Summary
Den corticospinal tarmkanalen, en af de vigtigste sensomotoriske skrifter, kan læderede ensidigt i gnaver hjernestammen for at teste neuroplasticitet-inducerende terapier til centralnervesystemet. Denne kirurgiske procedure ("pyramidotomy"), og postoperative vurderinger er beskrevet i denne protokol.
Abstract
Den corticospinal tarmkanalen (CST) kan være helt adskilt ensidigt i medullære pyramider i gnaver hjernestammen. CST er en motor tarmkanalen, der har stor betydning for den distale muskel kontrol hos mennesker, og, i mindre grad, i gnavere. En ensidig nedskæring af en pyramide resulterer i tab af CST innervation af rygmarven hovedsagelig på den kontralaterale side af rygmarven fører til forbigående motorisk handicap i forbenene og vedvarende tab af fingerfærdighed. Ipsilaterale fremskrivninger af den corticospinal tarmkanalen er mindre. Vi har forfinet vores kirurgisk metode til at øge chancerne for læsion fuldstændighed. Vi beskriver postsurgical pleje. Underskud på Montoya trappe pellet nå test og den vandrette stigen test her viste opdages op til 8 uger postinjury. Underskud på test cylinder opdræt kun opdages forbigående. Derfor kan cylinderen test kun være egnet til påvisning af kortsigtet bedring. Vi viser, hvordan, elektrofysiologiskog anatomisk, kan man vurdere læsioner og ændringer af plast. Vi beskriver også, hvordan man analysere fibre fra den uskadt CST spiring over midterlinjen i dårligt stillede områder. Det er en udfordring at opnå> 90% gennemført læsioner konsekvent på grund af nærhed til basilararterien i medulla oblongata og overlevelsesrater kan være lav. Alternative kirurgiske tilgange og adfærdsmæssige test er beskrevet i denne protokol. Den pyramidotomy model er et godt redskab til at vurdere neuroplasticitet-fremkaldende behandlinger, som øger spiring af intakte fibre efter skade.
Introduction
Den corticospinal tarmkanalen (CST) er en vigtig motor tarmkanalen i den menneskelige rygmarven. Skader på denne tarmkanalen efter rygmarvsskade medfører betydelige tab af fingerfærdighed. CST er især vigtigt for fine motor bevægelse i mennesker, såsom ciffer bevægelse og distale muskel kontrol. Det er også fundet i gnavere selvom dens anatomiske placering i rygmarven er forskellig fra mennesker, og CST skaden er mindre invaliderende 1-4.
En in vivo-model af CST skade indebærer ensidig pyramidotomy, hvor en pyramide i den ventrale hjernestammen er rostralt for decussation (figur 1). Pyramiderne er en klar anatomisk funktion på den ventrale side af medulla oblongata hvorigennem CST kører før det decussates. Hos rotter er de fleste af fibre (omkring 95%) decussate ved den kaudale ende af medulla og derefter findes i den dorsale mediale del af rygmarven. Imidlertid approximately 10% af decussated fibre køre i dorsolaterale kolonner. De resterende ~ 5% fibre bo uncrossed på den ipsilaterale side og rejse i den ventrale mediale del 5,6. Efter pyramidotomy rygmarven mister sin direkte input fra den kontralaterale CST (figur 1).
Den pyramidotomy model er særlig god til at teste svarene fra de intakte fibre af unlesioned CST en behandling. Det giver mulighed for vurdering af plasticitet og spiring af de intakte fibre på tværs af midterlinjen i rygmarven, der innerverer de denerverede områder. Den corticospinal tarmkanalen er blevet observeret at spire betydeligt i rygmarvsskade modeller og medierer specielt forben opsving 7-10. En behandling kan tage sigte på at forbedre denne forben opsving. Effekten af en behandling kan testes med adfærdsmæssige vurderinger, anatomiske tracing teknikker for unlesioned tarmkanalen og terminale elektrofysiologiske eksperimenter 3,11,12. </ P>
Fordelen i forhold til de fleste andre prækliniske modeller af rygskader er, at det netop berører en tarmkanalen i forhold til andre rygskader ofte påvirker flere skrifter. Kun én tarmkanalen på en klar, overfladisk anatomisk placering er læderede. En anden fordel er, at pyramidotomy er en reproducerbar skade model. Det er en passende in vivo ressource for forskerne at teste virkningen af potentielle neuroplasticitet-fremkaldende behandlinger, som sigter mod genvinding af motorisk funktion efter skader eller lidelser, som påvirker det motoriske system 13,14.
Protocol
Etik erklæring: Alle procedurer var i overensstemmelse med retningslinjerne fra det britiske indenrigsministerium og dyr (Videnskabelige Procedurer) Act af 1986.
1. Kirurgi og skade
BEMÆRK: Brug af rotter, der vejer over 220 g kan hjælpe med postoperative opsving, hvis kirurgen finder dyrene mister ofte mere end 10% af deres præoperative kropsvægt.
- Før operationen, teste dyrene for deres forepaw præference med cylinderen opdræt test 15 eller Montoya staicase test 24. Fortrinsvis skære pyramiden / CST, der svarer til den dominerende forepaw.
BEMÆRK: I to dage før indgrebet, placere følgende i burene, så rotterne bliver fortrolig med fødevarer, der vil være til gavn under restitution fra kirurgi: hydrogel pakninger, våd mos, og højt kalorieindhold kosttilskud. Sterile versioner af disse kosttilskud er tilgængelige fra forskellige leverandører. - Bedøver kvindelige Lister hætteklædte rotter (der vejer mellem 200 og 250 g) med isofluran (5% for induktion og 1 til 2% for vedligeholdelse) i ilt (strømningshastighed: 1,5 l / min). BEMÆRK: Valget af anæstetikum er vigtig. Inhalationsanæstetikum muliggør hurtigere regulering af dybden af bedøvelse end ketamin, som er også almindeligt anvendt. Isofluran giver mulighed for bedre kontrol med vejrtrækning frekvens og dybde. Valget af anæstetikum er isofluran. BEMÆRK: Brug af rotter, der vejer over 220 g kan hjælpe med postoperative opsving, hvis kirurgen finder dyrene mister ofte mere end 10% af deres præoperative kropsvægt.
- Administrer Carprofen subkutant som en smertestillende, når dyrene bedøvet at reducere inflammation og give analgesi. Bemærk: Carprofen gives under pyramidotomy kirurgi i vores laboratorium i henhold til vores dyrlæge til råds. Opioider kan forårsage yderligere respirationsdepression under operationen.
- Oprethold dyrene ved 37 ° C under kirurgi ved hjælp af en hjemmeothermic tæppe og en rektal temperatursonde.
- Bekræft fuld bedøvelse ved at kontrollere for tilbagetrækning refleks pote knivspids og blinke refleks.
Bemærk: Valgfrit: For at imødegå åndedrætsbesvær under kirurgi, intubation og ventilation kan være mulig. Men for at huske på, at luftrøret behov forskydes under operationen. - Når bedøvet, skal du placere rotte i en liggende stilling, barbere den ventrale hals og sterilisere den med 1% chlorhexidin klude og / eller spritservietter. Påfør en steril kirurgisk tæppe over dyret og holde området sterile på alle tidspunkter.
- Når bedøvet, skal du placere rotte i en liggende stilling, barbere den ventrale hals og sterilisere den med 1% chlorhexidin og spritservietter. Påfør en steril kirurgisk tæppe over dyret og holde området sterile på alle tidspunkter.
BEMÆRK: Eventuelt kan rotte hoved fastsættes i en stereotaktisk ramme i rygleje under operationen for at deaktivere mobilitet af hovedet, dvs.nakkebenet. - Foretag en 2 til 3 cm lange midtlinjeincision fra hagen til næsten rostrale ende af brystbenet ved hjælp af en steril skalpel (# 10). Eventuelt anvende små bulldog klemmer at trække huden.
- Blunt dissekere de øverste lag af væv, såsom kirtler (fx mandibulære kirtel og ørespytkirtlen) og muskler, der dækker luftrøret anvendelse af revers handling med stumpe saks og tandede pincet. Altid bo på midterlinjen. Vævene skal adskilles nemt.
- Når luftrøret er udsat for, forskyde det til den ene side. Midterlinjen er synligt under den med to hvide fedtpuder, mærkning midterlinjen i rostrale ende.
- Rostralt for hvide fedtpuder er stumpt dissekere væv indtil den ventrale overflade af kraniet (den basioccipital knoglen) nået.
- Indsæt lang fortandede retraktorer (tand længde 5,5 mm eller 16 mm) for at holde luftrøret forskudt til den ene side (maksimum 1 cm) og udsætte bunden af kraniet. Forskydning af luftrøret kan obstruct vejrtrækning.
BEMÆRK: For nogle dyr, løsne retraktorer på flere gange under operationen for at fjerne spændinger i luftrøret, fx hver 10 min i 2 min. Hook retraktorer kan anvendes i stedet for lange fortandede retraktorer at reducere belastningen af forskydning. - Ætse forsigtigt små synlige blodkar i rostral ende går til strubehovedet at undgå blødning.
BEMÆRK: For at forhindre ætsende de tilbagevendende larynx nerve blodkar er omhyggeligt trukket væk fra vævet væggen, før de ætses. - Juster mikroskop for den resterende del af operationen.
- Fjern periosteum dækker bunden af kraniet med fine tænger. Juster retraktorer for at opnå den bedst mulige udsigt til boring.
- Mærk den ujævne overflade basioccipital knogle med fine pincet, bemærke en højde på midterlinjen, der dækker basilaris arterie. Rostrally, bliver kraniet rejst som en lille konveksitet.
- Afhængigt af hvilken side læsionen ønskes, bore et hul ca 1 mm lateralt med midterlinjen i mediolateral bevægelser.
OBS: Husk, at rotten er i liggende stilling, og dens venstre side kan være på efterforskere højre side! - Når et hul er lavet, forstørre mod midterlinjen med små lodrette up-and-nedad-bevægelser med boret indtil basilararterien er klart synlig og udvide sideværts i mindst 2 mm.
- Sørg for, at basilararterien er klart synlig. Pyramiden kan identificeres ved dens lidt udbulende form (figur 2) og grænser blodkar.
- Fjern de resterende knoglefragmenter med fine tænger.
- Påfør en dråbe Doxapram hydrochlorid, en respiratorisk stimulans, på tungen.
- Åbn dura længderetningen med en 26 gauge nål og fin pincet lateralt for basilar arterie. Nyd cerebrospinalvæsken (CSF) og blødning med vatpinde.
- Undgå injuRy til basilar arterie, lave et snit ca. 1,5 mm bred spænder over bredden af pyramiden og 0,5 mm dyb med Vännäs Spring Saks vinkelret på basilar arterie (figur 2) for at afbryde CST fibre.
BEMÆRK: Markér microscissors forinden på 0,5 mm fra spidserne. Når dura åbnes basilar arterie kan flyttes lidt til den ene side muliggør en bedre adgang til pyramiden. - Gentag snit med spidsen af en 26 gauge nål for at sikre læsionen omfatter fibrene tæt på basilar arterie.
- Stoppe blødningen med et let tryk, der anvendes af vatpinde. Eventuelt kan snittet være dækket med Gelfoam.
- Fjern retraktorer, erstatte de væv og sutur kun huden med 3-0 Vicryl suturer.
- Efter operationen, holde dyret i en inkubator ved 32 ° C, indtil helt vågen og administrere 5 ml saltvand subkutant, hvis det kræves. Efterlad ikke dyr uden opsyn.
- Giv Carporfen subkutantsom et antiinflammatorisk og som et analgetikum til den post-operative smerter en dag efter kirurgi.
- Overvåg dyr nøje i en uge efter operationen, og mindst én gang om ugen derefter.
- Som det kræves efter operationen, sted hydrering gelpakninger, pureret babymad, våd mask og tør chow på buret gulvet. Giv vandflasker med lange tude (mangler kugleleje ventiler).
Representative Results
Overlevelsesrater.
I en repræsentativ undersøgelse foretaget af os havde vi en overlevelsesrate på 16 ud af 20 kvindelige Lister hætteklædte rotter (200 til 250 g). Den mest almindelige komplikation er åndedrætsbesvær på grund af luftrøret forskydning eller beskadigelse af respiratoriske centre i hjernestammen bare dorsal til pyramiderne (nucleus solitarii, tvetydige og parabrachilis). Lignende resultater er blevet rapporteret i litteraturen 16.
Adfærdsmæssige resultater.
En række adfærdsmæssige tests er blevet anvendt til at vurdere sensorimotorisk resultat efter pyramidotomy hos gnavere: vandret stigen testen, enkelt pellet nå test cylinderen opdræt test og Montoya trappe test er de mest almindeligt anvendte adfærdsmæssige vurderinger. Andre tests beskrevet i litteraturen er pelleten nå test, reb klatring test, ganganalyse og tape test3,17-19. De fleste af disse viser en funktionel motor underskud 1 uge efter skade. I øjeblikket er de fleste undersøgelser, der er beskrevet i litteraturen kun udføre adfærdsmæssig testning op til 42 dage 4,11,13,20,21, eller for en kortere tid 3,18,22. Vi har udført adfærdsmæssig testning for en længere tidsperiode og har set i det væsentlige fuldstændig genvinding af motorisk funktion 8 uger efter pyramidotomy for nogle af de adfærdsmæssige forsøg, bortset fra Montoya trappe test og den vandrette stigen test. Dette er sandsynligvis flere grunde. For det første kan den tilskadekomne CST rostralt til læsionen danne synapser på neuroner i hjernestammen, der virker som indirekte relæer motoriske neuroner i rygmarven. For det andet kan den ikke skadede (kontralaterale) CST spire og formularer synapser på neuroner i hjernestammen eller rygmarven, der fungerer som relæer motoriske neuroner. For det tredje kan andre sparet motordrevne skrifter såsom reticulospinal, vestibulospinale eller rubrospinale skrifter overtage nogle funktion. Således er en varig treatment virkning er vanskelig at påvise med mange adfærdsmæssige forsøg i pyramidotomy model. Nogle adfærdsmæssige test i denne model dog kunne tyde accelereret opsving tidligt efter skaden, der er relateret til en behandling.
Cylinder Opdræt test 3,4,23
Baseret på test cylinder opdræt CST, der svarer til den dominerende forpote blev såret. Rotter anbringes i et plexiglas cylinder og opdræt adfærd observeres i en periode på 3 min. Preinjury der var en svag præference for anvendelsen af et forepaw den dominerende forepaw under lodret udforskning (figur 3A). Skaden påvirker dominerende side og anvendelse af contralesional forpote faldt til 28% efter 1 uge postinjury (Gentagne målinger ANOVA p <0,05; post-hoc analyse viste dyr har betydelige underskud i uge 1, 2 og 3, p <0,05, Fishers LSD). 4 uger postinjury dyrene genvundet end anvendte påvirkede forben for 45% af rears, og efter 6 uger var 57% (n = 16, middelværdi ± vises standardafvigelse). Tilsvarende Starkey et al. (4) har vurderet mus ved hjælp af cylinder test i op til 42 dage efter pyramidotomy og rapporterede en signifikant fald i anvendelsen af det angrebne forepaw hele testperioden.
Montoya Trappe test 24
Rotter kræver pretraining til denne test til at akklimatisere før skaden. For at øge motivationen under testsession dyrene mad begrænset til 15 g mad pr rotte natten før. Fødevarer berøvet rotter placeret i Montoya trappe i 15 min. På hver side er der en trappe på 7 trin med brønde, der hver indeholder 3 piller. Registreres Det samlede antal hentede pellets på hver side. Antallet af hentede pellets med contralesional / påvirkede forpote faldt markant fra 61% preinjury til3% 3 døgn postinjury (figur 3B). Evnen til at hente pellets var stadig væsentligt forringet ved 4 uger postinjury med 20% af pellets hentes. Rotter viser et betydeligt underskud op til uge 8 med kun 29% af pellets spist på dette tidspunkt (Gentagne målinger ANOVA p <0,05, post-hoc analyse viste dyr har betydelige underskud på contralesional side på alle uger, p <0,05, Fishers LSD). Den ipsilesional forepaw påvirkes op til 1 uge postinjury; men dette kommer sig af den anden uge (Gentagne foranstaltninger ANOVA p <0,05, post-hoc analyse viste dyrene har betydelige underskud på dag 3 og uge 1 på ipsilesional forepaw, p <0,05, Fishers LSD). De første underskud i ipsilesional forepaw muligvis forklares ved læsionsdannelsen af den ipsilaterale del af corticospinal tarmkanalen løber gennem snittet pyramide, med efterfølgende spiring og nyttiggørelse.
VandretLadder test 25
Rotter kræver pretraining til denne test. Rotter gå tre gange i løbet af en 1 m lang stige med uregelmæssig rung afstand. Videoer analyseres senere i slowmotion og det samlede antal af mund glider og misser for hver pote kvantificeres. Grafen i figur 3C repræsenterer det samlede antal uheld og podekviste fra de ramte og mindre ramte side (forepaw + bagpote) i procent af det samlede antal af skridt. Rotter har en signifikant øget antal fejl en uge postinjury med 10% eller 11% på den ramte side og mindre ramte side hhv. Dette underskud er vedholdende på contralesional / påvirket opad til uge 8 med 10% fejl lavet dog løser på ipsilesional / mindre ramte side af 2 ugers (Gentagne foranstaltninger ANOVA, post-hoc analyse viste dyrene har betydelige underskud på alle uger på den contralesional side og betydelige underskud i uge 1 og 3 på ipsilesionalside, p <0,05, Fishers LSD).
Elektrofysiologisk måling
I en terminal elektrofysiologisk opsætning dyret blev bedøvet intraperitonealt med urethan. Under hele proceduren, blev det holdt ved 37 ° C ± 1 ° C. Dens ventrale halsregionen, dets forelimbs og brystregionen blev barberet og desinficeret med jod krat. De pyramider blev eksponeret som tidligere beskrevet, og den radiale nerve blev eksponeret i den øvre arm af en ventral fremgangsmåde indskæring i huden og pectoralis major. Den distale ende af den radiale nerve blev skåret og nerven blev lagt over to sølv-wire tilslutning elektroder i en mineralolie bad. Enten pyramide blev stimuleret med koncentriske bipolære elektroder i forskellige dybder med 5 impulser på 300 Hz og øget stimulation amplitude. Optagelser blev altid lavet af den radiale nerve af handicappede arm (Figur 4).
Skadede animALS havde en stærk reaktion på latenstider mellem 12 til 20 ms i den radiale nerve, når den kontralaterale pyramide blev stimuleret (figur 4B). Ipsilaterale stimulation kun resulterer i lejlighedsvis aktivering (figur 4C). Dyr, der tidligere har modtaget pyramidotomies på den kontralaterale side til optagelsen arm viser ingen reaktion i den radiale nerve når læderede tarmkanalen stimuleres over læsionen (figur 4B). Men stimulering af CST fibre i pyramiderne ipsilateralt til optagelsen elektroder resulterede i en øget aktivering i den radiale nerve sammenlignet med uskadte dyr 12 uger postinjury (figur 4C).
Anatomiske resultater.
Dyrene blev aflivet 10 uger efter kirurgi ifølge skema 1 i Dyr (Videnskabelige procedurer) Act 1986. To uger tidligere, var uskadt CST spores med biotinyleretdextran amin (BDA) injektioner i den motoriske hjernebark 26 ipsilateralt til handicappede arm (figur 1). Dette giver mulighed for kvantificering af uskadte fibre, som krydser midterlinjen og leverer contralesional rygmarv (figur 5C, D). Uskadt dyr kun har et par fibre krydser midterlinjen, mens det øger som reaktion på skade. Tværgående cervikale rygmarv sektioner blev farvet med protein kinase C (PKC) gamma at vurdere andelen af denervering i læderede CST (figur 5E) 16. Alternativt kan fuldstændigheden af læsionen vurderes ved at injicere BDA sporstof i den motoriske hjernebark på ipsilesional side af pyramidotomy skade. Fraværet af mærkningen i den kontralaterale dorsomedial sikkerhedsmål og den ipsilaterale ventromediale CST giver dokumentation for fuldstændig ensidig transektion.
nt-width = "4in" src = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" />
Figur 1: Skematisk viser corticospinal skrifter i rotter og ensidige axotomi af CST i pyramiderne Top billede:. Corticospinal neuroner oprindelse i kortikale lag 5 pyramideformede celler. Biotinyleret dextran amin (afbildet i grøn) injiceres i contralesional cortex to uger forud for afslutningen af eksperimentet. Midterste billede: De skrifter danner pyramider på den ventrale overflade af medulla og ved spinomedullary junction størstedelen af axoner decussate. Ensidig pyramidotomy udføres i caudal medulla (vist i rødt). Lavere billede: De fleste af de corticospinal skrifter køre ned i dorsomedial og dorsolaterale dele af rygmarven. Et mindretal forbliver ipsilaterally og kører ventromedially.
1843fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Ventral visning af rottehjernen. Pyramiderne er karakteristisk, fordi de er rejst, parallelle konveksiteter (gul boks). Grænserne for pyramiderne er defineret medialt af basilar arterie (BAS) over midterlinjen og sideværts i bunden af konveksiteten halvvejs mellem basilar arterien og paraolivary arterie (Pol) set i (C). Kraniotomi udføres over basilararterien og laterale udvidelse til paraolivary arterie (rød boks i C). En pyramide er skåret vinkelret på basilar arterie (rød linje i C, er skåret vist på modellen i A og B). Læsioner placeret for kaudalt nær de vertebrale arterier (vert) vil være ufuldstændig, fordi CST begynder at decussate og fordi vertebral arterie er sat ud midterlinjen. (C) Billede tilpasset fra "The Rat Nervous System" af George Paxinos 27. BEMÆRK: Denne figur viser en læsion i venstre side af billederne: dette er dyrets right pyramideformet tarmkanalen, fordi den ligger på ryggen. Bemærk dog, at videoen viser en læsion til dyrets venstre pyramideformet tarmkanalen.
Figur 3:. Repræsentative resultater cylindertesten opdræt, Montoya trappe pellet nå test og Vandret stige test Der er en motor underskud opdaget af alle test efter skade. Dog kan ingen underskud påvises med cylinderen opdræt test 4 uger postinjury, mens vedvarende underskud kan påvises med Montoya trappe test og den vandrette stigen test op til 8 uger postinjury (n = 16 pr gruppe, midler og standardafvigelse er vist). Asterisk angiver p <0,05 i forhold til preinjury baseline (Fishers LSD test). Klikher for et større version af dette tal.
Figur 4:. Elektrofysiologi vurdere corticospinal tarmkanalen før og efter pyramidotomy (A) viser opsætningen for terminalen eksperiment. Vi stimulerer pyramiderne med et tog af 5 impulser i forskellige dybder rostralt for stedet for læsionsdannelsen og decussation. Den røde tarmkanalen er læderede tarmkanalen. Vi optager fra den radiale nerve på contralesional side. (B) og (C) viser eksempler optagelser med ipsilesional stimulation eller contralesional stimulation før eller 12 uger efter pyramidotomy. Ipsilesional stimulationer fremkalde flere sammensatte aktionspotentialer (spidser i sporet) i den radiale nerve før skaden (B). Disse er afskaffet ved skader og aktivitet ikke return inden for 12 uger (B '). Contralesional stimulation fremkalder sjældent enkelt forbindelse aktionspotentialer preinjury (C). 12 uger efter en skade aktivitet betragteligt øges (C '), muligvis på grund af intakte axoner spiring over midterlinjen og plast ændringer i rygmarven. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5:. Anatomisk evaluering efter pyramidotomy (A, B, C, D) blev biotinyleret dextran amin anvendes til at spore corticospinal tarmkanalen ved at injicere det i motor cortex svarende til unlesioned CST (se grøn i figur 1). Den dorsale mediale, ventrale mediale dele af CST er klart synlige (A, dorsale mediale del forstørret i B). (C) og (D) er forstørrelser fra (a) fibre spiring over midterlinjen i den grå substans i denerverede side som reaktion på en behandling. For at vurdere fuldstændigheden af læsionen tværsnit af den cervikale niveau 4 (12 uger postinjury væv) blev skåret og farvet med antistoffer mod PKC gamma (E). CST på venstre side af billedet er intakt og kan ses udbuling tværs midterlinjen i denerverede side, formentlig på grund af den strukturelle nedbrydning af sårede dorsale CST.
Discussion
Vi har beskrevet pyramidotomy skade model. Den corticospinal tarmkanalen skæres på niveauet af hjernestammen. Fra et teknisk synspunkt denne operation kræver en masse forsigtighed og præcision. Hjernestammen imødekommer vejrtrækning centre og de kardiovaskulære centre i flere kerner som kernen tvetydige og solitarii indlejret i retikulære formation under pyramiderne. Hvis snittet er lavet for dybt dette kan føre til pludselige åndedrætsbesvær, som kan være fatal. Vi giver Dopram lige før snittet til at øge vejrtrækning aktivitet for at forebygge en pludselig vejrtrækning ophør. Hvis vejrtrækningen stopper det værd ventilerende dyret for følgende fem minutter med ilt, da det kan komme sig. Derudover bør enhver skade på basilar arterie absolut undgås. Komplikationer i de første par dage postinjury er: en anden blødning i hjernestammen påvirker vitale funktioner, betydeligt vægttab, svær vejrtrækning difficulties grund luftrøret forskydning og alvorlige orienterings- og balanceproblemer af dyret på grund af omfattende skader, herunder oliven bare laterale til pyramiderne. Disse komplikationer kan behandles som endepunkter og dyr kan aflives humant. Tæt monitorering i den første uge efter operationen er afgørende. Supplerende mad kan gives for at modvirke vægttab. Airway inflammation (ru vejrtrækning) løser normalt inden for en til to dage. Generelt er yngre dyr lettere at operere på deres hals er mindre dyb. Desuden er de mere modstandsdygtige og har færre vejrtrækning komplikationer.
Det kræver lidt øvelse at opnå en fuldstændig læsion af CST med en pyramidotomy. Tilsvarende i to undersøgelser fra Steward et al. 16, som satte sig for at kopiere en tidligere eksperiment ved Benowitz et al. 28, rapporterede oprindeligt høj dødelighed, og at nogle af deres læsioner var ufuldstændige. Behaviouralunderskud vil også være variabel. Vi anbefaler, at en ny kirurg udfører mange praksis pyramidotomy operationer før en fuld eksperiment for at teste en kandidat terapi udføres. Måder at forebygge ufuldstændige læsioner genopleve snittet med en kanyle og sørg for corticospinal fibre tæt på basilararterien afskæres som beskrevet i denne protokol. Andre muligheder er at aspirere læsionsstedet med en spids glas suge pipette, som beskrevet i Zhou et al. 2003 29. Et fint wolfram ledning kan også anvendes til at skære kanalen 22. Et alternativ til pyramidotomy er at skære den cervikale C3 dorsale CST ensidigt og derefter at skære med en ventral tilgang ipsilesional C2 ventrale del af CST 18. Men velsagtens, et komplet læsion er ikke nødvendig, hvis målet er at undersøge spiring af contralesional CST; hvis flertallet af pyramiden er læderede og en spirende svar fra unlesioned side forekommer det kan være tilstrækkeligt.
Et af formålene med pyramidotomy læsion modellen er at ablatere ene side af corticospinal tarmkanalen og bruge neuroplasticitet-inducerende terapier at stimulere plasticitet og spiring af det intakte ikke sårede fibre. For at teste neuro-beskyttende behandlinger denne model er uegnet og bør anvendes andre skade modeller som kontusion skader. Resultater af pyramidotomies vurderes oftest med adfærdsmæssig testning og anatomi. Den vandrette stigen test, test cylinder opdræt og Montoya trappe test er de mest almindeligt anvendte adfærdsmæssige vurderinger. Andre tests beskrevet i litteraturen er pelleten nå test, reb klatring test, ganganalyse og tape test 3,17-19. Imidlertid er resultaterne af de fleste adfærdsmæssige test ofte kun overvåges op til maksimalt 42 dage postlesion 3,4,11,17,18,20-22. Fra tidligere erfaringer, gnavere genvinde mest funktion på senere tidspunkter uden nogen behandling indgriben. Vi har vist that vandret stigen test og Montoya trappe pellet nå test detektere handicap op til et senere tidspunkt. De kan anvendes til at måle funktionel genvinding på grund af en behandling. Læsionen fuldstændighed bedømmes af PKC gamma-farvning (som etiketter CST fibre i den dorsale søjler) i rygmarven på rostrale cervikal niveau eller eriochrome cyanin farvning af tværgående sektioner af læsionsstedet. Biotinyleret dextran amin kan injiceres i contralesional cortex at vurdere spiring af de intakte fibre på tværs af midterlinien i denerveres rygmarv område.
Det konkluderes, at pyramidotomy model er god til vurdering neuroplasticitet-fremkaldende evner en lægemiddelbehandlingen af centralnervesystemet skader, hvis operationen lykkedes beherskes. Det vurderer plasticitet af intakte fibre. Det næste skridt ville være at bruge en mere klinisk relevant model som kontusion skader at vurdere lægemidlets evne til at overvinde større injuries påvirker flere skrifter.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Den Internationale Spinal Research Trust og Rosetrees Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 5 mg/kg twice daily |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Fine Scissors- Tough Cut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Long-toothed Alm retractors | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| cautery system kit | Harvard Instruments | 726067 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Carbon Steel burrs | Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Dopram V-drops | Pfizer | apply 1 drop to tongue | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| gelfoam | Equimedical | EQU705001 | |
| 3-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Scales | Ohaus | NVT3201 | |
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
References
- Lemon, R. N. Descending pathways in motor control. Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).
- Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
- Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
- Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
- Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
- Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
- Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
- Kartje-Tillotson, G., O'Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
- Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
- Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
- Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
- Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
- Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
- Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
- Paxinos, G. The Rat Nervous System. , Academic Press, Inc. (1995).
- Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
- Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).
