispersione, pur permettendo l'imaging dei tessuti profondi.
Introduzione
Il riscaldamento globale e di accompagnamento cambiamenti ambientali stanno interessando direttamente la salute e la distribuzione dei coralli tropicali marini 1-4. Sono stati osservati effetti multipli, tra cui sbiancamento dei coralli e la comparsa di malattie infettive 5-6. Tuttavia, la previsione più accurata della futura risposta corallo a queste minacce ambientali richiede che una "linea di base" istologica essere stabilito, che definisce la morfologia dei tessuti e la composizione delle cellule e la distribuzione dei coralli "apparentemente sani". A sua volta, "influenzati" coralli possono quindi essere confrontati quantitativamente. Inol....
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Protocollo
NOTA: I reagenti devono essere preparati per Serial Block Volto Imaging di Coral Campioni
1 Preinfiltration Cera
- Sciogliere 3,6 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro. Mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C).
- Aggiungere 400 mg di Sudan IV (per ridurre al minimo la cera fluorescenza di fondo). Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso.
- Aggiungere 96 ml di paraffina fusa a caldo (100%) e mescolare bene.
1.2) Embedding Wax
- Sciogliere 7,2 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro e mescolare bene su una piastra ca....
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Risultati
Un apparato SBFI progettato su misura (realizzato appositamente per il presente studio, Figura 3) ha prodotto le prime dettagliate mappe 3D digitali di elevazione (DEM) della struttura della superficie esterna e la morfologia del M. annularis e M. polipi corallini faveolature (Figura 4 e SI Video 1-2). Questo ha prodotto immagini di lobi sovrapposti precedentemente non descritta di tessuto del corallo concentrica irradia verso l'esterno dal ce.......
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Discussione
Ricerca barriera corallina è uno sforzo di ricerca fortemente interdisciplinare, che coinvolge l'analisi della simultanea fisiche, chimiche e fenomeni biologici che operano in ambiente marino. Lo studio di complessi ecosistemi delle barriere coralline è quindi meglio completata entro un 'Powers of Ten' quadro contestuale (Figura 10). Questa grafica compilation dimostra che l'ecosistema corallo copre una vasta gamma di dimensioni spaziali (10 -9 a 10 5 m). Inoltre, q.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Donna Epps, istologa presso l'Istituto di Biologia Genomica, Università dell'Illinois Urbana-Champaign (UIUC), per la sua capace assistenza tecnica nella preparazione e nel sezionamento dei campioni. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di ricerca a B.W. Fouke dall'Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). Inoltre, C.A.H. Miller ha ricevuto sovvenzioni dalla Wanless Fellowship del Dipartimento di Geologia dell'UIUC, dal fondo Leighton del Dipartimento di Geologia dell'UIUC e dal fondo per il lavoro sul campo del Dipartimento di Geologia Roscoe Jackson dell'UIUC. Le interpretazioni presentate in questo manoscritto sono quelle degli autori e potre....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scheletro | 2,5 cm Biopsia da habitat naturale | ||
| Dispositivo di carotaggio ad arco | C.S. Osborne e società | n. 149 | Per la raccolta di biopsie di corallo |
| Microscopia elettronica Paraformaldeide | Scienze | RT 15700 | 16% Scienze |
| microscopia elettronica | Histoclear/Safeclear II | 64111-04 | Alternativa non tossica allo xilene, disidratazione e deparafinizzazione |
| Xilene ed etanolo | Fisher Scientific | Cera | |
| di paraffina | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Soluzione di infiltrazione |
| Vybar | The Candle Maker | Componente della cera rossa | |
| Stearina | The Candle Maker | Componente della cera rossa | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Cera rossa-sfondo opaco |
| Agglutinina di germe di grano (WGA) | Life Technologies | W32466 | Per l'etichettatura Il muco di corallo |
| prolunga la vita dell'oro | Tecnologie | P36095 | Mezzi di montaggio anti-sbiadimento |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | Per l'imaging a due fotoni |
| Motore, driver e controller XY | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Movimento traslazionale |
| Corning | DC-220 | Fusione di tutta la cera | |
| Forno a convezione | Yamato | DX-600 | infiltrazione e inclusione |
| Leica | ASP 300 | Disidratazione, microtomo per infiltrazione | |
| Leica | RM2055 | Coltelli monouso | |
| Stereomicroscopio | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Microscopio a |
| fluorescenza con ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, Sistema ApoTome I | Imaging sezione sottile di un polipo: Zooxantelle |
| Fotocamera Axiocam | Carl Zeiss | MRm | Fotocamera monocromatica 1388x1040 pixel |
| Software Axiovision Carl | Zeiss | Versione 4.8 | Programma di acquisizione immagini |
| Spettrofisico laser a due fotoni | Maitai eHP, laser pulsato (70 fs) | Con modulo DeepSee | |
| Microscopio a scansione laser | Carl Zeiss | LSM 710 con rivelatore spettrale | Rilevamento PMT a 34 canali |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 o superiore | per l'acquisizione di immagini spettrali e a due fotoni |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Versione 7.0 o superiore | Volume 3D, Iso-surface Rendering, Visualizzazione |
Riferimenti
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B.
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Ristampe e permessi
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