Summary
Axonale transport van BDNF, een neurotrofe factor, is van cruciaal belang voor de overleving en functie van verschillende neuronale populaties. Sommige degeneratieve stoornissen worden gekenmerkt door verstoring van axonale structuur en functie. We toonden de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken.
Abstract
BDNF speelt een belangrijke rol in diverse aspecten van neuronale overleving, differentiatie en functie. Structurele en functionele tekorten in axonen worden steeds meer gezien als een vroeg kenmerk van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Huntington (HD). Vooralsnog onduidelijk is het mechanisme (s) van die axonale letsel wordt veroorzaakt. We meldden de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Quantum dot-gelabeld BDNF (QD-BDNF) werd geproduceerd door het vervoegen van quantum dot 655 tot mBtBDNF. Een microfluïdische apparaat werd gebruikt om de axonen van neuron cellichamen isoleren. Toevoeging van QD-BDNF het axonale compartiment toegestane levende beeldvorming van BDNF transport in axonen. We hebben aangetoond dat QD-BDNF verhuisde in wezen uitsluitend retrogradely, met zeer weinig pauzes, op een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec. Dit systeem kan worden gebruikt om me onderzochtchanisms van verstoorde axonale functie AD of HD, en andere degeneratieve aandoeningen.
Introduction
Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen waarvan de lange en vaak zeer uitgewerkte processen zijn essentieel voor het opzetten en onderhouden van de structuur en functie van neurale circuits. Het axon speelt een vitale rol bij het uitvoeren vracht naar en van synapsen. Eiwitten en organellen gesynthetiseerd cel soma moeten worden getransporteerd door axonen in de presynaptische terminal bereikt neuronale functie ondersteunen. Dienovereenkomstig ontvangen signalen bij het distale axons moeten worden getransduceerd en overgebracht naar de soma. Deze processen zijn essentieel voor neuronale overleving, differentiatie en onderhoud. In dat axonaal transport in sommige neuronen worden uitgevoerd door middel afstanden meer dan 1000 maal de diameter van het cellichaam, is de mogelijkheid gemakkelijk beoogd dat zelfs kleine tekorten aanzienlijk kunnen beïnvloeden neuronale en circuitfunctie.
Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), een lid van de neurotrofine familie van groeifactoren, aanwezig in ma isny gebieden van de hersenen, inclusief de hippocampus, cerebrale cortex en basale voorhersenen. BDNF speelt een cruciale rol in cognitie en geheugenvorming door ondersteuning van de overleving, differentiatie en functie van neuronen die deelnemen aan cognitieve circuits. BDNF bindt aan zijn receptor, het tyrosine kinase TrkB bij het axon terminal waar activeert TrkB-gemedieerde signaalwegen inclusief mitogeen geactiveerde proteïne kinase / extracellulair signaalgereguleerde proteïne kinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) en fosfolipase C-gamma (PLCy). De eiwitten die deelnemen aan deze signaalroutes verpakt op endocytische vesiculaire structuren om de BDNF / TrkB signalering endosoom 1-6 die vervolgens retrograde getransporteerd naar de neuronale soma vormen.
De microfluïdische cultuur kamer is een zeer nuttig platform voor het bestuderen van axonale biologie onder normale omstandigheden als in de setting van letsel en ziekte 7,8. Door het isoleren van axonenuit de cel lichamen, heeft het apparaat mag een tot vervoer specifiek bestuderen in axonen 8-10. De PDMS microfluïdische gebaseerde platforms met 450 urn microgroove belemmeringen die in deze studie werden commercieel aangeschaft (zie Materialen tabel). Om BDNF vervoer te onderzoeken, ontwikkelden we een nieuwe technologie om monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) produceren. We hebben geprofiteerd van de biotine acceptor peptide, AP (ook bekend als AviTag). Het is een 15 aminozuursequentie die een lysine-residu die specifiek een biotine kan worden geligeerd door het Escherichia coli enzym biotine ligase, BirA bevat. We gefuseerd de AviTag de C-terminus van het muis vooraf proBDNF cDNA door PCR (Figuur 1A). Het construct werd gekloneerd in de zoogdier expressievector pcDNA3.1 myc-vector zijn. We gekloneerd ook BirA bacterieel DNA in de pcDNA3.1 myc-vector zijn. De twee plasmiden werden transiënt gecotransfecteerd in HEK293FT cellen beide eiwitten tot expressie. BirA gekatalyseerde de ligatie van biotin het bijzonder de lysine in de AviTag bevinden bij de C-terminus van BDNF bij een 1: 1 verhouding produceren monobiotinylated BDNF monomeer. Gebiotinyleerde, volwassen BDNF met een molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd teruggewonnen en gezuiverd van media met Ni-hars (figuur 1C). De biotinylering van BDNF was voltooid, zoals beoordeeld door het onvermogen om ongemodificeerde BDNF detecteren door immunoblotting (figuur 1D). Streptavidine geconjugeerde quantum dots, QD 655, werden gebruikt om mBtBDNF labelen naar QD-BDNF maken. De aanwezigheid van de AviTag niet interfereert met de activiteit van BDNF als het mBtBDNF kon gefosforyleerd TrkB (figuur 1E) activeren en stimuleren uitgroei van neurieten (figuur 1F) voor zover van recombinant humaan BDNF (rhBDNF). Immunokleuring aangetoond dat QD-BDNF colocalized met TrkB in de hippocampus axonen, wat aangeeft dat QD-BDNF is bioactieve (figuur 1G). Om het transport BDNF bestuderen, werd QD-BDNF toegevoegd aan distale axon compartiment vanmicrofluidic kweken die E18 rat hippocampale neuronen (Figuur 2A). QD-BDNF retrograde transport binnen axonen werd gevangen genomen door real-time live imaging van de rode fluorescerende tag (Ondersteunende video's S1, S2). Door het analyseren van de kymograaf gegenereerd, werd QD-BDNF waargenomen retrogradely worden vervoerd bij een bewegende snelheid van ongeveer 1,06 um / sec (Figuur 3A). GFP of mCherry-gelabeld BDNF zijn gebruikt om axonale verkeer van BDNF te volgen. De belangrijkste nadelen zijn dat ze niet helder genoeg voor single molecule studies. Ook de aanwezigheid van zowel anterograde en retrograde BDNF bewegingen maakt het moeilijk te beoordelen of de retrograde getransporteerd BDNF was een neurotrophin / receptorcomplex.
In deze video tonen we de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken. De ultrabrightness en uitstekende fotostabiliteit van quantum dots makes het mogelijk om lange termijn volgen van BDNF transport voeren. Deze technieken kunnen worden benut om de studies van axonale functie te verbeteren in AD, HD, en andere neurodegeneratieve aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Chirurgische en dier procedures worden uitgevoerd strikt volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle experimenten met het gebruik van dieren worden goedgekeurd door UCSD Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1 plasmideklonering, Expressie en zuivering van Mono-gebiotinyleerd BDNF (mBtBDNF)
OPMERKING: Construct pre-proBDNFavi en BirA cDNA in pcDNA3.1 vector en coexpress in HEK293FT cellen 10. Zuiver mBtBDNF gebruik van Ni-NTA korrels volgens eerder gepubliceerde werkwijze voor het produceren volwassen en biologisch actieve monobiotinylated nerve growth factor (mBtNGF) 10.
2 Voorbereiding van Microfluidic Chambers
Microfluïdische neuron kweken apparaat maakt het mogelijk fluïdisch isoleren axonen van neuron cellichamen. Assembleren kamers met vers gecoate dekglaasjes vlak voor elke dissectie. Microfluïdische kamers gebruiktIn dit protocol zijn de winkel heb gekocht (zie materialen en tafel apparatuur's). Handwas en hergebruikt in de winkel gekochte kamers tot 5-6x.
- Handwas microfluïdische kamers in 1% Alconox. Spoel driemaal met Milli-Q water gedurende 30 minuten elk. Handwas kamers weer in 70% ethanol.
- Indeling kamers te drogen op Parafilm in de laminaire stroming kap. Uitstralen en steriliseren beide zijden van de kamers voor 20 min onder UV. WINKEL gesteriliseerd kamers in een steriele 15 cm schaal met Parafilm afgesloten bij kamertemperatuur.
- Plaats 24 x 40 mm nummer 1 dekglaasjes in een glazen container. Week de dekglaasjes in 35% zoutzuur overnachten op een rotator. Op de volgende dag, spoel de dekglaasjes driemaal gedurende 30 min elk met water.
- Steriliseer de dekglaasjes voor een door dompelen elk dekglaasje in 100% ethanol en vlammen op een Bunsen brander. Bewaar droge dekglaasjes in een steriele petrischaal en bewaar deze op kamertemperatuur tot coating.
- Lag out de dekglaasjes in een 15 cm kweekschaal. Coat elk dekglaasje met 0,7 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) en incubeer in de kap bij kamertemperatuur.
- Na 1 uur, spoel de dekglaasjes driemaal met steriel water. Droog coverslips met vacuum en plaats elke dekglaasje in een 6 cm cultuur schotel.
- Om de microfluïdische kamer monteren, plaatst u de kamer met microgroove kant aan de onderkant op de PLL gecoat dekglaasje voorzichtig de microgroeven niet aan te raken. Voorzichtig ingedrukt de kamer met een pipet tip om ervoor te zorgen de kamer werd goed afgesloten.
3 Dissectie van neuronale Cultuur en plaat op Chambers
- Plaats twee E17-E18 ratten hippocampus (een brain) ontleed in een 15 ml conische buis met 2 ml dissectie buffer (HBSS, zonder calcium, geen magnesium, met 1% pen / strep en 10 mM HEPES. Spoel de weefsels met 3x 5 ml dissectie buffer elke keer. Verwijder de dissectie buffer zoveel mogelijk en voeg 900 ul vers dissection buffer.
- Om het weefsel te verteren, voeg 100 ul van 10x trypsine (2,5%) in de dissectie buffer 1x werkconcentratie maken. Plaats de conische buis in een 37 ° C waterbad. Na 10 min digestie, voeg 100 ul van 10 mg / ml DNase I bij een eindconcentratie ongeveer 1 mg / ml.
- Met een brand gepolijste Pasteur pipet glas voorzichtig vermaal het weefsel met en neer te pipetteren 5-10x. Direct na tritureren, doven de trypsine met 2 ml plaatmedium (Neurobasal met 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27).
- Laat het monster in de kap 5 minuten om vuil van de weefsels laten beneden naar de bodem. Verwijder voorzichtig 2 ml supernatans in een schone steriele 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer de pellet in 50 ul plating media
- Tel de cellen met hemocytometer. Load 15-20 pi celsuspensie (~ 40.000 cellen) in een compartiment van de microfluïdische kamer. Plaats de kamerin de incubator gedurende 10 minuten om de cellen te hechten aan het dekglaasje. Na 10 min, voeg meer plating media te vullen beide compartimenten van de kamer.
- Op de tweede dag van dissectie, volledig vervangen van de beplating media onderhoudsmedium (Neurobasal met 2 mM GlutaMax, 2% B27) in zowel het cellichaam en axon compartiment. Axonen van de hippocampus neuronen beginnen om de microgroeven steken in dag 3 en bereikt de axon compartiment tussen dag 5-7. Gedurende deze periode, vervangt de helft van de kweekmedia met vers onderhoudsmedium elke 24 ~ 48 uur.
4 Axonale Vervoer van QD-BDNF
- Voorafgaand aan wonen beeldvorming van QD-BDNF axonale transport, afbrekende BDNF van zowel het cellichaam en axon compartimenten van de microfluïdische kamer door grondig spoelen beide compartimenten met BDNF-vrij, serum vrije Neurobasal media elke 30 min gedurende 2 uur.
- Tijdens BDNF uitputting, bereiden de QD-BDNF conjugaten. Meng 50 nM van mono-gebiotinyleerde BDNF dimeer met 50 nM QD655-streptavidine conjugaten in Neurobasal media en incubeer op ijs gedurende 60 minuten.
- Verwijder media in de axon compartiment en voeg 300 ul QD-BDNF met een eindconcentratie van 0,25 nM gedurende 4 uur bij 37 ° C. De verspreidende van QD-BDNF in het cellichaam compartiment minimaliseren, is het zeer belangrijk om altijd een hoger media in het cellichaam compartiment onderhouden dan in de axon compartiment. Afwassen ongebonden QD-BDNF na incubatie voor live-imaging.
- Uitvoeren van live-imaging van QD-BDNF transport met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100X olie objectief. Verwarm de reikwijdte en de klimaatkamer verbonden aan een constante temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%). Gebruik een set van Texas rood excitatie / emissie kubussen de QD655 signaal visualiseren.
- Verwerven en vastleggen van time-lapse beelden binnen het midden axonen met de snelheid van 1 frame / sec voor een totaal van 2 min met behulp van een CCD-camera. Gebruik microgroeven zonder axonen that hebben geen QD en dus geen signaal als controle voor infiltratie.
- Analyseer BDNF transport met behulp van een software voor beeldanalyse of NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Productie en zuivering van biologisch actieve Mono-gebiotinyleerde BDNF
De expressievector van BDNF gefuseerd met een sequentie AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) werd gecre volgens een eerder gepubliceerd protocol 10. De molecuulmassa van de volledige lengte fusie-eiwit werd voorspeld ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated rijpe BDNF met een voorspelde molecuulmassa van 18 kDa (Figuur 1A) werd geproduceerd in HEK293FT cellen en gezuiverd uit geconditioneerde media zoals beschreven 10.
Verschillende fracties werden verzameld en gescheiden op een 15% SDS-PAGE. Gebruik van een konijn anti-Avi tag antilichaam, een band met een molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd gedetecteerd in de eerste fractie (Figuur 1B). Om de zuiverheid van het preparaat te testen werden de monsters gescheiden op SDS-PAGE en werden gekleurd door silver-kleuring. Zoals weergegeven in figuur 1C, de 18 kDa band het overheersende species in de eerste elutie. Streptavidine-agarose korrels pulldown assays werden uitgevoerd om de mate van biotinylering van de mBtBDNF preparaat beoordelen. Na pulldown met streptavidine-agarose korrels werden eiwitten die nog in het supernatant geprecipiteerd met 7% trichloorazijnzuur (TCA). Deze monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE en de blots werden gehybridiseerd met ofwel anti-Avi antilichamen (boven) het totale eiwit of HRP-streptavidine detecteren gebiotinyleerde eiwitten te detecteren. Onze resultaten laten zien dat alle signalen geassocieerd met de parels terwijl er geen band gedetecteerd in het supernatant (figuur 1D). We concluderen dus dat mBtBDNF werd gebiotinyleerd met een rendement> 99,9%.
Om de biologische activiteit van mBtBDNF in binden en activeren TrkB receptor te testen hebben we een 3T3 cellijn die TrkB expressie met ofwel rhBDNF (20 ng / ml) of pur behandeldceerde mBtBDNF (20 ng / ml) gedurende 10 minuten. Cellen die geen behandeling kregen werden ook verzameld als controle. Lysaten werden gescheiden op een 4-12% SDS-PAGE en een konijn anti-pTrkB antilichaam werd gebruikt om de gefosforyleerde TrkB sonde. Zoals getoond in figuur 1E, vergelijkbaar rhBDNF, mBtBDNF kon de fosforylering van TrkB induceren op een vergelijkbaar niveau. We hebben ook behandelde rat hippocampale neuronen met ofwel rhBDNF (20 ng / ml) of gezuiverde mBtBDNF (20 ng / ml) gedurende 48 uur. Gezuiverd mBtBDNF kon hippocampale neuriet uitgroei bevorderen in de mate van rhBDNF (figuur 1F). Om de co-lokalisatie van QD-BDNF met TrkB receptor te onderzoeken, werd QD-BDNF toegevoegd aan de hippocampus axon rat gedurende 4 uur bij 37 ° C. Neuronen werden vervolgens gefixeerd en immunologisch gekleurd voor TrkB. Zoals getoond in figuur 1G, QD-BDNF co-gelokaliseerd met TrkB. We concluderen dus dat mBtBDNF volledig actief in de biologische functie.
Live-Imaging van Axonale Vervoer van QD-BDNF in hippocampus Neuronen
Primaire embryonale rat hippocampale neuronen (E17-18) werden ontleed en uitgeplaat in de cel lichaam compartiment van microfluïdische kamer. Op dag 4 of 5 verlengd axons in de microgroeven in het axon compartiment. Op dag 7, de meeste axonen groeide uit tot de axon compartiment. QD-BDNF werd gemaakt door incuberen met streptavidine QD655 mBtBDNF bij een 1: 1 verhouding (QD: BDNF dimeer) op ijs gedurende 1 uur. QD-BDNF (0,25 nM) werd vervolgens aan het axon compartiment toegevoegd en gedurende 4 uur bij 37 ° C voorafgaand aan beeldvorming (figuur 2A).
Na incubatie werd QD-BDNF gevonden dat specifiek aan axons in de axon compartiment. In het cellichaam compartiment, werden QD signalen geaccumuleerd in de meeste proximale axonen en cellichamen waarin de QD-BDNF werd geïnternaliseerd in de axons en retrograde transport naar de cellichamen. Time-lapse afbeelding reeks QD-BDNF signalen binnen axonen werden in de microgroeven uitgevoerd. QD signals werden waargenomen in de meeste microgroeven met axonen terwijl zonder QD signaal kan worden gezien in de microgroeven in de afwezigheid van axonen, zodat deze weinig of geen diffusie van QD signaal van de axon compartiment naar het cellichaam compartiment (Figuur 2B).
In figuur 2C, werd een 80 urn lange segment van axons van hippocampale neuronen fluorescent geconstateerd gedurende 100 sec. Totaal 6 QD-BDNF signalen waren duidelijk te zien tijdens de video-opname. Drie QD signalen opgenomen verhuisde een richting naar het cellichaam (linkerkant). De QD evenement gelabeld door witte pijl (t: 31 sec tot t: 101 sec) verhuisde soepel naar de cel lichaam oversteken het hele veld in ~ 70 sec. Een andere QD evenement gelabeld door groene pijl (t: 1 sec tot t: 61 sec) verhuisde retrogradely eerste. Op t: 21 sec, de QD-BDNF verhuisde anterogradely gedurende 10 tot 20 seconden, en dan veranderd richting weer naar de cel lichaam. De QD evenement gelabeld door gele pijl (t: 1 sec tot t: 71 sec) verhuisde ook retrograd ely, maar gepauzeerd voor ~ 20 sec tijdens de beweging. QD-BDNFs dat bewegen niet werden tijdens deze 100 sec werden stationair beschouwd. Enige bewegende voorwerpen werden later geanalyseerd om bewegende snelheid, gemiddelde snelheid te berekenen, en de tijd gepauzeerd.
Data-analyse in QD-BDNF Transport kymograaf
Kymographs zijn gemaakt van elke film die is opgenomen met behulp Metamorph software. Zoals in de representatieve kymographs van QD-BDNF vervoer (Fig 3A), werden QD-BDNF bewegingen opgetekend gedurende 120 sec in een 80 micrometer lang segment van axonen. In representatieve kymograaf 1, QD-BDNF bewoog snel en soepel naar links (cellichaam), kruiste het veld (80 micrometer) in ~ 60 sec, met zeer korte pauzes (Supporting Video S1). Terwijl in representatieve kymograaf 2, een QD-BDNF reisde ~ 50 micrometer in 120 sec retrogradely, met ten minste drie segmenten van langere pauzes (aangegeven met pijlen) (Supporting Video S2).
content "> Figuur 3B is de scatter plot van bewegende snelheid, gemiddelde snelheid, en onderbroken tijd van elke afzonderlijke QD-BDNF. De bewegingssnelheid van de QD-BDNF was relatief snel, variërend 0,47-1,97 um / sec met het gemiddelde van 1,06 ± 0,05 um / sec. De gemiddelde snelheid van QD-BDNF werd berekend als reisafstand / tijd gebruikt. En omdat BDNF gepauzeerd tijdens het transport, de gemiddelde snelheid was veel lager dan het verplaatsen van snelheid met een gemiddelde van 0,48 ± 0,03 um / sec (variërend 0,17-1,59 um / sec). Paused tijd werd ook geanalyseerd als een karakterisering van het BDNF-beweging. De gemiddelde duur van de pauzes was 15,88 ± 1.30 sec (variërend 6-33 sec) (tabel 1).
Figuur 1 Zuivering van biologisch actieve, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) Een schematische tekening toont de productie van mBtBDNF. Zowel pre-proBDNFavi en BirA werden gekloneerd in de vector pcDNA3.1myc-zijn zoals beschreven 10. (B) Verschillende fracties elueert uit Ni-hars werden verzameld en gescheiden op een 15% SDS-PAGE gel. Een konijn anti-Avi tag antilichaam werd gebruikt in de blot. Een band met een schijnbaar molecuulgewicht van ~ 18 kDa werd opgenomen in het elueren, in overeenstemming met het voorspelde molecuulgewicht van het rijpe eiwit mBtBDNF. (C) A zilverkleuring gel toont de 18 kDa mBtBDNF het overheersende species in de elutiefractie. (D) Gezuiverd mBtBDNF werd geïncubeerd met streptavidine-agarose korrels. De parels werden gewassen en gekookt in SDS laadbuffer terwijl het supernatant werd neergeslagen met TCA voor SDS-PAGE-analyse. De blot werd gehybridiseerd met ofwel anti-Avi antilichaam of met HRP-streptavidine. (E) 20 ng / ml gezuiverd mBtBDNF of rhBDNF werd toegevoegd aan een 3T3 cellijn die expresses TrkB voor 10 minuten. Lysaten werden geoogst en gescheiden op een 4-12% SDS-PAGE. Controle cellysaat werd geanalyseerd. De blot werd gehybridiseerd met konijnen-anti-pTrkB antilichaam. Totaal TrkB werd onthuld met behulp van een muis anti-TrkB antilichaam. (F) 20 ng / ml gezuiverd mBtBDNF of rhBDNF werd toegevoegd aan hippocampale neuronen rat gedurende 48 uur. DIC beelden werden genomen om neuriet-uitgroei te analyseren. (G) QD-BDNF werd geïncubeerd met rat hippocampus neuron axonen voor 4 uur (schaal bar 5 micrometer). Neuronen werden vervolgens gefixeerd en immunologisch gekleurd voor TrkB.
. Figuur 2 Single-molecule beeldvorming van retrograde transport van QD-BDNF in axonen (A) Bovenaanzicht: Een schematische tekening van microfluïdische kamer met primaire neuronen plated in de cel lichaam compartiment. Axonen groeide over de microgrooves in het axon compartiment. QD655 gemerkte BDNF werd toegevoegd aan het axon compartiment. Zijaanzicht: De media-niveau in de axon compartiment werd lager gehouden dan de cel lichaam compartiment om diffusie van QD signaal te minimaliseren. (B) Rode fluorescentie beelden en DIC beelden van cellichaam compartiment, microgroeven en axon compartiment. QD-BDNF specifiek gebonden aan axons, geïnternaliseerd en retrograde getransporteerd naar de cellichamen langs de axonen. Geen QD signaal werd waargenomen in de afwezig microgroeven axonen. (C) Time-lapse video image reeks QD-BDNF vervoer langs de axon. Zowel bewegende als stilstaande QD-BDNF signalen waren aanwezig in de meeste van de films. Op het tijdstip t: 1 sec, kan op zijn minst 4 QD's te zien is. Na 10 sec, zijn twee QD's (aangegeven met groene en gele pijlen) op weg naar de cel lichaam (links van het beeld). Deze twee QD's bewegen en pauze in de eerste paar beelden en uiteindelijk uit te gaan van de beelden naar links (bij ~ 70 sec). Een andere QD verplaatst naar het veldbij t: 31 sec (aangegeven met witte pijl) en bewogen snel zonder veel pauzes links.
Figuur 3 QD-BDNF vervoer kymograaf en data-analyse. (A) Vertegenwoordiger kymographs van QD-BDNF vervoer in primaire hippocampale neuronen. In Kymo 1, een heldere QD verplaatst over het gebied met relatief hoge snelheid met slechts een paar korte pauzes. In Kymo 2, de bewegingssnelheid van de QD was langzamer, en de beweging werd onderbroken met frequentere en langere pauzes. (B) Scatter plot van QD-BDNF bewegende snelheid, gemiddelde snelheid (berekend als reisafstand / tijd gebruikt) en onderbroken tijd. De gemiddelde bewegingssnelheid van QD-BDNF was 1,06 ± 0,05 um / sec (variërend 0,47-1,97 um / sec. Het gemiddelde snelheid van QD-BDNF was 0,48 ± 0,03 um / sec (van 0. 17-1,59 um / sec). De gemiddelde duur van pauzes was 15,88 ± 1,30 sec (variërend 6-33 sec).
Ondersteunende Video S1 . Vertegenwoordiger QD-BDNF vervoer video 1 Verschillende QD-BDNF bewegen snel naar links (cellichaam) met zeer weinig korte pauzes.
Ondersteunende Video S2 . Vertegenwoordiger QD-BDNF vervoer video 2 Verschillende QD-BDNF bewegen relatief langzaam naar links kant (cellichaam) met frequente en lange pauzes.
| Minimum | Maximale | Betekenen | 88px;. "> Std fout||
| Bewegingssnelheid (micron / sec) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| Gemiddelde snelheid (micron / sec) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| Gepauzeerd (sec) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Tabel 1: Analyse van de gegevens van de QD-BDNF vervoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie rapporteren we de ontwikkeling van een nieuwe techniek om biologisch actieve produceren monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) die kunnen worden gebruikt axonaal transport van BDNF sporen. Door het combineren van het eiwit aan quantum dot streptavidine, en met behulp van een microfluïdische kamer, de methode maakt het mogelijk om axonale transport van BDNF in primaire neuronen met 'single molecule gevoeligheid, in real-time en met ruimtelijke en temporele resoluties te detecteren. De instrumenten hierin gebruikt een middel waarmee de moleculaire machines die axonaal transport van BDNF / TrkB endosomen van neuronen in gezondheid en ziekte bemiddelen bestuderen.
BDNF-GFP, of -mCherry zijn gebruikt om axonale verkeer van BDNF volgen op verschillende neuronale kweken in vitro. Deze reagentia bieden een optie voor de behandeling van anterograde vervoer en, eventueel, voor de behandeling van autocrine activering van TrkB. Er zijn echter grote nadelen voor het bestuderen van retrograde transport, de meest in het oog springende van WHIch is dat GFP of mCherry zijn niet helder genoeg voor single molecule studies. Voorafgaande studies toonden aan dat onder fysiologische concentraties NGF, NGF werd een dimeer geïnternaliseerd 11 en retrograde getransporteerd 8. Belangrijk is het gebruik van QD BDNF maakt het ook mogelijk om de subcellulaire locatie waarop BDNF TrkB bindt de receptor te bepalen. In gebruik GFP of mCherry-gemerkte eiwitten, zal Somal expressie resulteert in de aanwezigheid in het axon van eiwitten ondergaan en anterograde en retrograde transport. Als zodanig kan het moeilijk om te beoordelen of en waar retrogradely vervoerd BDNF tegengekomen zijn receptor voorafgaand aan het vervoer retrograde. Inderdaad, als een speculatie, retrograde transport binnen axonen van BDNF-GFP of BDNF-mCherry geproduceerd in dezelfde neuron kan verschillen van die na binding van BDNF in het doel van de innervatie.
Hoewel chemische verknoping is gebruikt voor het produceren van biologisch actieve zenuwgroeifactor(NGF), de hierin geïntroduceerde methode superieur. Ten eerste is het moeilijk om nauwkeurig te regelen de omvang van biotinylering; bijvoorbeeld elke NGF werd gelabeld met biotine-eenheden 5-9 8,9,12. Ten tweede kan het eiwit crosslinking inactiveren. Voor NGF verknoping noodzakelijk de bevestiging aan carboxylgroepen 13. Bij BDNF, wordt de activiteit vaak verloren volgende chemische verknoping aan biotine. Tenslotte kan de mate van verknoping onvolledig zijn. Een recent rapport toonde aan dat ~ 0,8 biotine / BDNF molecuul werd geproduceerd door chemische verknoping; als zodanig ~ 20% van BDNF was niet gelabeld 9. De aanwezigheid van ongelabelde BDNF kon de interpretatie van de resultaten bemoeilijken.
De techniek biedt de unieke voordelen die BDNF alle moleculen gelabeld met een enkele biotine op dezelfde plaats, waardoor een homogene bereiding van gebiotinyleerd BDNF vormen. Door het vervoegen om nanofluorescent deeltjes zoals quantum dots, kunnen mBtBDNF zijngebruikt voor het bijhouden van de wegen en processen die BDNF is geïnternaliseerd, verhandeld onder neuronen: in dendrieten, axonen in en in cellichamen. Deze methode maakt het mogelijk om het gebruik van alternatieve tags voor BDNF. De ontwikkeling van andere soorten nanodeeltjes belooft extra voordelen.
Defecten in axonale handel en de signalering van BDNF zijn betrokken bij neurodegeneratieve ziekten. Sterk bewijs is gebrekkig transport van BDNF gekoppeld aan corticale-striatum atrofie bij de ziekte van Huntington 14,15. Mutant huntingtine eiwit interfereert met de interactie tussen Huntingtine-geassocieerde eiwit-1 (HAP1) en dynein motor sympathische neuronen remt BDNF transport, en resulteert in het verlies van neurotrofe ondersteuning en neuronale toxiciteit 16-18. De technieken van het bijhouden axonale verkeer van BDNF kan dienen als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen axonale functie neurodegeneratieve aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Yue (Pauline) Hu, Rachel SINIT bedanken voor hun technische bijstand. Het onderzoek wordt ondersteund door NIH-subsidie (PN2 EY016525) en door de financiering van het syndroom van Down Research and Treatment Foundation en de Larry L. Hillblom Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
