Summary
L'objectif de ce protocole est de réaliser un test de comportement tels que l'ensemble attentionnel transfert de tâches (AST) pour évaluer la flexibilité cognitive préfrontal cortex médiation chez la souris.
Introduction
L'ensemble attentionnel transfert de tâches (AST) a été développé comme une mesure de l'attention et de la flexibilité cognitive chez les rats plus d'une décennie il ya 1,2. AST est calquée sur la composante intradimensional / extradimensionnel de la Cambridge neuropsychologique Automated Test Batterie (CANTAB) qui est utilisé pour identifier le dysfonctionnement cognitif chez les humains et les primates non humains 3,4. Bien que la capacité d'apprendre des règles simples reste intacte, les déficits dans l'apprentissage de modifier une réponse quand les règles ont changé sont trouvés chez les patients souffrant d'une variété de troubles neuropsychiatriques (c., la schizophrénie, les troubles obsessionnels compulsifs, dépression), des troubles neurodégénératifs (c.-à- la maladie de Parkinson) et chez les patients présentant des lésions au cortex préfrontal 5. Plus généralement, ces patients sont décrits comme ayant des déficits cognitifs dans la flexibilité. Déficits analogues ont été montré dans les deux primates non humains et les rongeurs lorsque les lésions to le cortex préfrontal ont été induite 1,6-8. Ces déficits indiquent un état de rigidité cognitive ou une capacité réduite de se déplacer ensemble attentionnel.
Un ensemble attentionnel est formé quand un sujet apprend qu'un ensemble de règles peut être appliquée à des stimuli complexes afin de différencier pertinente à partir d'indices pertinents. Par exemple, dans l'AST, les animaux vont apprendre à faire attention et répondre à la queue pertinentes (ie, moyen creuser) et ignorer un repère pertinent (ce est à dire, l'odeur), en associant une récompense alimentaire avec le milieu. Cette association est alors renforcée dans les tâches ultérieures où le type de creuser changements de moyennes et d'odeur, mais l'association jumelé entre les moyennes et récompense reste. Cette règle renforcé forme un ensemble cognitif. Deux étapes dans le protocole de mesure AST aspects de la flexibilité cognitive: inversion et le passage extra-dimensionnelle. Au stade de la reprise, les stimuli négatifs précédemment dans une dimensin (milieu dans cet exemple) est maintenant positive, ce qui remet en question l'animal à ignorer les stimuli positifs de l'étape précédente. Par exemple, si le milieu était senti creuser les stimuli positifs dans l'étape précédente et de papier était les stimuli négatifs, maintenant ce est l'inverse. Cela remet en question la flexibilité de l'animal en ce qu'elle doit maintenir l'ensemble de l'attention (ce est à dire, le milieu est la dimension pertinente) tout en modifiant la règle appris de relance et la récompense paire dans une dimension. La formation d'un ensemble attentionnel est contestée au stade de changement extra-dimensionnelle, lorsque la dimension non pertinente (odeur dans cet exemple) devient la dimension pertinente. Une réponse persévérative, comme indiqué par un choix continu en utilisant la règle appris précédemment, à chaque étape reflète un déficit de flexibilité cognitive.
études de lésion dans les deux primates non humains et les rongeurs ont montré des régions spécifiques du cortex préfrontal peut être attribuée à la capacité de perform étapes particulières de l'AST 1,9. Les lésions au cortex orbitofrontal (OFC), une sous-région du cortex préfrontal (PFC), ont été montré pour induire des déficits dans l'inversion d'apprentissage sur le AST 8. En outre, les lésions à la cortex préfrontal médial (MPFC) conduisent à des difficultés particulières dans l'exécution du décalage extra-dimensionnelle.
Alors que de nombreuses études utilisant l'AST ont été exécutées dans les rats et les primates non humains, relativement peu ont utilisé AST comme une mesure de la fonction cognitive chez les souris. Compte tenu de la facilité de manipulation génétique chez la souris, et la nécessité cruciale pour mesurer la fonction du cortex préfrontal à étudier une variété de troubles, l'adaptation et la validation de cette mesure comportementale chez la souris est un ajout important à la recherche sur les maladies associées à un dysfonctionnement PFC. Le protocole détaillé ici est une modification de la procédure de Brown et Birrell 1 qui est optimisé pour des applications dans des souris et reflète un grand nombre de souris spécifiadaptations c qui ont été précédemment rapportées 2,6,10-13.
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Protocol
REMARQUE: Les animaux utilisés dans cette étude sont des hommes C57Bl / 6J entre 4 et 6 mois pour des résultats optimaux. Souris sont maintenus sur un cycle de feu de recul afin de les tester commodément pendant la phase (foncé) active. Si le comportement est effectuée dans une pièce séparée du logement, les souris sont autorisés au moins 1 heure pour se acclimater transport suivant à la salle d'examen. Test comportemental est effectuée dans des conditions de lumière rouge minimiser les perturbations pour l'activité normale des souris aussi peu que possible tout en permettant l'éclairage suffisant de l'expérimentateur de suivre visuellement la session de test.
REMARQUE: Tous les aspects de la procédure expérimentale décrite ici ont été effectuées en accord avec le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, 8e édition (CNRC) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio.
- Garnissez les ramequins en céramique (non-poreux; 1.5 "profondeur x 2,5 'de diamètre), à la jante intérieure avec creuser moyenne (environ 1" du bas); tours de papier filtre coupées en deux et soudées à l'intérieur arrière du ramequin (figure 1A)
- Casser céréales de petit déjeuner légèrement sucré sec (récompense alimentaire) - Honey Nut ou variétés enrobés de sucre, dans environ 20 mg pièces pour acclimatation, de formation et de test étapes.
- Faire un ensemble attentionnel transfert de tâches (AST) chambre (figure 1B): Acclimatez train et tester chaque souris dans des chambres individuelles; recommander la production d'au moins 8 chambres.
- Construire une chambre de AST 12 "x 8" x 7 "; murs et portillon de départ en acrylique blanc opaque qui est facile à nettoyer avec 70% d'éthanol. Le style de guillotine, grille de départ amovible sépare chambre dans une zone d'attente (5 "x 8") et de la zone de test (7 "x 8").
- Inclure une Effacer 5221; x7 "cloison amovible qui sépare deux côtés de la zone de test de manière uniforme; couper trois ¼ "trous d'un diamètre dans la partie inférieure de la cloison pour permettre un accès en reniflant, espacée 1" et une part "de l'avant de la cloison (Figure 1C).
2. Procédure Aperçu (Figure 2)
- Avant AST, souris de maison individuelle et de leur permettre de se adapter à un cycle lumière inverse pour au moins une semaine.
- Acclimater, de former et tester chaque animal dans des chambres de tests individuels. Attribuez à chaque chambre pour une souris et propre avec 70% d'éthanol après avoir terminé la dernière journée d'essais. Cela permettrait de minimiser le stress lors des essais en faisant l'odeur de chambre comme "la maison-cage" ou "auto".
- Parfumer les pots de test deux jours avant l'essai pour permettre l'odeur se dissipe; souris ne sera pas creuser dans des pots qui ont une odeur très forte. En utilisant une seringue avec une aiguille G 25, ajouter environ 0,1 ml dehuile essentielle à la partie supérieure du papier filtre.
3. Manipulation (Jours 1-8)
- Poignée souris à partir 8 jours avant le premier jour de la restriction alimentaire. Cela permettra de réduire le stress associé à la manipulation au cours des essais.
- Peser et le poids corporel record chaque jour de la manipulation. Manipulez chaque souris 2-3 min par jour.
- Si plusieurs expérimentateurs doivent être impliqués dans l'essai d'un ensemble de souris, se assurer que chaque expérimentateur participe au processus de traitement pour augmenter la familiarité avec les expérimentateurs et réduire le stress et l'anxiété ont connu sur la formation ou de jours d'essais.
- Continuer poids de manutention et d'enregistrement pendant la durée du test.
4. La restriction alimentaire (9-12 Jours)
- Début 4 jours avant le début de l'acclimatation, placez la souris sur un régime restreint pour maintenir souris à 80-85% de leur poids corporel d'alimentation libre. Donner 1 gramme d'aliment par souris par jour. Si le poids du corps tombe au-dessousla gamme spécifiée donner deux grammes par jour jusqu'à ce qu'ils retournent à la gamme appropriée.
- Placez deux ramequins à l'avant de chaque cage d'accueil afin de permettre souris se acclimater aux pots de test. Ce sont les mêmes points utilisés pour former la souris pour creuser pour une récompense alimentaire.
- Ajouter 2 grammes de nourriture et une pièce de récompense alimentaire (un demi-morceau de céréales dans chaque) dans les ramequins chaque jour pendant quatre jours.
- Si le comportement doit être effectuée dans une pièce séparée de celle où les souris sont logées, en commençant le jour 1 de la restriction alimentaire, les souris de transport à la chambre d'essai pendant au moins une heure par jour avant de retourner à la chambre de logement pour permettre les se acclimater à la chambre d'essai.
- Le dernier jour de la restriction alimentaire, avant le début de l'acclimatation, changer la litière maison de cage. La literie de la cage ne sera pas modifié à nouveau qu'après le test est terminé pour réduire le stress ou l'anxiété vécue pendant la formation et les tests (sauf si absolument nécessaire).
- Maintenirsouris sur la restriction alimentaire jusqu'à la fin des essais. Les jours de 13 à 17, donner de la nourriture de souris après acclimatation, la formation, ou les tests basés sur une estimation de la quantité de récompense en nourriture consommée (en général <1g de boulette de nourriture).
5. Acclimatation (jours 13 à 14)
- Début deux jours avant le début de la formation, effectuez l'acclimatation pendant le cycle sombre sous lumière rouge.
- Étendre une petite quantité de litière sale de la cage de la maison dans la chambre, cela permettra de réduire le stress d'être dans un nouvel environnement en introduisant une «maison-cage" familier ou "auto" l'odeur de la chambre d'essai (la même chambre sera utilisé pour une seule souris pour la durée de la formation et des tests).
- Placer un ramequin nettoyer à l'eau dans la zone d'attente de la chambre; souris ont tendance à ne pas manger se ils ne ont pas accès à l'eau.
- Placez les ramequins deux qui ont été utilisés pour la restriction alimentaire dans la zone de test avec une récompense alimentaire (~ 20Morceau de céréale mg) dans chacun d'eux.
- Placez la souris dans la zone d'attente; retirer le portillon de départ et laisser la souris pour explorer la chambre pendant 1 heure.
- Faire continuellement récompenses alimentaires (~ 20 mg de pièce de céréales) aux ramequins vides afin d'encourager les souris pour explorer la région de test et les pots fréquemment.
- Se assurer que la souris ne peut pas voir l'expérimentateur tout au long de la période d'acclimatation de sorte que la présence de l'expérimentateur ne est pas un facteur de stress supplémentaire pendant l'essai.
6. Formation (Jour 15)
- Placez la souris dans la zone d'attente.
- Placez les ramequins vides, contenant chacun une récompense alimentaire (~ 20 mg de pièce de céréales), dans la zone de test et soulever le portillon de départ. Laisser la souris 3 min pour récupérer les deux récompenses alimentaires. Répétez cette étape plusieurs fois.
- Ajouter graduellement la literie de la cage de sciure / souris pour les pots dans des essais ultérieurs. Autoriser la souris 3 min pour récupérer la récompense alimentaire de chaque pot avant de terminer la trial. Une fois que la souris a récupéré la récompense alimentaire de chaque pot, procéder à l'essai suivant. Si la souris ne fait pas les tentatives de creuser une fois la récompense alimentaire est partiellement couvert, des conseils peuvent être fournis (ce est à dire, saupoudrer de la poussière de céréales sur la zone de la récompense alimentaire, faire un renfoncement dans la sciure sur la zone de récompense alimentaire, de découvrir une partie de la récompense alimentaire).
- Continuez à ajouter de la sciure / litière après chaque essai jusqu'à ce que la récompense alimentaire est entièrement couvert et la souris démontre de façon fiable la capacité de creuser dans un pot plein de trouver la récompense alimentaire.
- Si une souris n'a pas démontré de façon fiable la capacité de trouver une récompense alimentaire dans un pot plein au sein de 2 heures du début de la formation, continuer à une deuxième journée de formation. Maintenir la souris sur la restriction alimentaire et répétez cette procédure le lendemain.
- Si la souris ne parvient pas à creuser pour une récompense alimentaire après deux jours successifs, l'exclure du reste de l'expérience, et d'annoter comme un "pas réussi à creuser" dans l'expfiche erimental.
7. Test (Jours 16-17):
- Le premier jour, tester la discrimination simple (SD), la discrimination composé (CD), inversion (R1), et le déplacement intra-dimensionnelle (IDS).
- Sur deux jours, tester le changement intra-dimensionnelle 2 (IDS2), changement intra-3 dimensions (IDS3), inversion 2 (R2; en option), changement extra-dimensionnelle (EDS).
- Paire médias et de senteurs que présentés dans le tableau 1.
- Au moment de la manipulation, le jour du test, donner souris une récompense alimentaire pour éviter un manque de concentration pendant les essais en raison de la faim. De ce point jusqu'à la fin de la journée de tests, ne fournit pas d'autre nourriture que des récompenses pour les bons choix.
- Au début des essais, en utilisant une pince (limite la propagation d'odeurs entre pots), placez un morceau de la récompense alimentaire dans le pot qui indique un choix correct. La récompense alimentaire devrait être entièrement couvert par les médias (voir Figure 3). Pour éviter une queue de parfum de la récompense alimentaire, saupoudrer de la poussière de céréales over tous les pots au début de la scène.
- Placez la souris dans la zone d'attente à la porte de départ fermé. Placez les pots de chaque côté de la chambre d'essai. Le procès commence lorsque le portillon de départ est retirée et la temporisation est démarrée. Permettre à chaque souris à 3 min par essai de faire un choix. Enregistrez le choix (correcte ou incorrecte) et le temps jusqu'à ce que la souris a fait un choix pour chaque essai.
REMARQUE: Un «choix» est indiqué par une tentative de creuser dans les deux pot. Une fouille ne est enregistré comme un choix si la souris a déplacé les médias et fourré son nez assez loin dans l'espace qu'il crée pour trouver la récompense alimentaire ou assez déplacés des médias pour découvrir la récompense alimentaire. Si une souris n'a pas fait un choix moins de 3 min, ce est enregistré comme pas le choix (inexacte). - Une fois qu'un choix a été fait pour les deux pot, retirer la casserole qui n'a pas été choisi dans la chambre d'essai. Si un bon choix a été fait, permettre à la souris pour terminer la récompense alimentaire avant de placer la souris dans le dosla zone d'attente. Si un mauvais choix est fait, permettre à la souris pour explorer le pot de montrer qu'il n'y a pas de récompense alimentaire pour ce choix avant de retourner la souris vers la zone d'attente.
- À la fin de chaque essai, placez la souris de retour dans la salle d'attente et remplacer le portillon de départ.
- Assurez-vous que la souris répond au critère des huit essais corrects affilée pour faire avancer à la prochaine étape de l'AST. Si une souris ne obtient pas huit bons choix consécutivement à moins de 50 essais, il échoue ce stade et ne peut se déplacer pour compléter le test. 6 aucun consécutives choix (3 min sans choix) est un échec à participer et interdit la souris de passer à l'étape suivante.
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Representative Results
La mesure dépend typique de ce test est le nombre d'essais par étape pour atteindre le critère (ou 8 choix consécutives correctes). La figure 4A montre le nombre moyen d'essais pour satisfaire au critère à chaque étape traitée C57BL / 6J utilisant l'AST. Comme les souris forment un ensemble attentionnel sur la dimension de repère pertinent (odeur ou médias), la performance va se améliorer, comme indiqué par une réduction des essais pour satisfaire au critère en équipes intradimensional successives, et les étapes d'inversion et le changement extradimensionnel exigera des essais supplémentaires pour répondre critère. Il est important de contrebalancer le nombre d'animaux qui commencent sur chacune des deux dimensions pertinentes (ie, les médias ou odeur) comme nous l'avons observé une différence au stade de la simple discrimination traduit par une augmentation du nombre de procès au critère si l'odeur est la pertinente cue (figure 4B). Si les essais pour atteindre le critère au stade de la SD sont significativement différentes entre èmee deux dimensions de repère pertinents (soit une meilleure performance lorsque les médias est pertinente que dans la figure 4B), les données de performance pour chaque souris pendant les étapes ultérieures peuvent être normalisées à sa performance lors de l'étape de la discrimination simple. Comme illustré sur la figure 4C, cette étape de normalisation réduit la variabilité associée à l'apprentissage de la queue initialement pertinent et améliore la visualisation des performances améliorées sur les étapes ultérieures IDS. Bien que la taille des groupes de ~ 20 souris seront suffisantes pour permettre l'analyse des données brutes sans normalisation. Surtout, une augmentation significative dans les essais pour répondre critère pendant le quart extradimentional rapport aux changements intradimentional précédentes indique est une mesure de contrôle importante de la validité de l'essai (figure 4D et 4E). Avant l'étape de décalage ED, souris apprendre à faire attention à une seule dimension de repère pertinent (odeur ou médias) afin de localiser la récompense. Le passage à une amendew dimension de repère pertinent, qui était auparavant hors de propos, devrait exiger plus d'essais pour atteindre critère, résultant en un changement ID / ED. Fait intéressant, l'analyse du changement ID / ED dans les données brutes révélé une augmentation significative dans les essais pour atteindre le critère entre IDS2 et ED (figure 4D), et la tendance vers une augmentation entre IDS3 et ED (données non présentées, p <0,1) et une augmentation moyenne entre les essais pour accéder critère de IDS2 et IDS3 rapport à ED (données non présentées). Fait intéressant, une importante évolution ID / ED était apparente entre les deux IDS2 et IDS3 rapport à ED lorsque les données ont été normalisées à la performance au stade de la SD (figure 4E).
Il est prévu qu'environ 70 à 80% des souris de contrôle complétera la tâche entière (20-30% de taux d'abandon out). Mesures dépendantes alternatifs comprennent latence moyenne de faire un choix, telle que mesurée à chaque étape de la tâche (même si nous avons trouvé que ce était très variable entre les souris),nombre total d'erreurs et le nombre d'erreurs "set-perte" à la reprise et étages de décalage extra-dimensionnelles selon la Lapiz-Bluhm et al. 14, comme le nombre de fois un mauvais choix a été prise après trois ou plus consécutivement bons choix. Un nombre accru d'erreurs "set-perte" peut indiquer un comportement persévérative. En outre, les souris complètent généralement chaque étape de tests en moins de 30 min (Figure 5), et la durée du temps passé dans chaque étape est une fonction d'essais pour atteindre critère.
Dans une étude précédente en utilisant un paradigme similaire à celle détaillée ici, lésions neurotoxiques à l'OFC ou l'CPFm chez la souris ont été montrés à nuire à la performance dans les étages de décalage inversion et extra-dimensionnelles, respectivement, de valider l'utilisation de ce test pour déterminer les déficits fonctionnels dans le mêmes régions que le rat et études11 primate non humain. Bien que la séquence des tâches dans l'étude susmentionnée vBélier légèrement à celle représentée ici, il est prévu que les lésions ou les déficits du OFC et CPFm se traduiront également par une diminution du rendement en R1 et EDS, comme en témoigne l'augmentation du nombre d'essais au critère à ces stades. .
| Étape | Pertinent | Exemples | Pertinent | Exemples | ||
| Discrimination simple (SD) | Moyen | Felt (+) | Papier (-) | Odeur | Muscade (+) | Rosemary (-) |
| Composé discrimination (DR) | Moyen | Felt (+) / Nutmeg | Papier (-) / Rosemary | Odeur | Muscade (+) / Felt | Rosemary (-) / Document |
| Felt (+) / Rosemary | Papier (-) / Nutmeg | Muscade (+) / Document | Rosemary (-) / Felt | |||
| Inversion 1 (R1) | Moyen | Papier (+) / Rosemary | Felt (-) / Nutmeg | Odeur | Rosemary (+) / Document | Muscade (-) / Felt |
| Papier (+) / Nutmeg | Felt (-) / Rosemary | Rosemary (+) / Felt | Muscade (-) / Document | |||
| Maj Intradimensional (IDS) | Moyen | Pompons | Paillettes (-) / Clove | Odeur </ Td> | Cannelle (+) / Pompons | Clove (-) Paillettes / |
| (+) / Cannelle | ||||||
| Pompons (+) / Clove | Paillettes (-) / cannelle | Cannelle (+) / Paillettes | Clove (-) / Pompons | |||
| IDS2 | Moyen | Pipecleaners | Yeux écarquillés (-) / Ginger | Odeur | Thym rouge (+) / pipecleaners | Ginger (-) / Yeux écarquillés |
| (+) / Thym rouge | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Yeux écarquillés (-) / thym rouge | Thym rouge (+) / yeux écarquillés | Ginger (-) | |||
| IDS3 | Moyen | Ruban (+) / vanille | Bandes métalliques (-) / Lemon | Odeur | Vanilla (+) / ruban | Lemon (-) / bandes métalliques |
| Ruban (+) / Lemon | Bandes métalliques (-) / vanille | Vanilla (+) / bandes métalliques | Lemon (-) / ruban | |||
| R2 | Moyen | Bandes métalliques (+) / vanille | Ruban (-) / Lemon | Odeur | Lemon (+) / ruban | Vanilla (-) / bandes métalliques |
| Bandes métalliques (+) / Lemon | Ruban (-) / vanille | Lemon (+) / Métal bandes lic | Vanilla (-) / ruban | |||
| Maj extradimensionnel (EDS) | Odeur | Citronnelle (+) / Raphia | Anis (-) / mousse | Moyen | Raphia (+) / citronnelle | Mousse (-) / Anise |
| Citronnelle (+) / mousse | Anis (-) / Raphia | Raphia (+) / Anise | Mousse (-) / citronnelle | |||
Tableau 1. Exemples de combinaisons d'odeur et moyennes creuser. Les senteurs et les médias creuser dans ces combinaisons ont été validées dans cette étude. Les résultats représentatifs obtenus en utilisant ces combinaisons spécifiques sont présentés à la figure 2.
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Figure chambre d'essai 1. AST. (A) Image et les dimensions des ramequins et l'exemple de placement de papier filtre. (B) Image de la chambre d'essai AST adapté pour les souris et (C) un diagramme en trois dimensions de la chambre d'essai, illustrant le placement des trous dans la cloison.
Figure 2. Creuser moyenne. Des exemples de creuser paires moyennes utilisés dans ce protocole que détaillée dans la liste des matières (ii.-xi.). Pots sont remplis approximativement à la jante intérieure avec creuser moyenne.
Figure 3. Timeline pour les tests.
Figure 4. C57BL / 6J performance dans l'AST. (A) Nombre moyen d'essais pour satisfaire au critère dans le AST masculins C57BL / 6J. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 22 souris / groupe), p = 0,013 pour effet principal de l'étape. (B) Nombre moyen d'essais pour atteindre critère au stade de la SD pour des dimensions distinctes de repère pertinents initiales. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 22 souris / groupe), * p = 0,01. (C) les données normalisées représentés en pourcentage de la performance individuelle de chaque souris au stade de la SD. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 22 souris / groupe), p = 0,06 pour effet principal de l'étape. (D) décalage ID / ED dans les essais pour atteindre le critère entre IDS2 et ED. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 22 souris / groupe), * p = 0,03. (E) changement ID / ED en données normalisées entre IDS3 et ED. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 22 souris / groupe), * p = 0,012.
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Discussion
Les déficits de la flexibilité cognitive médiées par le PFC représenter une incapacité significative associée à une variété de troubles neurologiques et neuropsychiatriques, et peuvent avoir un impact majeur sur les résultats et la qualité de vie des personnes souffrant de ces troubles. Optimisation de l'AST pour une utilisation chez les souris est vital pour enquêter sur les fondements génétiques des maladies couplés à corticale préfrontale dysfonctionnement cognitif médiation. Nous avons trouvé que le procédé décrit ci-dessus est une mesure fiable d'un déficit cognitif spécifique, la flexibilité cognitive, et est très proche des résultats obtenus en utilisant cette tâche chez des rats et des primates non humains. La méthode décrite est le résultat d'une étude approfondie des protocoles décrits précédemment chez les rats et les souris ainsi que des conseils et des conseils d'experts à notre institution.
Les rapports précédents en utilisant des tâches similaires sur des souris ont démontré la capacité d'adaptation d'une telle mesure comportementale, mais avecplusieurs mises en garde 2,6,11. Colacicco et al. Limité le nombre de discriminations testés par jour à 2, qui se propagent tests sur une période de quatre jours 11. Cela comprenait répétitions de paires de stimuli déjà appris sur jours d'essais consécutifs. Bien qu'elle soit efficace, en vue de développer le protocole présenté ici est de minimiser la durée de la période d'essai et de maximiser l'efficacité. Ici, nous limitons tests pour une période de deux jours et d'éliminer les répétitions de paires de stimuli déjà apprises. Des chercheurs ont déjà constaté que les souris nécessitent surentraînement pour former un ensemble attentionnel et présentent une petite «fenêtre d'testabilité" dans lequel ils vont maintenir répondre de l'effort. Notre protocole implique également surentraînement modeste sur le passage intradimensional dans la dimension de repère d'abord pertinent. En particulier, lorsque l'évaluation des données normalisées sur la figure 4C, il apparaît que les souris testées dans notre protocole peut présenter un déficit duri plus prononcéeng la deuxième inversion intradimensional (par rapport à l'étape qui précède immédiatement). Cette observation est cohérente avec la notion de surentraînement pour assurer la formation d'un ensemble attentionnel, les souris présentaient également un changement ID / ED. Une possibilité pour expliquer pourquoi les souris soutenir la performance de l'effort dans notre protocole (Figure 5), ce qui implique une longueur moyenne d'une session de deux heures, peut être due à l'utilisation d'un cycle de lumière inverse. Nous avons testé le comportement dans une salle de test isolé et dédié dans des conditions d'éclairage rouge pendant les quatre premières heures de la (éveil) cycle d'obscurité. Cependant, le dépistage systématique en dehors du champ d'application de cette méthode manuscrit serait nécessaire pour déterminer les facteurs qui contribuent à la durée pendant laquelle les souris vont continuer à effectuer le AST, et si les déficits dans la discrimination olfactive sont soupçonnés, présélection peut être justifiée avant l'essai comme suppléant méthodologies sans odeur ont été rapportés.
En outre, pendantle développement initial de la méthode, nous avons découvert que les jeunes souris adultes (âgés de 8 à 12 semaines) effectuées avec une plus grande variabilité que peu plus âgés vieilles souris 4-6 mois. Nous pensons que le protocole de restriction alimentaire affecte de plus en plus souris différemment que les souris plus matures, et tout, dans un sens neurodéveloppement classique, le cerveau de la souris est considérée comme pleinement développée par six semaines, il est possible que la transition de l'adolescence à la maturité des adultes et l'âge adulte remodelage synaptique dans le cortex préfrontal performances confondre AST chez les souris plus jeunes. Cependant, ces questions fascinantes restent à explorer.
D'autres variantes de protocoles AST chez les souris comprennent des essais "libres", ce qui signifie un nombre désigné d'essais (généralement quatre) au début de chaque étape sont pas marqué, et l'animal est autorisé à explorer les deux pots jusqu'à ce que la récompense est récupéré. Le protocole détaillé ici ne comprend pas les essais "libres". En outre, nous avons mis le requiremnts de satisfaire aux critères plus stricts (8 essais consécutivement corrects au critère du lieu décrit précédemment 8/10 essais pour satisfaire au critère) et ont trouvé que ce est un indicateur efficace de savoir si l'animal a vraiment appris la règle. Garner et al. a montré qu'une période de surentraînement après un IDS (c.-à-présentation des stimuli pertinents précédemment pour une période supplémentaire de 50 essais) a augmenté de manière significative les essais au critère dans l'EDS 2. Ici, nous incluons plusieurs quarts de travail intra-dimensionnelle, dans un effort pour "overtrain" et d'assurer la formation d'un ensemble attentionnel sur la dimension pertinente, en accord avec Bissonette et al. 6. En outre, Garner et al. sessions de test limitée à environ 1 heure (ou lorsque la souris ne est plus répondu) 2, tandis que nous avons découvert que des souris C57BL6 / J progressent de façon adéquate et fiable à travers les quatre étapes qui leur sont présentés chaque jour à l'intérieur d'environ une période de 2 heures (pour le contrôlesouris). Bien que, les différences potentielles dans la capacité du moteur entre les groupes expérimentaux doivent être considérées lors de l'interprétation des performances. Notre procédé limite le temps et le travail de placement 17 jours pour chaque animal à partir du début de la manipulation grâce à la réalisation de l'essai. Il est recommandé qu'un expérimentateur individuelle limiter le nombre de souris testées en une seule journée à pas plus de deux (cela peut être modifié en fonction de la capacité individuelle de l'expérimentateur et l'expérience), qui permet à un seul expérimentateur la capacité à effectuer des essais sur au moins six souris par semaine. Si la fonction de moteur est affaiblie légèrement, la longueur de chaque essai peut être augmenté, comme correct de répondre, pas la vitesse de répondre, est la principale variable dépendante.
La discrimination visuelle paradigmes semblables à ceux qui ont été utilisés pour évaluer la performance cognitive chez les primates non-humains ont récemment été adaptés pour une utilisation chez les rongeurs, et peut être utilisé comme une alternative à l'odeur et à moyen discrimination tâches décrites ici. Cette approche peut être nécessaire si des différences significatives dans la discrimination olfactive sont présents entre les groupes expérimentaux de souris. Brigman et al. Ont montré que les souris discerner facilement les stimuli visuels composés dans un ID et ED changement de paradigme 15. Bien que cette méthode automatisée représente mieux le test utilisé pour étudier le dysfonctionnement du cortex préfrontal chez les humains et les primates non humains, le coût des chambres opératoires et écrans tactiles nécessaires pour effectuer ce test automatisé chez la souris peut être prohibitif.
Il est recommandé que le comportement être effectuée aussi cohérente que possible pour chaque souris, ce est à dire, l'accoutumance, la formation et les tests doivent être effectués au même moment de la journée pour chaque animal. En outre, la salle de comportement devraient rester inchangés pendant toute l'expérience, ce qui rend l'utilisation de l'espace partagé / communautaire problématique en raison de l'écoulement du trafic incontrôlable, l'odeur introduction, etc. Si les animaux doivent être transportésà partir d'une chambre de boîtier à une pièce de comportement à distance (comme ce est le cas ici), la même voie d'administration doit être effectuée à chaque fois. La salle de comportement doit être dans une zone où l'expérimentateur et les animaux ne seront pas perturbés au cours de la procédure de test. Si plusieurs expérimentateurs effectuent la tâche dans la même chambre, l'entrée et la sortie de la salle devrait être aussi limitée que possible pour éviter les bruits ou les perturbations forts qui peuvent augmenter le stress ou l'anxiété de l'animal pendant les essais. En outre, les expérimentateurs doivent être prudents dans l'élimination et le remplacement de la porte de départ ainsi que les pots dans et hors de la chambre de manière à créer le moins de bruit et de perturbations possible. Les expériences menées chez le rat ont démontré que la performance de l'AST peut être perturbé par divers facteurs de stress.
Parfumer des pots doit être effectuée chaque semaine et le même jour chaque semaine, au moins deux jours avant le premier jour de test. Il est recommandé que les pots sont parfumés dans un puits-ventilated zone en dehors de la zone où le test doit être effectué (par exemple laboratoire séparée, couloir, hotte). Cela aidera à éviter la contamination croisée des parfums et éviter de confondre les souris avec des parfums qui ne font pas partie de l'essai. En outre, avant et pendant les essais, les odeurs fortes qui peuvent distraire l'animal de la discrimination (consommation de gomme ou de café immédiatement avant l'essai, fort parfum / déodorant, etc.) devraient être évités pour la raison précitée. Si expérimentateurs désirer utiliser milieu de creusement autre que ce qui est décrit dans ce protocole, il est recommandé que le milieu soit de la densité et le poids similaire à celui décrit ici (poids excessif / densité, il est difficile pour la souris de creuser suffisamment). Par exemple, nous avons trouvé que les petites billes de plastique ne convenaient pas car ils sont difficiles pour les souris de pousser de côté. En outre, tous les médias avec une odeur très forte (par exemple., Bandes de caoutchouc et certains plastmatériau ic) ne convient pas car elle peut interférer avec la capacité de détecter les parfums testés.
Formation et les tests d'une souris individuelle doivent être effectuées par un seul expérimentateur, cependant l'acclimatation peut être fait par ne importe quel expérimentateur tant qu'ils ont participé à la manipulation. Tous les pots à être utilisés dans les quatre étapes effectuées chaque jour devrait être à la portée de manière à limiter la quantité de temps que l'animal se trouve dans la zone d'attente entre les étapes. Cela aidera à maintenir l'attention de la souris sur chaque tâche. En outre, une fois le test a commencé, il est important de ne pas se arrêter jusqu'à l'achèvement des tâches de ce jour de test (ce est à dire, tous les 4 étapes pour chaque jour de test doivent être remplis dans la succession).
En conclusion, le protocole décrit ici fournit des instructions méthodologiques détaillées pour l'utilisation efficace de l'AST pour mesurer la fonction cognitive corticale dépendant préfrontal chez les souris, y compris la descriptionde l'analyse des données et des mises en garde potentiels. Une variété de méthodes d'AST de souris sont rapportés dans la littérature primaire, chacune avec sa propre détails sur la procédure distincte. Le couplage unique de fois l'information textuelle et visuelle sera particulièrement utile pour les chercheurs d'essayer d'intégrer ce test puissant du comportement dans leur répertoire scientifique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions R01-MH090127, P30-MH089868 de l'Institut national de la santé mentale et le numéro d'attribution UL1TR001120 du Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIMH ou RNTAC. En outre, nous tenons à remercier Dre David Morilak pour son expertise précieuse dans l'orientation du développement précoce de la méthode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
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