Hier presenteren we een protocol om Homalodisca vitripennis cellen en HoCV-1 propageren in vitro. Medium werd verwijderd uit HoCV-1 positieve kweken en RNA geëxtraheerd elke 24 uur gedurende 168 uur. Cell overlevingsvermogen werd gekwantificeerd door trypan blauw kleuring. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd na infectie. Geëxtraheerde RNA werd gekwantificeerd door qRT-PCR.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis) is een zeer vagile en polyfage insect gevonden in de zuidwestelijke Verenigde Staten. Deze insecten zijn de belangrijkste vectoren van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), een-houtvaten beperkt bacterie die de veroorzaker van de ziekte van Pierce (PD) van wijnstok. De ziekte van Pierce is economisch schadelijk; aldus, H. vitripennis hebben een doel voor pathogeen management strategieën worden. A dicistrovirus geïdentificeerd als Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is geassocieerd met een verhoogde mortaliteit in H. vitripennis populaties. Omdat een gastheercel nodig HoCV-01 replicatie, celkweek verschaft een uniforme omgeving voor gerichte replicatie die logistiek als economisch waardevol voor biopesticide productie. In deze studie, een systeem voor grootschalige vermeerdering van H. vitripennis cellen via weefselkweek ontwikkeld, providing een virale replicatie mechanisme. HoCV-01 werd geëxtraheerd uit hele lichaam insecten en gebruikt om gekweekte H. inoculeren vitripennis cellen op verschillende niveaus. Het kweekmedium werd elke 24 uur gedurende 168 uur, RNA geëxtraheerd en geanalyseerd met qRT-PCR verwijderd. Cellen werden gekleurd met trypaanblauw en telde tot cel overlevingskansen te kwantificeren met behulp van een lichtmicroscoop. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd tot 96 uur na infectie, waarbij het tijdstip bepaald voordat totale celkweek ineenstorting opgetreden was. Cellen werden ook onderworpen aan fluorescentiekleuring en bekeken met behulp van confocale microscopie om virale activiteit op de F-actine gehechtheid en kernen integriteit te onderzoeken. De conclusie van deze studie is dat H. vitripennis cellen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor massaproductie van HoCV-01 op een passend niveau productie van een biopesticide mogelijk.
Inleiding
De glazige-winged scherpschutter (Homalodisca vitripennis Germar 1821) is geïdentificeerd als de belangrijkste vector van Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), de veroorzaker van de ziekte van wijnstok (PD) Pierce's in Noord-Amerika 1. Insect beheer bevolking heeft snel de focus van het onderzoek worden bij dit verwoestende probleem om de wijnbouw-industrie te bestrijden in Californië en over de zuidelijke Verenigde Staten. Een positief-sense, enkelstrengs RNA-virus behoort tot de familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) is vastgesteld bij wilde H. vitripennis populatie en aangetoond dat de ste....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Celkweek
OPMERKING: Homalodisca vitripennis vastgesteld door de Dr Wayne Hunter laboratorium aan de USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) cellijnen werden gebruikt om een lab stock bestaat uit gemengde cel stadia waaronder initiële fibroblasten en monolagen initiëren.
- Voer de volgende procedures in een steriele testomgeving gehandhaafd bij een temperatuur van 20-24 ° C met 25 cm2 cultuur flessen.
- Cultiveren en kweken handhaven 25 cm2 weefselkweek kolven met H2G + Leafhopper medium, een gemodificeerd WH2 honingbij medium 10 (tabel 1). ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cel aanhechting en groei werd gezien binnen de 48 uur van de passage in zowel kleine als grote kweekflessen, van primaire culturen en voortgezet passages. Groei en ontwikkeling van fibroblasten werd ook waargenomen binnen dit tijdsbestek. Bij nieuw geplaatste flessen werden verstoord vóór 48 uur, was er een zichtbare vermindering van celhechting, wat leidt tot langzamer groeiende kweken en soms niet gehecht of groei meer. Cellen werden ongeveer 80% confluent binnen een week passing en vormden een monolaag 10-14 dagen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Stijgende bezorgdheid over de instroom van invasieve landbouwgewassen hebben geleid tot een toenemende vraag naar nieuwe methodieken om te verdedigen tegen nieuwe plagen en pathogenen. Een focus van ziektepreventie en-beheer omvat het beheer van de ziekteverwekker vectoren en was het primaire doel van deze studie. Economie spelen een vitale rol in de beslissing om dit soort biopesticide om pathogeen vectoren te beheren in de landbouw, omdat de praktische toepassing moet zijn grote hoeveelheden over grote gebieden, maar .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen onze dank uiten aan het Texas Pierce’s Disease Research and Education Program en USDA-APHIS voor hun financiële steun voor dit project. We willen ook Hema Kothari aan de University of Texas Health Science Center in Tyler bedanken voor haar hulp bij confocale microscopie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Oppervlakte 25 cm2, canted hals, dop (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverteer microscoop en camera | |
| Trypsin-EDTA oplossing | Sigma Aldrich | T4049 | 0,25%, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek, 2,5 g varkenstrypsine en 0,2 g EDTA • 4Na per liter Hanks' Balanced Salt Solution met fenolrood |
| Greiner CELLSTAR multiwell kweekplaten | Sigma Aldrich | M8937 | 48 putjes (TC behandeld met deksel) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Natriumdiethyldithiocarbamaat trihydraat |
| Corning bottle-top vacuümfiltersysteem | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetaatmembraan, poriegrootte 0,45 μm, membraangebied 54,5 cm2, filtercapaciteit 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethyleenglycol hexadecylether |
| Fosfaat buffer oplossing | Sigma Aldrich | P5244 | Ontvangen als 100 mM verdund tot 10 mM met steriel water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | Voor elektroforese |
| Ethidiumbromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, voor moleculaire biologie, poeder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagenskwaliteit, kristallijn |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Fosfaat gebufferde zoutoplossing |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovien serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-geconjugeerd phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is een hoge affiniteit F-actine sonde geconjugeerd aan de rood-oranje fluorescerende kleurstof, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagens | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal Systeem | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (gesupplementeerd, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ bladluismedium component |
| L-histidine monohydraat | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ bladluismedium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ bladluismedium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ bladluismedium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ bladluismedium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ bladluismedium component |
| MEM, aminozuurmix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ bladluismedium component |
| 1 M MgCl oplossing | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ bladluismedium component |
| Pen-Strep (met glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ bladluismedium component |
| Nystatine | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ bladluismedium component |
| Gentamycine | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ bladluismedium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ bladluismedium component |
| Foetaal bovien serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ bladluismedium component |
Referenties
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
