Summary
Corticospinal kanalen, en av de viktigste sensorimotor traktene, kan lesioned unilateralt i gnagerhjernestammen for å teste Neuroplasticity-induserende terapi i sentralnervesystemet. Det kirurgiske inngrepet ("pyramidotomy") og postoperative vurderinger er beskrevet i denne protokollen.
Abstract
Corticospinal kanalen (CST) kan være helt kuttet ensidig i marg pyramidene i den gnager hjernestammen. CST er en motorveier som har stor betydning for distal muskelkontroll i mennesker og, i mindre grad, i gnagere. En ensidig kutt av en pyramide resulterer i tap av CST innervasjon av ryggmargen hovedsakelig på motsatt side av ryggmargen fører til forbigående motor uførhet i forbein og vedvarende tap av fingerfølsomhet. Ipsilaterale projeksjoner av corticospinal veiene er mindre. Vi har videreutviklet vår kirurgiske metoden for å øke sjansene for lesjon fullstendighet. Vi beskriver postsurgical omsorg. Underskudd på Montoya trapp pellet nå test og den horisontale stigen test vist her registreres opp til 8 uker postinjury. Underskudd på sylinderen stell test er bare oppdaget forbigående. Derfor kan sylinderen test bare være egnet for påvisning av kortvarig utvinning. Vi viser hvordan, elektrofysiologiskog anatomisk, man kan vurdere lesjoner og plast endringer. Vi beskriver også hvordan å analysere fibre fra uskadd CST spirende over midtlinjen i de fattigste områder. Det er utfordrende å få> 90% komplett lesjoner konsekvent på grunn av nærhet til basilaris arterie i forlengede marg og overlevelse kan være lav. Alternative kirurgiske tilnærminger og atferds testing er beskrevet i denne protokollen. Den pyramidotomy modellen er et godt verktøy for å vurdere Neuroplasticity induserende behandlinger, som øker spirende av intakte fiber etter skade.
Introduction
Corticospinal kanalen (CST) er en viktig motor veiene i den menneskelige ryggmargen. Skade på denne traktaten etter ryggmargsskade fører til betydelig tap av fingerfølsomhet. CST er spesielt viktig for motoriske bevegelse hos mennesker, slik som sifret bevegelse og distale muskelkontroll. Det er også funnet hos gnagere selv om sin anatomiske plassering i ryggmargen er annerledes enn mennesker og CST skaden er mindre invalid 1-4.
En in vivo modell av CST skade innebærer ensidig pyramidotomy, der en pyramide i ventral hjernestammen er kuttet rostralt til decussation (figur 1). Pyramidene er en klar anatomisk funksjon på ventral side av forlengede marg gjennom som CST går før det decussates. I rotter, er de fleste av fibrene (rundt 95%) decussate ved kaudal ende av medulla og deretter funnet i den dorsale mediale del av ryggmargen. Men omtrenteligely 10% av de decussated fibrene kjøre i dorsolateral kolonner. De resterende ~ 5% av fibrene holde uncrossed på ipsilaterale side og reise i ventral medial del 5,6. Etter pyramidotomy ryggmargen mister sin direkte innspill fra kontralaterale CST (figur 1).
Den pyramidotomy modellen er spesielt god for testing av responsene fra de intakte fibrene i unlesioned CST for en behandling. Den tillater vurdering av plastisitet og spirende av de intakte fibre på tvers av midtlinjen i ryggmargen, som innerverer denervert områder. Corticospinal kanalen har blitt observert å spire betraktelig i rygg skade modeller og formidler spesielt forbena utvinning 7-10. En behandling kan ha som mål å forbedre denne forbena utvinning. Effekten av en behandling kan testes med atferds vurderinger, anatomiske følgeteknikk av unlesioned veiene og terminalelektrofysiologiske eksperimenter 3,11,12. </ P>
Fordelen i forhold til de fleste andre prekliniske modeller for ryggmargsskader er at det spesielt rammer én skrift i forhold til andre ryggmargsskader ofte påvirker flere traktater. Bare én skrift i en klar, overfladisk anatomisk plassering er lesioned. En annen fordel er at pyramidotomy er en reproduserbar skademodell. Det er en passende in vivo ressurs for forskere å teste effekten av potensielle Neuroplasticity-induserende behandling, som tar sikte på utvinning av motorisk funksjon etter skader eller sykdommer som påvirker motorsystemet 13,14.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle prosedyrer var i samsvar med retningslinjer fra UK Home Office og Dyr (vitenskapelige prosedyrer) loven av 1986.
1. Kirurgi og Injury
MERK: Bruk rotter tyngre enn 220 g kan hjelpe med postoperative utvinning hvis kirurgen finner dyrene ofte mister mer enn 10% av sin preoperativ kroppsvekt.
- Før kirurgi, teste dyrene for deres forepaw preferanse med sylinderen stell test 15 eller Montoya staicase test 24. Fortrinnsvis kutte pyramide / CST tilsvarer den dominerende forepaw.
MERK: For to dager før operasjonen, legger følgende elementer inn i bur, slik at rottene blir kjent med matvarer som vil være gunstig under utvinning fra kirurgi: hydrogel pakker, våt mose, og høye kalori kosttilskudd. Sterile versjoner av disse kosttilskudd er tilgjengelige fra flere leverandører. - Bedøve kvinnelig Lister hette rotter (som veide mellom 200 og 250 g) med isofluran (5% for induksjons og 1 til 2% for vedlikehold) i oksygen (strømningshastighet: 1,5 l / min). MERK: Valget av bedøvelse er viktig. Inhalering bedøvelse muliggjør hurtigere regulering av dybden av anestesi enn ketamin, som også ofte brukt. Isofluran gir bedre kontroll av pustefrekvensen og dybde. Valget av bedøvelse er isofluran. MERK: Bruk rotter tyngre enn 220 g kan hjelpe med postoperative utvinning hvis kirurgen finner dyrene ofte mister mer enn 10% av sin preoperativ kroppsvekt.
- Administrere Carprofen subkutant som et analgetikum når dyrene bedøves for å redusere betennelse og for å gi smertelindring. Merk: Carprofen er gitt under pyramidotomy kirurgi i vårt laboratorium i henhold til vår veterinær råd. Opioider kan forårsake ytterligere respirasjonsdepresjon under operasjonen.
- Vedlikeholde dyrene på 37 ° C under operasjonen ved hjelp av et hjemothermic teppe system og en rektal temperatur probe.
- Bekreft fulle anestesi ved å sjekke for pote klype tilbaketrekking refleks og blunkerefleksen.
Merk: Valgfritt: For å motvirke luftveisproblemer under operasjonen, intubasjon og ventilasjon kan være gjennomførbart. Men husk at luftrøret må fortrenges under operasjonen. - Når bedøvet, plasserer rotte i en liggende stilling, barbere ventral nakke og sterilisere den med en% klorheksidin våtservietter og / eller alkoholservietter. Anvende en steril kirurgisk teppe over dyret og holde området sterilt til enhver tid.
- Når bedøvet, plasserer rotte i en liggende stilling, barbere ventral nakke og sterilisere den med en% klorheksidin og alkohol våtservietter. Anvende en steril kirurgisk teppe over dyret og holde området sterilt til enhver tid.
MERK: Hvis du vil, kan rotta hode festes i en stereotaktisk ramme i liggende stilling under operasjonen for å deaktivere mobilitet av hodet, det vil sinakkeknøl. - Gjør en 2 til 3 cm lang midtlinjesnitt fra haken til nesten den rostrale enden av brystbenet ved hjelp av en steril skalpell (# 10). Eventuelt gjelder små bulldog klemmer å trekke huden.
- Blunt dissekere de øvre lag av vev som kjertler (f.eks submaxillary kjertel og parotidkjertelen) og muskler som dekker luftrøret ved hjelp av omvendt handling med avstumpet saks og tann tang. Alltid holde seg på midtlinjen. Vev bør lett å skille.
- Når luftrøret er utsatt, fortrenge det til den ene siden. Midtlinjen er synlig under den med to hvite fettputer, som markerer midtlinjen på rostral slutten.
- Rostralt til de hvite fett pads, er sløv dissekere vev til ventral overflaten av hodeskallen (den basioccipital bein) nådd.
- Sett langtannSaker (tann lengde 5,5 mm eller 16 mm) for å holde luftrøret forskjøvet til den ene siden (maks 1 cm), og for å eksponere undersiden av skallen. Forskyvning av luftrøret kan obstruct puste.
MERK: For noen dyr, løsne Saker på flere ganger under operasjonen for å fjerne belastningen på luftrøret, for eksempel hver 10 min for 2 min. Hook Saker kan brukes i stedet for lange-toothed Saker å redusere belastningen av fortrengning. - Nøye cauterize små synlige blodkar på rostralt slutt går mot strupehodet for å unngå blødning.
MERK: For å forhindre cauterizing de tilbakevendende laryngeal nerve blodkar blir nøye trukket bort fra vevet veggen før de cauterized. - Juster mikroskop for resten av operasjonen.
- Fjern periosteum dekker bunnen av hodeskallen med fin pinsett. Juster haker for å oppnå best mulig utsikt for boring.
- Føler den ujevne overflaten av basioccipital bein med fin pinsett, bemerker en høyde på midtlinjen, som dekker basilaris arterie. Rostrally, blir skallen oppdratt som en svak konveksitet.
- Avhengig av hvilken side lesjonen er ønsket, bore et hull omtrent 1 mm lateralt for midtlinjen i mediolateral bevegelser.
NB: Husk at rotta er i liggende stilling, og dens venstre side kan være på etterforskere høyre! - Når et hull er gjort, forstørre mot midtlinjen med små vertikale opp-og-nedover-bevegelser med drill til basilaris arterie er godt synlig og forstørre lateralt i minst 2 mm.
- Kontroller at basilaris arterie er godt synlig. Pyramiden kan identifiseres ved sin litt svulmende form (figur 2) og ved grenser blodkar.
- Fjern eventuelle gjenværende bein fragmenter med fin pinsett.
- Påfør en dråpe Doxapram hydroklorid, en luft stimulerende, på tungen.
- Åpne dura på langs med en 26 gauge nål og fin pinsett lateralt for arteria basilaris. Suge opp cerebrospinalvæsken (CSF) og blødninger med bomullspinner.
- Unngå injury til basilær arterie, et snitt omtrent 1,5 mm bred spenner over bredden av pyramiden og 0,5 mm dype med Vännäs Spring saks vinkelrett på basilær arterie (figur 2) for å avbryte CST fibre.
MERK: Marker microscissors forhånd 0.5 mm fra tips. Når dura blir åpnet basilær arterie kan flyttes litt til siden slik at bedre tilgang til pyramiden. - Gjenta kuttet ved hjelp av tuppen av en 26 gauge nål for å sikre lesjonen omfatter fibre nær den basilær arterie.
- Stoppe blødningen med et lett trykk påføres med bomull knopper. Eventuelt kan snittet være dekket med gelfoam.
- Fjerne haker, erstatte vev og sutur bare huden med 3-0 Vicryl sting.
- Etter operasjonen, holde dyret i en inkubator ved 32 ° C til den er helt våken og administrere 5 ml saltvann subkutant, hvis det er nødvendig. Ikke la dyret uten tilsyn.
- Gi Carporfen subkutantsom en betennelsesdempende og som et analgetikum for postoperativ smerte en dag etter kirurgi.
- Overvåke dyr tett i en uke etter operasjonen, og minst en gang i uken etterpå.
- Som kreves etter operasjonen, sted hydration gel pakker, most babymat, våt mose og tørr chow på buret gulvet. Gi vannflasker med lang spouts (mangler kulelager ventiler).
Representative Results
Overlevelse.
I en representativ undersøkelse utført av oss hadde vi en overlevelse på 16 av 20 kvinnelige Lister hetterotter (200-250 g). Den vanligste komplikasjonen er pustevansker på grunn av luftrøret forskyvning eller skade på luftveis sentre i hjernestammen bare dorsal til pyramidene (nucleus solitarii, tvetydige og parabrachilis). Lignende resultater har blitt rapportert i litteraturen 16.
Atferds utfall.
En rekke atferdstester har blitt brukt til å vurdere sensorimotor utfallet etter pyramidotomy hos gnagere: den horisontale stige test, den eneste pellet nå test, sylinderen stell test og Montoya trapp test er de mest brukte atferds vurderinger. Andre tester som er beskrevet i litteraturen er pelleten når testen, tau klatretesten, gangart-analyse og klebrig tape test3,17-19. De fleste av disse viser en funksjonell motor underskudd en uke etter skade. Foreløpig fleste studiene som er beskrevet i litteraturen bare utføre atferds testing opp til 42 dager 4,11,13,20,21, eller for en kortere tid 3,18,22. Vi har utført adferdstesting for en lengre periode og har sett i det vesentlige fullstendig gjenvinning av motorisk funksjon 8 uker etter pyramidotomy for noen av de adferdstester, unntatt Montoya trapp test og den horisontale stigen test. Dette er sannsynligvis flere årsaker. For det første kan den skadde CST rostralt til lesjonen danne synapser på nevroner i hjernestammen som fungerer som indirekte releer til motoriske nerveceller i ryggmargen. For det andre kan det uninjured (kontralateral) CST spire og skjemaer synapser på nevroner i hjernestammen eller ryggmargen som fungerer som releer til motoriske nevroner. For det tredje kan andre spart motoriske traktater som de reticulospinal, vestibulospinal eller rubrospinal traktater overta noen funksjon. Således, en varig treatment virkning er vanskelig å detektere med mange adferdstester i pyramidotomy modellen. Noen adferdstesting i denne modellen, men kan indikere akselerert utvinning tidlig etter skaden, som er relatert til en behandling.
Sylinder stell test 3,4,23
Basert på sylinderen stell test CST tilsvarer den dominerende forepaw ble skadet. Rotter blir plassert i en plexiglass sylinder og stell oppførsel blir observert i en periode på 3 min. Preinjury det var en svak preferanse for anvendelse av en forepaw, den dominerende forepaw, under vertikal leting (figur 3A). Skaden påvirker den dominerende side og bruken av contralesional forepaw redusert til 28% i en uke postinjury (gjentatte målinger ANOVA p <0,05; post-hoc-analyse viste dyrene har betydelige mangler ved uke 1, 2 og 3, p <0,05, Fishers LSD). 4 uker postinjury dyrene utvinnes end benyttet den berørte forbena for 45% av steiler, og etter 6 uker var 57% (n = 16, gjennomsnitt ± standard avvik er vist). Tilsvarende, Starkey et al. (4) har vurdert mus ved hjelp av sylinderen test for opptil 42 dager etter pyramidotomy og rapporterte en betydelig reduksjon i bruken av det berørte forepaw gjennom hele testperioden.
Montoya Trapp test 24
Rotter krever pretraining for denne testen for å akklimatisere før skade. For å øke motivasjonen under testing session dyrene mat begrenset til 15 g mat per rotte natten før. Mat fratatt Rottene plasseres i Montoya trapp i 15 min. På hver side er det en trapp av 7 trinn med brønner, hver med tre pellets. Det totale antallet hentet pellets på hver side blir registrert. Antallet hentet pellets med contralesional / påvirket forepaw sunket betraktelig fra 61% preinjury til3% 3 dager postinjury (figur 3B). Evnen til å hente pellets var fortsatt betydelig svekket ved 4 uker postinjury med 20% av pellets hentet. Rotter viser et betydelig underskudd frem til uke 8 med bare 29% av pellets spist på det tidspunktet (Gjentatte Tiltak ANOVA p <0,05, post hoc analyse avdekket dyr har betydelige underskudd på contralesional side hele uker, p <0,05, Fishers LSD). Den ipsilesional forepaw påvirkes opp til en uke postinjury; men dette gjen av de andre uken (Gjentatte Tiltak ANOVA p <0,05, post hoc analyse avdekket dyr har betydelige underskudd på dag 3 og Uke 1 på ipsilesional forepaw, p <0,05, Fishers LSD). De innledende underskudd av ipsilesional forepaw kan forklares ved lesioning av den ipsilaterale parti av corticospinal kanalen løper gjennom skjæringen pyramide, med etterfølgende spiring og gjenvinning.
HorisontalStige test 25
Rotter krever pretraining for denne testen. Rotter gå tre ganger over en 1 m lang stige med uregelmessig trinnavstand. Videoer er analysert senere i slow motion og det totale antall fot slips og målet for hver pote kvantifiseres. Grafen i Figur 3C representerer det totale antall ulykker og slips av de berørte og mindre berørte side (forepaw + bakpote) i prosent av totalt antall skritt tatt. Rotter har en betydelig økt antall feil en uke postinjury med 10% eller 11% på den berørte side og mindre smertefulle siden hhv. Dette underskuddet er vedvarende på contralesional / påvirket side opp til uke 8 med 10% feil gjort, men løser på ipsilesional / mindre berørte side etter to uker (Gjentatte Tiltak ANOVA, post hoc analyse avdekket dyr har betydelige underskudd på alle ukene på den contralesional side og betydelige underskudd på uke 1 og 3 på ipsilesionalside, p <0,05, Fishers LSD).
Elektrofysiologisk testing
I en terminal elektro oppsett ble dyret bedøvet intraperitonealt med uretan. Gjennom fremgangsmåten, ble det holdt ved 37 ° C ± 1 ° C. Sin ventral nakkeregionen, dets forbein og bryst regionen ble barbert og desinfiseres med jod kratt. Pyramidene ble eksponert som beskrevet ovenfor, og den radiale nerve ble eksponert i den øvre arm av en ventral tilnærming incising huden og pectoralis major. Den distale enden av den radiale nerve ble kuttet og nerven ble lagt over to sølvtråd tilkopling elektrodene i en mineralolje-bad. Enten pyramide ble stimulert med konsentriske bipolare elektroder ved forskjellige dybder med fem pulser ved 300 Hz og øke stimulering amplitude. Opptakene ble alltid laget av radial nerve av funksjonshemmede arm (figur 4).
Uskadd animals hadde en sterk respons på ventetider mellom 12 til 20 msek i radial nerve når den kontralaterale pyramide ble stimulert (figur 4B). Ipsilaterale stimulering bare resulterer i sporadisk aktivering (Figur 4C). Dyr, som tidligere har fått pyramidotomies, på motsatt side til opptaksarmen viser ingen respons i radial nerve når den lesjonerte kanalen er stimulert over lesjonen (figur 4B). Imidlertid stimulering av CST fibrene i pyramidene ipsilaterale til opptakselektroder resulterte i en sterkere aktivering i radial nerve sammenlignet med friske dyr ved 12 uker postinjury (figur 4C).
Anatomiske utfall.
Dyrene ble avlivet 10 uker etter kirurgi i henhold til Vedlegg 1 av Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986. To uker tidligere, ble det uskadd CST spores med biotinylertedekstran amin (BDA) injeksjoner i motor cortex 26 ipsilaterale til funksjonshemmede arm (figur 1). Dette tillater kvantifisering av uskadde fibre, som krysser midtlinjen og forsyne contralesional ryggmargen (figur 5C, D). Uskadd dyr har bare noen få fibre som krysser midtlinjen, mens dette øker som respons på skade. Transversale cervikale ryggmargs snitt ble farget med protein kinase C (PKC) gamma å vurdere andelen denervering i lesioned CST (figur 5E) 16. Alternativt kan fullstendigheten av lesjonen vurderes ved å injisere BDA tracer inn i motoren cortex på ipsilesional side av pyramidotomy skade. Fravær av merking i kontralaterale dorsomedial CST og ipsilaterale ventromediale CST gir bevis for ensidig tran.
nt-width = "4in" src = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" />
Figur 1: Skjematisk viser corticospinal traktene i rotte og ensidig aksotomi av CST i pyramidene Top image:. Corticospinal nevroner opprinnelse i de kortikale lag 5 pyramidale celler. Biotinylert dekstran amin (vist i grønt) sprøytes inn i contralesional cortex to uker før slutten av forsøket. Midterste bildet: De traktater danne pyramidene på ventral overflaten av medulla og på spinomedullary krysset flertallet av aksoner decussate. Unilateral pyramidotomy utføres i caudal medulla (vist i rødt). Nedre bilde: Flertallet av corticospinal traktater kjøre ned i dorsomedial og dorsolateral deler av ryggmargen. Et mindretall forblir ipsilateralt og kjører ventromedially.
1843fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Ventral visning av rottehjerne. Pyramidene er karakteristiske fordi de er hevet, parallelle konveksiteter (gul boks). Grensene til pyramidene er definert medialt av basilaris arterie (bas) over midtlinjen og sideveis ved foten av konveksitet halvveis mellom basilaris arterie og paraolivary arterie (pol) som sett i (C). Craniotomy utføres over basilaris arterie og lateral strekker seg til paraolivary arterie (rød boks i C). En pyramide er skåret vinkelrett på basilær arterie (rød linje i C, er vist i snitt i prøven A og B). Lesjoner plassert altfor caudally nær vertebralis arterier (vert) vil være ufullstendig fordi CST begynner å decussate og fordi arteria vertebralis er satt av midtlinjen. (C) Bilde tilpasset fra "The Rat Nervous System" av George Paxinos 27. MERK: Denne figuren viser en lesjon på venstre side av bildene: dette er dyrets rigght pyramidekanalen fordi den ligger på ryggen. Vær imidlertid oppmerksom på at videoen viser en lesjon til dyrets venstre pyramidekanalen.
Figur 3:. Representative resultater for sylinderen stell testen, Montoya trapp pellet nå test og Horisontal stige test Det er en motor underskudd oppdaget av alle tester etter skade. Imidlertid kan ingen underskudd oppdages med sylinderen stell testen på 4 uker postinjury, mens vedvarende underskudd kan oppdages med Montoya trapp test og den horisontale stige test opp til 8 uker postinjury (n = 16 per gruppe, middel og standardfeilen er vist). Stjernen indikerer p <0,05 i forhold til preinjury baseline (Fishers LSD test). Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Elektro vurdere corticospinal kanalen før og etter pyramidotomy (A) viser oppsett for terminalen eksperiment. Vi stimulerer pyramidene med et tog av 5 pulser på ulike dybder rostral til området av lesioning og decussation. Den røde kanalen er den lesioned kanalen. Vi registrerer fra radial nerve på contralesional side. (B) og (C) viser eksempel innspillinger med ipsilesional stimulering eller contralesional stimulering før eller 12 uker etter pyramidotomy. Ipsilesional stimulations fremkalle flere sammensatte aksjonspotensialer (pigger i spor) i radial nerve før skade (B). Disse er avskaffet av skaden og aktivitet ikke return innen 12 uker (B '). Contralesional stimulering fremkaller sjelden enkelt sammensatt aksjonspotensialer preinjury (C). 12 uker etter skade aktiviteten betraktelig økes (C '), muligens på grunn av intakte axoner sprouting på tvers av midtlinjen og plast endringer i ryggmargen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Anatomisk evaluering etter pyramidotomy (A, B, C, D) biotinylert dekstran amin ble brukt til å spore corticospinal kanalen ved å injisere det inn i motor cortex som svarer til den unlesioned CST (se grønt i figur 1). Rygg mediale, ventrale mediale deler av CST er klart synlige (A, dorsal medial del forstørret i B). (C) og (D) er forstørrelser fra (A) av fibre som vokser på tvers av midtlinjen inn i den grå materie i denerveres side som svar på en behandling. For å vurdere den fullstendighet av lesjonen tverrgående seksjoner av cervical nivå 4 (12 uker postinjury vev) ble kuttet og farget med antistoffer mot PKC gamma (E). CST på den venstre side av bildet er intakt og kan sees utbuling på tvers av midtlinjen inn i denerveres side, antagelig på grunn av den strukturelle oppløsningen av den skadede rygg CST.
Discussion
Vi har beskrevet pyramidotomy skade modell. Corticospinal kanalen kuttes på nivået av hjernestammen. Fra et teknisk synspunkt denne operasjonen krever mye forsiktighet og nøyaktighet. Hjernestammen plass til pustesentrene og de kardiovaskulære sentre i flere kjerner slik som kjernen tvetydig og solitarii innebygd i den retikulære formasjonen under pyramidene. Hvis kuttet er gjort for dypt dette kan føre til plutselige pustevansker, som kan være dødelig. Vi gir Dopram like før kuttet for å øke pusteaktivitet til å hindre en plutselig pusting opphør. Dersom åndedrettsstans er det verdt å ventilere dyret for de følgende fem minutter med oksygen som det kan komme. I tillegg bør en hvilken som helst skade på basilær arterie absolutt unngås. Komplikasjoner under første dagene postinjury er: en annen blødning i hjernestammen som påvirker vitale funksjoner, betydelig vekttap, alvorlig puste difficulties grunn av luftrøret forskyvning og alvorlige orientering og balanseproblemer av dyret på grunn av omfattende skader inkludert oliven bare laterale til pyramidene. Disse komplikasjoner kan behandles som endepunkter og dyr kan avlives. Tett oppfølging i løpet av den første uken etter operasjonen er avgjørende. Supplerende mat kan gis for å motvirke vekttap. Airway betennelse (skurrende pust) normalt løser innen én til to dager. Vanligvis yngre dyr er lettere å operere på som halsen deres er mindre dyp. Videre er de mer motstandsdyktige og har mindre puste komplikasjoner.
Det krever litt øvelse for å oppnå en fullstendig lesjon i CST med en pyramidotomy. Tilsvarende, i to studier av Steward et al. 16, som setter ut for å gjenskape en tidligere eksperiment ved Benowitz et al. 28, rapportert i utgangspunktet høy dødelighet og at noen av deres lesjoner var ufullstendig. Atferdsunderskudd vil også være variabel. Vi anbefaler at en ny kirurg utfører mange praksis pyramidotomy operasjoner før et full eksperiment for å teste en kandidat terapi utføres. Måter å hindre ufullstendige lesjoner gjennomgåelse kuttet med en kanyle gjør at de corticospinal fibrene nær basilaris arterie er kuttet som beskrevet i denne protokollen. Andre alternativer er å suge lesjon området med en tippet glass suge pipette som beskrevet i Zhou et al. 2003 29. En fin wolfram wire kan også brukes til å kutte veiene 22. Et alternativ til pyramidotomy er å kutte livmorhals C3 rygg CST ensidig og deretter å kutte med en ventral tilnærming den ipsilesional C2 ventral del av CST 18. Men uten tvil, er en komplett lesjon ikke nødvendig hvis målet er å studere spirende av contralesional CST; hvis flertallet av pyramiden er lesioned og en spirende respons fra unlesioned side skjer dette kan være tilstrekkelig.
Et av målene med pyramidotomy lesjon modellen er å ablate den ene siden av corticospinal kanalen og bruker Neuroplasticity-induserende behandling for å stimulere plastisitet og spirende av intakte ikke-skadede fibre. For å teste nevro-beskyttende terapier denne modellen er uegnet og andre skade modeller som kontusjon skader bør brukes. Utfall av pyramidotomies vurderes oftest med atferds testing og anatomi. Den horisontale stige test, sylinderen stell test og Montoya trapp test er de mest brukte atferds vurderinger. Andre tester som er beskrevet i litteraturen er pelleten når testen, tau klatretesten, gangart-analyse og klebrig tape test 3,17-19. Men utfallet av de fleste atferds test ofte bare overvåket opp til maksimalt 42 dager postlesion 3,4,11,17,18,20-22. Fra tidligere erfaringer, gnagere gjenopprette mest funksjon ved senere tidspunkter uten behandling intervensjon. Vi har vist that den horisontale stigen test og Montoya trapp pellet nå test oppdage funksjonshemninger opp til et senere tidspunkt. De kan brukes til å måle funksjonell gjenvinning på grunn av en behandling. Lesjonen fullstendighet er dømt etter PKC gamma flekker (som etiketter CST fibre i rygg kolonner) i ryggmargen på rostralt cervical nivå eller eriochrome cyanine farging av tverrgående deler av lesjon området. Biotinylert dekstran amin kan injiseres inn i contralesional cortex å vurdere sprouting av de intakte fibre på tvers av midtlinjen inn i den denerveres ryggmarg området.
I konklusjonen, er det pyramidotomy modellen bra for å vurdere Neuroplasticity induserende evner av en behandling narkotika for sentralnervesystemet skader hvis operasjonen er vellykket mestret. Den vurderer plastisitet av intakte fiber. Neste skritt vil være å bruke en mer klinisk relevant modell som kontusjon skader å vurdere stoffets evne til å overvinne større injuries påvirker flere traktater.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den internasjonale Spinal Research Trust og Rosetrees Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 5 mg/kg twice daily |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Fine Scissors- Tough Cut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Long-toothed Alm retractors | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| cautery system kit | Harvard Instruments | 726067 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Carbon Steel burrs | Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Dopram V-drops | Pfizer | apply 1 drop to tongue | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| gelfoam | Equimedical | EQU705001 | |
| 3-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Scales | Ohaus | NVT3201 | |
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
References
- Lemon, R. N. Descending pathways in motor control. Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).
- Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
- Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
- Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
- Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
- Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
- Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
- Kartje-Tillotson, G., O'Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
- Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
- Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
- Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
- Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
- Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
- Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
- Paxinos, G. The Rat Nervous System. , Academic Press, Inc. (1995).
- Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
- Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).
