O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
SDS-PAGE에 의한 단백질 분리 후 분해된 단백질 밴드의 겔 내 단백질 분해 분해는 생물학적 샘플의 고해상도 단백질 분해 분석을 생성했습니다. SDS-PAGE에 의해 분해된 당단백질에 의해 운반되는 글라이칸을 심층적으로 분석할 수 있는 유사한 접근법은 검출 방법으로 질량 분석법(MS)을 사용할 때 회수율과 감도를 극대화하기 위해 특별한 고려 사항이 필요합니다. 고품질 데이터를 얻기 위해 극복해야 할 주요 장애물은 MS 분석을 방해하는 겔 유래 오염 물질을 제거하는 것입니다. 여기에 제시된 샘플 워크플로우는 강력하고 효율적이며 MS 전에 인라인 HPLC 세척이 필요하지 않습니다. 표적 단백질을 포함하는 겔 조각을 아세토니트릴, 물 및 에틸 아세테이트로 세척하여 고분자 아크릴아미드 단편을 포함한 오염 물질을 제거합니다. O-결합 글라이칸은 in-gel reductive β-elimination에 의해 표적 단백질에서 방출되고 강력하고 간단한 세척 절차를 통해 회수됩니다. 이 워크플로우의 장점은 황산화 글라이칸을 검출하고 특성화하기 위한 감도를 향상시킨다는 것입니다. 이러한 절차는 MS 분석 전에 신속한 상 분할을 통해 비황산(시알릴화 및 중성) 과메틸화 글라이칸에서 황산염 과메틸화 글라이칸을 효율적으로 분리하여 SDS-PAGE에 의해 분해된 당단백질의 글리코믹 및 설포그리코믹 분석을 향상시킵니다.
서론
글리코 실화는 유기체 생리학, 조직 병리학, 및 셀룰러 인식 1-3에 기여 필수적인 단백질 번역 후 변형이다. 분석, 당질의 주요 발전에도 불구하고, 특정 단백질에 글리 칸의 전체 다양성을 특징 짓는 특히 차 생물 소스에서 고립 된 단백질에, 매우 어려운 과제 남아있다. 그럼에도 불구하고, 당 단백질 글리 칸의 microheterogeneity 자주 다른 단백질과 기능의 상호 작용에 영향을 미친다. 따라서, 글리 칸 다양성의 특성화 세포 및 조직 당화 4,5의 생리적 중요성을 이해하는데 필수적이다. 조직의 생리 및 병태 생리, 강력한 민감하고 포괄적 인 glycomic 분석 기술에 당 단백질 글리코 실화의 기여를 이해하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 단백질체 분석에서 동정 된 단백질은 일반적으로 LC-MS에 의해 달성된다/ 트립신 펩티드 (6)의 MS 분석. 단백질 분해는 7-9의 트립신과 같은 프로테아제의 겔 소화 다음 SDS-PAGE에 의해 해결 정제 된 단백질 또는 단백질을 사용하여 수행 될 수있다. SDS-PAGE에 의해 단백질 혼합물의 예비 농축 단백질 ID의 깊이와 정확도를 향상시킨다. 당 단백질의 당화의 glycomic 분석을위한 유사한 전략의 개발은 당질의 최전선에있다.
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프로토콜
참고 : 연구실 안전에 관한 사항
표준 실험실 모범 사례에 준하여 다음 사항을 준수하십시오. 적절한 위치에있는 모든 유기 용제를 저장합니다. 화학 성분의 명확한 표시와 화학 폐기물 용기에있는 모든 폐기물을 보관하십시오. 이러한 프로토콜에 사용되는 몇 가지 시약 잠재적 인 발암 물질이나, 휘발성 가연성 가스를 생성 환기 흄 후드에서 모든 시약을 처리합니다. 유기 용매를 사용하여 작업 할 때와 같은 장갑, 실험실 코트, 및 눈 보호 등의 개인 보호 장비를 착용 할 것.
에 - 겔 O-글라 이코믹스 1. 절차를 그림. 관심의 (A) 단백질은 적절한 염색 절차 (코마 또는 실버)에 의해 감지, SDS-PAGE에 의해 해결하고 절제되어있다. 절제된 젤 조각 썰어작은 큐브로, 탈색, 이후 MS ....
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결과
인 - 젤 환원 적 β-제거에 에틸 아세테이트 치료의 효과 이전
에 - 겔 환원 β-제거를 사용하여 점액 소에서 방출 메틸화 O 연결된 글리 칸 샘플의 대표적인 질량 스펙트럼은 그림 3과 같다. 겔 조각의 EtOAc로 세척 효과적으로 이후 MS 분석 (27)을 방해 SDS와 폴리 아크릴 오염 물질을 제거합니다.
이전에 젤 환원 β-제거에 폴리 아크릴 아마이드 젤 조각 그림 3. 에틸 아세테이트 세척 출시 글리 칸의 검출을 향상시킵니다. 에틸 아세테이트, 소 submaxillary 점액에서 젤 β-제거가 발표 한 메틸화 O 연.......
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토론
겔 내 환원성 β 제거와 수성-유기 추출을 결합하면 SDS-PAGE에 의해 다른 단백질에서 분해된 소량의 뮤신형 당단백질에서 수확된 황산화 및 비황산화 O-결합 글리칸을 특성화하기 위해 획득할 수 있는 구조 데이터의 감도와 깊이가 향상됩니다. 이 연구에서 제시된 기술적 접근 방식의 본질적인 발전은 다음과 같습니다: (a) 간단한 세척 단계로 젤 유래 오염 물질을 쉽게 제거; (b) 빠른 물-DCM 분할 후 수성상에서 과메틸화된 설포글리칸의 정량적 회수. 여기에 설명된 워크플로는 생물학적 샘플에서 생리학적 수준으로 발현되는 당단백질에서 방출되는 황산화 및 비황산화 글리칸에 대한 검출 민감을 획기적으로 향상시킵니다.
여기에 설명된 방법은 표준 분석 관행에 세심한 주의를 기울여 적용할 때 강력하고 재현성이 높지만, 가능한 오염원에 관한 몇 가지 고려 사항은 간략하게 언급할 가치가 있습니다. 모든 유리 제품이 매우 깨끗하고 먼지와 세제가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. MS 스펙트럼.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NHLBI/NIH의 보조금 P01HL107151 지원받았습니다. 저자는 또한 NIGMS/NIH의 보조금 P41GM103490을 통해 제공되는 기기에 대한 지원과 접근에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 물, 탈 이온수 | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, HPLC |
| 아세트산 용, 빙하 | 피셔 | A38-500 | 인증 ACS≥ 99.7% w/w |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | 34860-4L-R | CHROMASOLV, HPLC 용, ≥ 99.9% |
| 암모늄 바이카보네이 | 플루카 | 09830-500G | BioUltra, ≥ 99.5% (T), 1단계 |
| 아세토니트릴 | 시그마-알드리치 | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, HPLC 용, ≥ 99.9%, 단계 1 |
| 에틸 아세테이 | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, 단계 1 |
| 나트륨 보로하이드라이드 | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, 단계 2 |
| 요오도메탄 | 시그마-알드리치 | 289566-100G | 시약플러스, 99.5%, 6단계. 4 °에 저장; C를 사용할 때까지. 사용하기 전에 실온에 두십시오. |
| 수산화나트륨 용액, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | 인증, Step 6 |
| 디메틸 설폭사이드, 무수 | Sigma-Aldrich | 276855-1L | 무수, ≥ 99.9%, 단계 6 |
| 메탄올, 무수 | 시그마-알드리치 | 322415-100ML | 무수, 99.8%, 단계 6 |
| 디클로로메탄 | 시그마-알드리치 | 34856-4L | CHROMASOL®, HPLC용, ≥ 99.8%, 안정제로 아밀렌 포함, 단계 7 |
| Dowex 50WX8 수소 형태수소 형태 100-200 메쉬 | 시그마-알드리치 | 217506-500G | 단계 3 |
| AG 50W-X8 수지 | Bio-Rad | 142-1441 | 단계 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 고체상 추출 컬럼, PP, 옥타데실 (C18) 역위상 | JT Baker | JT-7020-01 | 단계 5 및 8 |
| 7.5% 미니-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤 | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie 염색 | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, 스텝 1 |
| 실버 스테인 키트 질량 분석용 | 피어스 | 24600 | 스텝 1 |
| 올리고당 키트 (말토트리오스, dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| 올리고당 키트 (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| 일회용 파스퇴르 피펫, 유리, 짧은 팁 | VWR | 14673-010 | 사용 전 세척 |
| PYREX 13 x 100 mm 일회용 둥근 바닥 나사 배양 튜브 | Corning | 99447-13 | 사용 전 세척 |
| PYREX 16 x 125 mm 일회용 둥근 바닥 나사 배양 튜브 | Corning | 99447-16 | 사용 전 세척 |
| PTFE 표면 고무 라이너가있는 페놀 캡 / 클로저 | Kimble | 45066C-13 | 사용 전 세척 |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | 사용 전 세척 |
| Hamilton HPLC 주사기 | HAMILTON | 81265 | 볼륨 500 &뮤; l, 바늘 크기 22 G |
| Hamilton HPLC 주사기 | HAMILTON | 81165 | 볼륨 250 &뮤; l, 바늘 크기 22 G |
| Hamilton HPLC 주사기 | HAMILTON | 81065 | 볼륨 100 &뮤; l, 바늘 크기 22s G |
| Hamilton HPLC 주사기 | HAMILTON | 80965 | 볼륨 50 &뮤; l, 바늘 크기 22s G |
| Hamilton 보정 주사기 | HAMILTON | 80300 | 볼륨 10 &뮤; l, 바늘 크기 26s G |
| 페트리 식기 유리 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | 사용 전 세척, 1단계 |
| Bard-Parker 수술용 칼날 | Fisher | 371310 | 1단계 |
| Reacti-Therm 가열/교반 모듈 | Pierce | 18870 | 1, 4 및 7 |
| 가열 블록 | Fisher | 125D | 2 |
| 단계Pyrex 섬유 유리 울 보로실리케이트 모공 크기 8 &뮤; | m Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | 단계 6 |
| 동결건조기 25EL 프리즈모빌 | Virtis | 25EL | |
| 원심분리기 | VWR | 임상 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
참고문헌
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeye....
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