Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بالغليكوزيل هو بروتين آخر متعدية التعديل الضروري، والمساهمة في الفيزيولوجيا العضوي، علم أمراض الأنسجة، والاعتراف الخلوي 1-3. على الرغم من التقدم الكبير في glycoscience التحليلي، تميز التنوع الكامل للglycans على بروتين معين لا يزال مهمة صعبة للغاية، خصوصا على البروتينات المعزولة من المصادر البيولوجية الأولية. ومع ذلك، فإن microheterogeneity من glycans سكري يؤثر كثيرا تفاعلات وظيفية مع بروتينات أخرى. لذا، وتوصيف التنوع غليكان ضروري لفهم مغزى الفسيولوجية الخلوية والأنسجة بالغليكوزيل 4،5. من أجل فهم مساهمة سكري بالغليكوزيل لعلم وظائف الأعضاء والأنسجة الفيزيولوجيا المرضية وقوية وحساسة، والتقنيات التحليلية glycomic شاملة أصبحت ذات أهمية متزايدة. في تحليل البروتين، وتتحقق التعرف البروتين عموما LC-MSتحليل / MS من الببتيدات زيتية 6. يمكن أن يتم هضم البروتين من استخدام البروتين أو البروتينات المنقى حلها بواسطة SDS-PAGE التالية في جل الهضم مع البروتياز مثل التربسين 7-9. قبل التخصيب للخليط البروتين بواسطة SDS-PAGE يعزز من عمق ودقة ID البروتين. تطوير استراتيجيات مماثلة لتحليل glycomic من بروتين سكري بالغليكوزيل تكمن في طليعة glycoscience.

وتعلق الطبقات الكبرى اثنين من glycans العمود الفقرى للبروتين إما من خلال N-O-الربط أو الربط. وتعلق glycans N-مرتبطة الأسباراجين (الأسباراجين) وجدت بقايا كجزء من sequon يعرف الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية / السيستئين (X هو أي الأحماض الأمينية إلا البرولين)، ويمكن أن تنطلق من الهضم الأنزيمي مع peptide- N -glycanase (PNGaseF أو A)، إما في الحل، في هلام، أو على لطخة 10-12. وترد glycans مرتبطة أساسا ليا سيرين (سر) أو ثريونين (THR) المخلفات. ومع ذلك، فقد تم الاتساع إنزيم واحد فقطtified التي هي قادرة على اطلاق سراح glycans مرتبطة يا من بروتين سكري ولها خصوصية غليكان محدودة للغاية، والإفراج فقط أبسط glycans مرتبطة الإخراج. تبقى استراتيجيات الإفراج الكيميائية الأسلوب المفضل لإطلاق شامل للglycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية. الاختزالية أو غير الاختزالية β-القضاء، أو hydrazinolysis وتقنيات الافراج كيميائية تتميز كذلك وحاليا الأكثر شيوعا نهج لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية 13،14. على الرغم من التخفيض β-القضاء قد استخدمت لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية مفصولة SDS-PAGE، النهج السابقة تقتضي الفصل HPLC لتحليلها لاحقا 15-17.

يوفر متعدد الأبعاد MS (MS ن) التحليل حاليا أغنى مصدر البيانات الهيكلية للتميز glycans صدر من بروتينات سكرية معزولة في المبالغ المتوقعة من معظم المصادر البيولوجية. عمق MSوالتوصيف الهيكلي المستندة سهلت كثيرا permethylating وglycans صدر قبل تحليلها. Permethylation يعزز التأين ويميل إلى معادلة ردود إشارة المولي عبر مجموعة واسعة من الهياكل غليكان 18،19. بالإضافة إلى ذلك، permethylation الكلمات بشكل لا لبس فيه الأنصاف أحادي السكاريد الطرفية واستبداله مع الجماهير مميزة، وبالتالي تعزيز توضيح الهيكلي 20-23. على سبيل المثال، glycans الحمضية يصعب عادة للكشف عن الأنواع غير permethylated التي كتبها MS. على الرغم من glycans الحمضية يمكن اكتشافه في وضع الأيونات السالبة التي كتبها MS، فإنه من المستحيل للكشف عن كل من glycans الحمضية ومحايدة في وضع ايون نفسه. والميزة الرئيسية لpermethylation غليكان هي التي سيتم توج كل من مجموعات الهيدروكسيل مجانية (OH) على بدائل أحادي السكاريد وغليكان مع مجموعة الميثيل (OCH 3 أو OME)، وبذلك يتم تحييد التهم لغليكان sialylated، وجعلها كما كشفها كما permethylated محايد (آسيالو) glycans. ومع ذلك، فإن الهيدروكسيل من الأنصاف سلفات على sulfoglycans تقاوم permethylation، مما أدى إلى الإبقاء على تهمة أنيوني، الذي يقمع التأين ويقلل الحساسية. هذا القمع يمنع حاليا glycomic تحليل شامل للبروتينات سكرية معقدة جدا مثل mucins، التي تحمل فرة عالية من glycans مكبرت 24-26.

التقارير الأخيرة على تنقية مكبرت glycans استخدمت اتهم، عكس المرحلة اللوني لتنقية وglycans permethylated منفصلة قبل تحليل MALDI. تعتمد هذه الطريقة على الفصل التام بين glycans مكبرت وغير مكبرت باستخدام مراحل النقالة المختلفة للشطف، والتي وجدنا أن تكون أقل صرامة من مرحلة التقسيم العضوي. وبالتالي، يتم عرض تقنيات جديدة مناسبة للكشف وإثراء sulfoglycans هنا. هذه التقنيات تسمح لاسترداد الكمي للglycans مكبرت في المرحلة المائية التالية الماء: • قرار مجلس الوزراء (ثنائي كلورو ميثان)استخراج، والتي تتم بشكل روتيني في نهاية التفاعلات permethylation غليكان 27. الأهم من ذلك، هذا الفصل قوي من sulfoglycans permethylated من خليط من permethylated glycans غير مكبرت يثري متزامنة للأنواع مشحونة مع تبسيط MS 2 أنماط التجزئة. ويرد أيضا على بروتوكول شامل لتحسين مرتبطة يا التحليل غليكان في هلام. تحسن بروتوكول يعزز الانتعاش غليكان، ويزيد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال الهيكلية MS ن تحليل glycans permethylated، ويحسن حساسية التحليلات sulfoglycomic تطبيقها على بروتينات سكرية أساسية معزولة من مصادر بيولوجية.

ويهدف هذا البروتوكول لتحليل مرتبطة يا غليكان مقتطفات سكري بأكملها أو من بروتين سكري معين من الفائدة حلها بواسطة SDS-PAGE ويتكون من ثلاثة الإجراءات التجريبية. A) جل التنظيف، B) في جل التخفيض β-القضاء، وC) permethy غليكانlation. الهدف هو الحصول على بيانات شاملة مرتبطة يا glycomic عن بروتينات سكرية تحصد من المصادر الأولية من الفائدة البيولوجية (الشكل 1). وتصور البروتينات السكرية مفصولة SDS-PAGE من قبل تلطيخ ويتم استئصال عصابات من الفائدة وشرائح الناتجة الفرقة هلام الى قطع صغيرة. وdestained القطع جل وتعرض لغسيل خلات الإيثيل لإزالة الملوثات هلام (الشكل 2A). ويتحقق الإفراج غليكان من قبل في جل التخفيض β-القضاء (الشكل 2B) وpermethylated وglycans الافراج عنهم. استخراج مائي العضوي permethylation التالية أقسام كميا أنيوني مكبرت glycans بعيدا عن glycans محايدة غير مكبرت (الشكل 2C). في جل التخفيض β-القضاء إلى جانب استخراج مائي العضوي يمكن توصيف glycans مرتبطة يا وsulfoglycans صدر من كميات صغيرة من بروتين سكري مفصولة SDS-PAGE. نظرة عامة على الاستراتيجية هي summariوتظهر زيد في الشكل 1 والتفاصيل في الشكل (2). وبالإضافة إلى ذلك، جزء من القطع هلام destained وغسلها يمكن استخدامها لمعرف البروتين من خلال تقنيات البروتين LC-MS / MS القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: مختبر مخاوف الأمان

تمشيا مع أفضل الممارسات المختبرية القياسية، نلاحظ ما يلي. تخزين جميع المذيبات العضوية في المواقع المناسبة. إبقاء جميع مواد النفايات في حاويات النفايات الكيميائية مع وضع العلامات واضحة على التراكيب الكيميائية. عن العديد من الكواشف المستخدمة في هذه البروتوكولات المسرطنة المحتملة أو توليد الغازات القابلة للاحتراق المتقلبة، والتعامل مع جميع الكواشف في غطاء الدخان مع التهوية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية مثل القفازات، معطف المختبر، وحماية العين عند العمل مع المذيبات العضوية.

الشكل 1
الشكل 1. إجراءات في جل O-glycomics. يتم حلها (A) البروتينات ذات الاهتمام من قبل SDS-PAGE، من خلال الكشف عن الإجراءات تلطيخ المناسبة (Coomassie أو الفضة)، ورفعه. وقطع شرائح هلام رفعهإلى مكعبات صغيرة، destained، وغسلها مع خلات الإيثيل للحد من الملوثات التي تتداخل مع تحليل لاحق MS. جزء من شريحة الجل يمكن أن تكون محفوظة لفي جل الهضم زيتية وتوصيف بروتيوميك لاحق من قبل LC-MS / MS. وصدر (ب) glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية تحلها في جل التخفيض β-القضاء. وتشمل الخطوات الأساسية تحلية وإزالة بورات من قبل حالة الأيزوتروب مع الميثانول. (C) glycans الصادرة عن التخفيض β-القضاء يا مرتبط وpermethylated وتقسيم لاحقا في المراحل المائية والعضوية. وعثرت Sulfoglycans كميا في (مائي) المرحلة العليا بينما glycans محايدة وsialylated التقسيم في الدنيا (DCM) طبقة.

الرقم 2
الشكل 2. تفاصيل الرسم البياني لفي جل glycomics. كل التجربهتل خطوة هو مبين في الشكل (1) ويتضح بشكل فردي. (A) جل destaining واستخراج EtOAc، (ب) مباشرة في جل التخفيض β-القضاء للإفراج غليكان المرتبطة O، و (C) permethylation ومرحلة التقسيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. جل الختان وإزالة الملوثات جل المشتقة

  1. قبل البدء في الإجراء، وإعداد المواد الكيميائية والمواد الكيميائية المدرجة في قائمة المواد.
  2. حل البروتين على جل SDS-PAGE باستخدام أنظمة عازلة تريس، جليكاين القياسية. وصمة عار حل البروتينات مع أي Coomassie بريليانت الأزرق أو الفضة وصمة عار. بشكل عام، والانتعاش من glycans مرتبطة يا من فضة ملطخة المواد الهلامية ما يقرب من 80-90٪ من الانتعاش يتحقق من Coomassie ملطخة المواد الهلامية.
  3. بعد الكهربائي، ووضع الجل على طبق من الزجاج والمكوس رانه المنطقة ذات الاهتمام باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة نظيفة.
  4. لزيادة العائد من O-glycans، ونقل الفرقة جل الاهتمام على لوحة زجاجية أخرى وقطع قطعة هلام المستأصل إلى حوالي 2 مم مكعبات. تجنب الوقوع في قطع هلام أصغر من 1 مم مكعبات لأن انخفاض الانتعاش غليكان. نقل القطع هلام صغيرة إلى رأس المسمار أنبوب زجاجي (13 × 100 ملم) مع microspatula الفولاذ المقاوم للصدأ.
  5. إضافة 1 مل من 25 ملي بيكربونات الأمونيوم (AMBIC، NH 4 HCO 3) إلى أنبوب العينة، سقف أنبوب زجاجي مع غطاء رأس المسمار تفلون مبطنة، وتخلط بلطف عبها الأنبوب قبل السماح الوقوف لمدة 10 دقيقة. لا توظف الانفعالات قوية من أجل تجنب تمزيق القطع هلام.
  6. إزالة بعناية AMBIC من أنبوب زجاجي باستخدام ماصة باستير الزجاج أو ماصة مجهزة غيض من البلاستيك طويل خارج. تجنب تحطيم ونقل القطع الصغيرة هلام أثناء إزالة الحل AMBIC.
  7. إضافة 1 مل من أسيتونتريل (ACN) للأنبوب زجاجي، وكأب، وتخلط بلطف بواسطة أنبوب عبها قبل السماح الوقوف لمدة 10 دقيقة. تأكد من أن القطع هلام مغطاة تماما مع المذيب. إذا لزم الأمر، ودفع قطع هلام قبالة جدار الأنبوب وإلى المذيبات مع ماصة.
  8. ماصة قبالة ACN من أنبوب زجاجي وكرر الخطوات من 1،5-1،7 حتى يتم التخلص من اللون الأزرق مشرق. أكرر ما لا يقل عن خمسة متتابعة يغسل AMBIC / ACN إذا لزم الأمر. للفضة ملطخة المواد الهلامية، استخدام عدة يزيل اللون. انتقل إلى الخطوة التالية عندما قطعة هلام يتحول في حين الأبيض بشكل موحد في ACN.
  9. ماصة إيقاف أي السائل من أنبوب زجاجي، خلاصة الأنبوب، إضافة 1 مل من AMBIC واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة AMBIC وإضافة 2 مل من خلات الإيثيل (EtOAc) إلى أنبوب زجاجي. خلاصة أنبوب مع غطاء تفلون مبطنة ومكان في 4 درجات مئوية خلال الليل مع نهاية الإفراط في نهاية التحريض أو بدلا من ذلك إجراء ثلاث يغسل EtOAc في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لكل منهما. ويعد غسل EtOAc، وأكثر كفاءة في إزالة الملوثات.
  11. نقلوEtOAc النهائي يغسل ثلاث غسلات وأداء كل منها 2 مل من H 2 O. سوف الإزالة الكاملة للEtOAc ضمان التخفيض رد فعل قوي β-القضاء.
  12. ماصة من H 2 O ويذوى هلام عن طريق الغسيل مرة واحدة مع 1 مل من ACN.
    ملاحظة: بعد التجفيف، والمواد الهلامية المجففة جاهزة للفي جل β-القضاء. ويمكن تخزين قطع هلام المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  13. إيقاف عملية الغسيل في أي خطوة وتخزين القطع هلام في 4 درجات مئوية خلال الليل، بغض النظر عن أي عازلة أو حل يتم تطبيقها على هلام (AMBIC، ACN، H 2 O). إعادة تشغيل إعداد العينة في أي وقت خلال الأيام القادمة 2.
  14. استخدام جزء من القطع هلام destained والمجففة لمعرف البروتين النهج البروتين القياسية.

2. في جل الإصدار-O غليكان قبل التخفيض β-القضاء

  1. إعداد محلول المخزون من 1 هيدروكسيد الصوديوم M (هيدروكسيد الصوديوم) باستخدام 50٪ هيدروكسيد الصوديوم أو هيدروكسيد الصوديوم الصلبة تخزين وعند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. أخذ 5.2 مل من 50٪ هيدروكسيد الصوديوم (أو 4 غرام من هيدروكسيد الصوديوم الصلبة) وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل لجعل 1 M هيدروكسيد الصوديوم الحل. تمييع الحل الأسهم 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر دون فقدان الكفاءة في التفاعلات β-القضاء الاختزالية.
  • جعل 2 M بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4) في 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم. حل 38 ملغ من NaBH 4 في 0.5 مل من 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم. عموما، استخدام 0،5-1،0 مل من محلول بوروهيدريد لكل عينة. تختلف حجم محلول التفاعل على كمية من القطع هلام المجففة أعدت في الخطوة 1. نتوقع أن تستخدم 0.5 مل من محلول بوروهيدريد لمدة 1-2 قطع هلام رفعه (الخطوة 1.3).
  • إضافة 500 ميكرولتر من 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم إلى قطع هلام المجففة واسمحوا الوقوف لمدة 3-5 دقيقة على الجليد لكي تتوازن الجل على الشروط الأساسية التي تعزز الانتعاش غليكان.
  • إضافة 500 ميكرولتر من 2 M NaBH 4 في 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم، مما يؤدي إلى تركيزات النهائية من 1 M NaBH
  • خلال الساعة الأولى من الحضانة، مزيج بلطف أنبوب كل 15 دقيقة. تجنب الانفعالات القوية، لأنه قد تفتيت قطع هلام. أداء رد فعل في حاضنة معايرتها بشكل جيد / الفرن أو في كتلة التدفئة. تأكد من أن القطع هلام مغطاة مع محلول التفاعل.
  • وقف رد فعل عن طريق إزالة أنبوب عينة من الحاضنة أو كتلة التدفئة ووضعه على الجليد.
    ملاحظة: بعد السماح للرد فعل β-القضاء والمضي قدما لمدة 18 ساعة، يجب إجراء عملية تحلية في نفس اليوم.
  • 3. تحلية على الموجبة لتبادل اللوني

    1. مع الحفاظ على أنبوب العينة على الجليد لمنع تشكيل الحرارة المفرطة، إضافة ببطء 10٪ حامض الخليك (AcOH) قطرة قطرة لتحييد القاعدة. دوامة بلطف أنبوب عينة من بين الإضافات AcOH. كن حذرا لإضافة حمض ببطء وإسقاط الحكمة باسم additiعلى من الحمض وإنتاج "بركان" من الفقاعات. أجهزة الطرد المركزي أنبوب للقضاء على فقاعات ومنع امتداد، إذا لزم الأمر.
      1. من أجل إزالة كمية كبيرة من الصوديوم في خليط التفاعل، وتمرير خليط التفاعل من خلال عمود صغير الموجبة لتبادل (Dowex أو الراتنج AG-50W-X8، H + النموذج).
      2. غسل راتنج تبادل الأيونات الموجبة مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك M 1 قبل استخدامها وذلك لإزالة الملوثات التي تتداخل مع تحليل MS، حتى لو كان هو من الراتنج الصف التحليلية.
      3. نقع في الراتنج 1 M هيدروكسيد الصوديوم وإزالة حل عن طريق الترقيد. إضافة غير المتأينة المياه، وإزالة الماء، ثم يضاف 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    2. كرر هذه الخطوات حتى حل فوق الراتنج عديم اللون. غسل الراتنج تنظيفها بالماء منزوع الأيونات وتخزينها في 5٪ AcOH في 4 درجات مئوية.
    3. لجعل كوب صغير العمود، والصفر، وكسر غيض من الزجاج ماصة باستور باستخدام قطع السيراميك بحيث تفتق من طرف ماصة هو حوالي 1 سم طويل. ندف بعيدا المكونات من الصوف الزجاجي ودفع نحو الطرف تشكيل دعم للسرير الراتنج. تأمين العمود ماصة مع المشبك أو الغسيل ومكان على أنبوب اختبار زجاجي.
    4. غسل ماصة الفارغة مع 1 مل من الميثانول (MeOH) و 3 مل من 5٪ AcOH. دوامة H + Dowex أو AG50 تبادل الأيونات الموجبة راتنج الطين تخزينها في 5٪ AcOH ونقل ما يكفي من الطين لإنتاج حجم السرير 1 مل في العمود ماصة باستور.
    5. شطف العمود باستخدام خمسة مجلدات من 5٪ AcOH. تحقق تتدفق من خلال لظهور جزيئات الراتنج وعدم استخدام العمود إذا تم الكشف عن الراتنج.
    6. وضع عمود جديد خلال أنبوب زجاجي رأس المسمار (16 × 125 مم) والعينة الحمل. جمع التدفق من خلال وأزل glycans مع لا يقل عن 3 مجلدات من 5٪ AcOH في نفس الأنبوب.
    7. تغطية أنبوب مع بارافيلم وجعل فتحات صغيرة بإبرة. وضع أنبوب العينة في -80 درجة مئوية أو على الجليد الجاف. مرة المجمدة، تجفيف عينة بالتجفيد. تخزين المواد المجففة في -20 درجةC حتى الاستخدام.

    4. إزالة بورات

    1. إعداد 10٪ AcOH في MeOH. خذ 10 مل من حمض الخليك الجليدي وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل مع الميثانول. تخزين هذا الكاشف في زجاجة مع غطاء تفلون مبطنة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من 10٪ AcOH في MeOH إلى المجفف، مجفف بالتجميد أنبوب عينة ودوامة. إزالة الناتجة بورات ثلاثي ميثيل عن طريق التبخر تحت تيار N 2.
      ملاحظة: خلط الأملاح بورات مع الميثانول في ظل الظروف الحمضية تنتج بورات ثلاثي ميثيل وهو مركب متطاير.
    3. الجافة تحت N 2 تيار عند 37 درجة مئوية. بعد التجفيف، إضافة قسامة آخر من AcOH في MeOH كما هو موضح في الخطوة 4.2. تجفيف السائل لمدة 5 دقائق تحت النيتروجين (N 2) تيار عند 37 درجة مئوية.
      1. تكرار إعادة تعليق وتجفيف 3 مرات على الأقل. تخزين المواد المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    5. C18 النظيفة المتابعة

    1. تتوازن عمود C18 خرطوشة(حجم 1 مل، 100 ملغ الراتنج) باستخدام ثلاثة مجلدات من ACN وخمسة مجلدات من 5٪ AcOH. تسريع مرور الحلول توازنه من خلال تطبيق خفيف ضغط الهواء الإيجابي.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 5٪ إلى AcOH المحلاة وخالية من بورات أنبوب العينة وحل من قبل دوامة.
    3. تحميل عينة معلق على عمود C18 معايرتها وجمع من خلال تدفق في أنبوب زجاجي سقف المسمار (13 × 100 مم). أزل مع 3 مل من 5٪ AcOH في نفس أنبوب glycans-O.
    4. بارافيلم الأنبوب، وجعل ثقوب صغيرة بإبرة صغيرة أو استخدام غطاء مغلق فضفاضة مبطنة PTFE لتغطية الأنبوب، وتجميد العينة في -80 درجة مئوية أو على الجليد الجاف. إزالة المذيب بالتجفيد. تخزين العينة المجففة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    6. إعداد قاعدة للPermethylation

    ملاحظة: من أجل تحقيق permethylation قوية، وإعداد هيدروكسيد الصوديوم الطين الطازجة. جميع الأواني الزجاجية المستخدمة للتفاعلات permethylation يجب تنظيف على نطاق واسع.

    1. لإعداد قاعدة كاشف للpermethylation، إضافة 400 ميكرولتر من 50٪ هيدروكسيد الصوديوم إلى كوب نظيف المسمار أعلى أنبوب (13 × 100 مم). إضافة 800 ميكرولتر من MeOH اللامائية ودوامة.
    2. إضافة 4 مل من اللامائية سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ودوامة لتوليد راسب أبيض.
    3. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير راسب. ماصة قبالة طاف وتجاهل. إضافة 4 مل إضافية من DMSO اللامائية لبيليه. دوامة.
    4. كرر الخطوة 6.2 و 6.3 كحد أدنى من ثلاثة أضعاف أو حتى أي أشكال راسب أبيض.
    5. حل قاعدة مكعبات في 3 مل DMSO اللامائية وتخلط بلطف بواسطة pipetting صعودا ونزولا مع ماصة باستير نظيفة.
    6. استخدام قاعدة الفور للتفاعل permethylation التالية لأنه لا يمكن تخزينه.

    7. Permethylation من Glycans المفرج عنهم

    1. إضافة 200 ميكرولتر من DMSO اللامائية إلى عينة C18 تنقيته ودوامة أو يصوتن ل resuspend.
    2. إضافة 300 ميكرولتر من resuspانتهت قاعدة الطين لعينة وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من iodomethane (MEI). ختم أنبوب مع غطاء تفلون مبطنة ومزيج بقوة لمدة 5 دقائق قبل الدوامة.
    3. لوقف رد فعل permethylation، إضافة 2 مل من 5٪ AcOH على الجليد ودوامة. ماصة الحل صعودا وهبوطا 5 مرات للحد من حجم ما تبقى من مي عن طريق التبخر.
      ملاحظة: إن AcOH يحيد الحل وإزالة مي زيادة كفاءة استخراج glycans مكبرت إلى مرحلة المياه خلال مرحلة التقسيم.
    4. إضافة 2 مل من ثنائي كلورو ميثان (DCM) ودوامة. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لفصل المراحل المائية والعضوية.
    5. نقل الطبقة العليا (المرحلة المائية التي تحتوي على غالبية permethylated glycans مكبرت) في أنبوب زجاجي جديد (13 × 100 مم).
    6. إضافة 2 مل من H 2 O إلى مرحلة العضوية ودوامة. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 1 دقيقة لفصل المراحل المائية والعضوية والجمع بين هذه المرحلة المائية الثانية مع التنوبالحادي المرحلة المائية (الخطوة 7.5).
    7. كرر الخطوة 7.6 و 7.5 ثلاث مرات أكثر، لكن ليست هناك حاجة لانقاذ المراحل المائية الناتجة عن الأقسام التالية.
    8. إزالة الطبقة العلوية النهائية (المرحلة المائية) إلى أقصى حد ممكن من الطبقة السفلية (المرحلة العضوية) ونقل الطبقة السفلية (المرحلة العضوية) في أنبوب زجاجي جديد مستقل باستخدام نظيفة باستور ماصة.
    9. تجفيف المرحلة العضوية تحت N 2 تيار في 42 درجة مئوية.
    10. تغطية أنبوب مع بارافيلم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

    8. C18 تنظيف Permethylated مكبرت O-glycans من المرحلة مائي

    1. تتوازن عمود C18 خرطوشة مع ثلاثة مجلدات من ACN وخمسة مجلدات من 5٪ AcOH.
    2. تحميل المراحل المائية التي تم جمعها ومجتمعة من الخطوات 7.5 و 7.6 على العمود.
    3. يغسل العمود مع 10 مل من H 2 O للتحلية.
    4. أزل permethylated مكبرت يا glycans-في أنبوب زجاجي جديد مع 2 مل50٪ ACN. استخدام شطف إضافي بنسبة 85٪ حثيث لتعزيز الانتعاش من permethylated مكبرت O-glycans على يغوساكاريدس أكبر.
    5. eluates الجافة تحت دفق النيتروجين عند 42 درجة مئوية.
    6. تخزين المواد المجففة في -20 درجة مئوية تصل إلى 6 أشهر السابقة للتحليل MS.

    9. الطيف الكتلي من Permethylated O-glycans

    1. تحليل permethylated يا glycans عن طريق الحقن المباشر إلى مطياف الكتلة المناسب باستخدام مصدر nanoelectrospray بمعدل تدفق الحقنة من 0،40-0،60 ميكرولتر / دقيقة عند 210 درجة مئوية درجة الحرارة الشعرية. للتجزئة من قبل إدارة البحث الجنائي في MS / MS و MS ن من فخ أداة أيون، وتطبيق 30-40٪ من الطاقة الاصطدام.
    2. لوضع الأيونات السالبة، إعادة permethylated مكبرت O-glycans في 50 ميكرولتر من الميثانول / 2-بروبانول / 1-بروبانول / 13 ملي خلات الأمونيوم المائية (16: 3: 3: 2 من حيث الحجم). لوضع أيون إيجابي، وإعادة permethylated محايدة / sialylated O-glycans في 50 ميكرولتر من 1 ملم الصوديوم المائيةشي ده في الميثانول / الماء (1: 1).
    3. استخدام الخرائط إجمالي أيون (TIM) ومحايد فقدان الفحص (فحص NL) وظيفة من إصدار حزمة البرمجيات Xcalibur 2.0 لتحليل MSN إلى تميز الهياكل-O غليكان الفردية 13،19.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    تأثير خلات الإيثيل العلاج قبل في جل الاختزالية β-القضاء

    ويرد الطيف الكتلي تمثيلية من permethylated عينات غليكان مرتبطة يا صدر من الأبقار باستخدام الميوسين في جل التخفيض β-القضاء في الشكل 3، وغسل EtOAc من القطع الجل يزيل بشكل فعال SDS وpolyacryl الملوثات التي تتداخل مع تحليل لاحق MS 27.

    الرقم 3
    الشكل 3. خلات الإيثيل غسل هلام بولي أكريلاميد قطعة من قبل في جل التخفيض β-القضاء يعزز الكشف عن glycans الافراج عنهم. (A) دون غسل مع خلات الإيثيل، الطيف كتلة permethylated glycans مرتبطة يا أصدرته في جل β-التخلص من الميوسين تحت الفك السفلي البقري يهيمن عليها وفرة من polydisperse التعاونntaminant، الذي يحجب بالكامل تقريبا الإشارات MS المرتبطة glycans مرتبطة الإخراج. (ب) غسل قطعة هلام مع خلات الإيثيل يزيل القمم الملوثات، مما يتيح الكشف عن حساسية glycans. تعديل من كوماجاى 25.

    انتعاش مرتبطة يا غليكان هو أكبر من شرائح جل الصغيرة

    وأفرج عن glycans مرتبطة يا من تحت الفك البقري الميوسين قبل في جل التخفيض β-القضاء باستخدام قطع هلام التي إما شرائح صغيرة (~ 2 × 2 مم) أو كبيرة (~ 5 × 5 ملم). قطع هلام أصغر من لم عثرت ~ 2 × 2 مم بكفاءة من خلال خطوات الغسيل. permethylation التالية، وكمية معروفة على مستوى غليكان الخارجي permethylated (maltotri- وmaltotetrasaccharide، Dp3 وDp4) وأضيف إلى كل لتسهيل الكمي من الانتعاش غليكان 27. كان انتعاش glycans مرتبطة يا من قطع صغيرة هلام يقرب من 10 أضعاف أكبر من هلام كبيرة من شرائح (الشكل 4).

    الرقم 4
    الرقم 4. الانتعاش غليكان من قطع صغيرة هلام هو أكثر كفاءة من من القطع الكبيرة. قطع صغيرة (~ 2 × 2 مم) أسفرت عن أكثر من غليكان مكعبات أكبر (~ 5 × 5 ملم). تظهر القضبان شدة إشارة النسبية لمجموع كل الهياكل غليكان مرتبطة يا تطبيع للإشارة الكشف عن معيار خارجي (Dp3 maltotrisaccharide، تعيين إلى 100٪)، التي أضيفت إلى الإفراج غليكان قبل تحليل MS. القيم هي متوسط ​​الانحراف المعياري ل n = 3. تعديل من كوماجاى K 25.

    إثراء Sulfoglycans قبل مرحلة التقسيم

    وpermethylated مكبرت مستوى غليكان (سلفو-لو أ) تعافى تماما في المرحلة المائية. Permethylated glycans sialylated صدر من عشرالبريد الميوسين بروتين سكري تقسيم في مرحلة DCM (الشكل 5). كان استرداد كل glycans permethylated قبل التقسيم مائي العضوي مشابه لذلك من C18 سبتمبر-باك طريقة تنظيف تتميز سابقا 27. كفاءة وبساطة طريقة تقسيم مرحلة يسهل إلى حد كبير من العينات وأساليب تحليلية لاحقة.

    الرقم 5
    الرقم الانتعاش 5. التفاضلية من glycans سالينو-سلفو والتقسيم المرحلة. وقد ارتفعت البقري الميوسين بروتين سكري مع كمية معروفة من المعايير سلفو غليكان (سلفو-لو أ) قبل التعرض للالتخفيض β-القضاء. تم permethylated glycans صدر وتم تعديل رد فعل permethylation إلى 1: 1: الماء: • قرار مجلس الوزراء. تم فصل المراحل العضوية والمائية الناتجة وتحليلها بواسطة MS. وكان كميا الانتعاش غليكان يختلطسالبة للمعايير غليكان الخارجية permethylated، التي ارتفعت في العينة قبل التحليل MS. المبالغ المستردة غليكان في العضوية (DCM) ومائي وترد (المياه) مراحل النسبي لمعيار خارجي، والتي كان من المقرر أن 100٪. كانت Sulfoglycans غير قابلة للكشف في المرحلة العضوية كنه تعافى كميا في المرحلة المائية. وتمثل نتائج متوسط ​​± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تعديل من كوماجاى 25.

    تطبيق لفي العمق البروتين وGlycomic تحليلات في العينات البيولوجية

    تم فصل البروتينات لعاب الإنسان بواسطة SDS-PAGE وملطخة Coomassie بريليانت الأزرق (G-250). تم رفعه بروتين الوزن الجزيئي المرتفع في MW ~ 600 كيلو دالتون من هلام وتعرض جزء من قطعة هلام لفي جل الهضم زيتية وLC-MS / MS تحليل البروتين القائم، الذي حدد هذه الفرقة كما MUC5B 16،24 . تعرض ما تبقى من قطعة هلام لفي جل redu التفاعلية الذي نظمه β-القضاء لتحليل-O غليكان 27. بعد permethylation والمائي العضوي التقسيم المرحلة (المياه: DCM، 1: 1)، permethylated تم تحليل glycans في المراحل المائية والعضوية من قبل NSI-MS. permethylated غير مكبرت تم انتشال O-glycans من مرحلة العضوية وتم انتشال جميع sulfoglycans permethylated من المرحلة المائية، مما يسهل تحديد وتوصيف مكبرت إسوي الضغط تقريبا وglycans غير مكبرت، مثل الجبهة المتحدة عرافة 1 2 3 HexNAc GalNAc-را (م / ض = 1606.8، [M + نا] +) و (SO 3) 1 NeuAc الجبهة المتحدة 1 1 2 عرافة HexNAc GalNAc 1-را (م / ض = 1606.7، [M + 2NA-H] +) تختلف باختلاف فقط 0.1 وحدة الإعلام وسيكون من الصعب حل دون فصل جسديا النوعين قبل التقسيم المرحلة (الشكل 6).

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "العرض =" 700px "/>
    الشكل 6. الكشف عن التعقيد إسوي الضغط في محايدة وسلفو glycans-مفصولة التقسيم مائي العضوي. MS أنماط 2 تجزئة تم الحصول عليها من أيونات الأم الكشف على مجموع الخرائط أيون (TIM) تحليل permethylated O-glycans صدر من اللعاب البشري الميوسين من قبل في جل β-القضاء والماء: التقسيم DCM التالية permethylation. (A) MS 2 من التحليل TIM المرحلة DCM للنافذة 2.8 وحدة الإعلام حول م / ض = 1608. (ب) الطيف MS 2 من نفس النافذة الشامل للتحليل TIM المرحلة المياه. في مراحل DCM، الأيونات شظية كبيرة تتوافق مع فقدان عرافة 1 -O (م / ض 1370.8)، الجبهة المتحدة 1 عرافة 3 HexNAc 2 + نا (1331.8)، وفقدان الجبهة المتحدة 1 1 عرافة -O (1196.7)، وفقدان من الهيكس 1 HexNAc 1 (1143.6)، وفقدان الجبهة المتحدة 1 1 عرافة HexNAc 1 (969.5)، وفقدانالجبهة المتحدة من 1 عرافة 2 HexNAc 1 -O (747.4)، الجبهة المتحدة 1 1 عرافة HexNAc 1 + نا (660.4)، والهيكس 1 HexNAc 1 + نا (486.3). على أساس هذه الأيونات شظية، يقترح مزيجا من الهياكل غير مكبرت مع تشكيل الجبهة المتحدة 1 عرافة 3 HexNAc GalNAc 2-OL كما هو مبين على يمين الطيف. في المقابل، فإن الأيونات شظية الرئيسية للمرحلة المياه هي فقدان SO 3 نا (1486.8)، وفقدان NeuAc (1231.5)، وفقدان الجبهة المتحدة 1 1 عرافة -O (1196.7)، وفقدان مزيج من NeuAc وSO 3 نا ( 1111.8)، وفقدان NeuAc 1 عرافة 1 -O (1009،4). مزيج من الهياكل مكبرت مع تكوين (SO 3 -) يقترح NeuAc 1 1 1 الجبهة المتحدة عرافة 2 HexNAc GalNAc 1-OL. دون الفصل المادي بين الحياد وsulfoglycans قبل التقسيم المرحلة، تفسير MS 2 أطياف هذه الخلطات هو أكثر بكثير الفصلallenging. تعديل من كوماجاى 25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3, (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126, (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280, (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3, (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224, (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6, (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17, (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250, (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71, (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283, (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423, (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74, (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15, (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6, (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203, (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282, (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5, (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77, (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77, (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79, (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12, (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19, (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30, (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85, (18), 8692-8699 (2013).
    تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter