Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.
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Methodenartikel
Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Alternatives Spleißen spielt eine entscheidende Rolle bei der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), einem essentiellen zellulären Programm, das in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen abläuft. Hier beschreiben wir eine Strategie zum Nachweis alternatives Spleißen während der EMT unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modells durch Expression des Transkriptionsrepressors Twist. Die EMT wird durch Veränderungen in der Zellmorphologie, den Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen und die geschaltete Expression von EMT-Markern, wie z. B. den Verlust der epithelialen Marker E-Cadherin und γ-Catenin und den Gewinn der mesenchymalen Marker N-Cadherin und Vimentin, überwacht. Unter Verwendung von isoformspezifischen Primer-Sets wird das alternative Spleißen interessierter mRNAs mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Die Herstellung entsprechender Proteinisoformen wird durch Immunblotting-Assays validiert. Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von Spleißisoformen eignet sich auch für die Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen.
Einleitung
Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein Entwicklungsprogramm, das Organ Morphogenese und Gewebeumbau während der Embryogenese steuert. Wenn abnorm aktiviert, fördert die EMT Tumormetastasierung und Organfibrose 1,2. Zwingende Studien haben die Bedeutung der transkriptionellen Regulierung während des Prozesses der EMT beschrieben, durch mehrere Transkriptionsfaktoren, wie Verdrehen, Schnecke, und ZEB, die die Expression des Zonula-junction-Protein E-Cadherin-Repression, was zum Verlust eines Pflaster definiert Stein wie epitheliale Morphologie und Verstärkung eines spindelförmigen mesenchymalen Phänotyp 3-8. Jüngste Studien durch ge....
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Protokoll
1. Zellkultur von EMT Induktions
Hinweis: EMT kann durch die Behandlung von TGFß oder ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren Twist, Schnecke, oder ZEB1 / 2 in Epithelzellen induziert werden. In diesem Protokoll beschrieben ist eine induzierbare EMT-System über die Expression des Twist-ER-Fusionsprotein in verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HMLE / Twist-ER, ein Geschenk von Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Auf 4-Hydroxytamoxifen (TAM) Behandlung transloziert das Fusionsprotein Twist-ER in den Kern, um die Transkription und führt zu einer vollständigen EMT Übergang in 12-14 Tagen 9,11,29 fahren. Zusätzliche E....
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Ergebnisse
Die oben beschriebenen Verfahren stellen eine robuste Methode zur alternatives Spleißen während EMT erfassen. Repräsentative Ergebnisse der CD44 splice Isoform Schalt bei Twist-induzierte EMT sind nachfolgend als Beispiel angegeben.
Twist-induzierte EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen wurde durch einen Übergang von einem Kopfstein wie epitheliale Phänotyp zu einem länglichen Fibroblasten-Phänotyp (2A), das Fehlen von epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und die d.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis des alternativen Spleißens in einem induzierbaren EMT-Modell. Als solche dynamische Veränderungen der Spleiß-Isoform-Expression im gesamten zeitlichen Verlauf der EMT erfasst werden. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der Verwendung von unterschiedlichen epithelial- oder mesenchymalen-Zelllinien, die für den Vergleich von alternativen Spleißen, weil verschiedene genetische Hintergründe aus un-verwandten Zelllinien konnte mäßig beeinflussen alternative Spleißen. A.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren möchten Wensheng Liu für seine unschätzbare Hilfe bei der Zellbildgebung danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health (R01 CA182467), der American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), der Lynn Sage Foundation und der A Sister's Hope Foundation unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Stellen Sie eine Stammlösung her, indem Sie 4-Hydroxytamoxifen in Ethanol auf 200 μM auflösen. Halten Sie die Lösung bei -20 ° C vor Licht geschützt. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation Kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA Isolation Kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagenz für qRT-PCR Assay |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagenz für qRT-PCR Assay |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment für qRT-PCR Assay | |
| CD44 Antikörper | Forschung & Forschung D Systems | BBA10 | 1:1.000 Verdünnung |
| E-Cadherin Antikörper | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2.500 Verdünnung für Immunblotting; 1:50 Verdünnung für Immunfluoreszenz |
| Gamma;-Catenin Antikörper | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1.000 Verdünnung |
| Occludin Antikörper | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 Verdünnung |
| Fibronektin Antikörper | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5.000 Verdünnung |
| N-Cadherin Antikörper | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2.000 Verdünnung |
| Vimentin Antikörper | NeoMarker | MS-129-p1 | 1:500 Verdünnung |
| GAPDH Antikörper | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10.000 Verdünnung |
| Amasham ECL Western-Blotting-Detektionsreagenz | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemilumineszenz-System |
Referenzen
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
- Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. De....
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Nachdrucke und Genehmigungen
