La piel adulta de C. elegans es un modelo manejable para estudios de las respuestas epiteliales a las heridas, incluyendo el cierre de la herida, la formación de cicatrices y la inmunidad innata.
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Artículo de método
Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en C. elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
El C. elegans epidermis y cutícula forman una sencilla capa de piel y sofisticado que puede reparar daños localizados resultante de la herida. Los estudios de las respuestas de la herida y la reparación en este modelo han iluminado nuestro entendimiento del citoesqueleto y respuestas genómicas a daños en los tejidos. Los dos métodos más comúnmente utilizados para lesionar al C. elegans piel del adulto son pinchazos con agujas de microinyección y la irradiación láser local. Aguja hiriendo localmente altera la cutícula, la epidermis, y la matriz extracelular asociada, y también puede dañar los tejidos internos. Resultados de irradiación láser en daños más localizado. Heridas desencadena una sucesión de respuestas ensayadas fácilmente incluyendo elevada epidérmica Ca 2+ (segundo minutos), la formación y el cierre de un anillo que contiene actina en el sitio de la herida (1-2 horas), elevado transcripción de genes de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), y la formación de cicatrices. Esencialmente, todos los animales adultos silvestres sobreviven herida, dondecomo mutantes defectuosos en la reparación de heridas u otras respuestas muestran una menor supervivencia. Se presentan los protocolos detallados de aguja y las heridas de láser, y ensayos para la cuantificación y visualización de las respuestas de la herida y los procesos de reparación (dinámica de Ca, la dinámica de actina, la inducción péptido antimicrobiano y supervivencia).
Introducción
Mecanismos de curación de heridas en la piel son de interés biológico básico y relevante para la salud humana. La cicatrización de heridas en los vertebrados y mamíferos comprende una compleja serie de respuestas coordinadas de múltiples tejidos y de señalización 1. Muchos simples organismos modelo genético también son capaces de curar las heridas de la piel 2. Por tanto, es de interés analizar modelos genéticamente tratables de la reparación de heridas de la piel. Nosotros y otros han comenzado a utilizar Caenorhabditis elegans como nuevo modelo para la curación de heridas de la piel 3,4. El objetivo de este protocolo es per....
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Protocolo
Los siguientes protocolos describen el procedimiento detallado para C. piel elegans hiriendo y para analizar las respuestas de la herida.
1. Aguja hiriente 3,4
- Crecer gusanos unstarved saludables en placas con E. estándar NGM (medio de crecimiento de nematodos) bacterias coli OP50 como alimentos, mantenidos en una incubadora a 20 °.
NOTA: Los métodos para placas de agar NGM y el cultivo de rutina de C. elegans se puede encontrar en www.wormbook.org 6. - Escoja 25 L4 etapa gusanos a un recién sembrado placa 1 día antes de herir y de la cultura a 20....
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Resultados
Láser o heridas aguja activarán elevación rápida y sostenida de los niveles de Ca epidérmicas, como se visualiza con sensores de Ca como GCaMPs (Figura 1). La elevación Ca se produce en cuestión de segundos, y sigue siendo elevado durante decenas de minutos. Aguja hiriendo reproducible resulta en la formación de anillos de F-actina en los sitios de la herida (Figura 2); éstos aparecen en cuestión de minutos, y poco a poco cerca sobre 1-2 horas después de la herida. Anillos de actina se .......
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Discusión
Los métodos presentados aquí por aguja y lesiones láser ofrecen enfoques complementarios para evaluar la capacidad del epitelio epidérmico para reparar los daños. Herida láser es relativamente localizado y (dependiendo de la configuración del láser) puede limitarse a la epidermis, mientras que la herida de la aguja interrumpe la epidermis, la cutícula, y membranas basales internos probables. Heridas de aguja puede parecerse más precisión las heridas infligidas por agentes patógenos o daños mecánicos en el medio natural........
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Divulgaciones
Los autores no tienen conocimiento de ningún interés contrapuesto.
Agradecimientos
Los métodos de herida con aguja para C. elegans fueron desarrollados por primera vez por Nathalie Pujol y Jonathan Ewbank; agradecemos a Nathalie Pujol por sus comentarios sobre el manuscrito. El trabajo en nuestro laboratorio sobre la reparación de heridas epidérmicas de C. elegans está respaldado por una subvención de los NIH a A.D.C. (R01 GM054657).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Placa de Petri de plástico | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisol | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Capilar de vidrio de borosilicato | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Tirador de aguja | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Súbilo de tornillo sin fin (alambre de platino) | Solución Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 Hecho | en | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilización en autoclave | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Uso 500 ml para 50 lombrices |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| Máquina de PCR | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| Tubos de PCR de 96 pocillos | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Software de análisis de imágenes | Metamorfosis | dispositivos moleculares |
Referencias
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
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Reimpresiones y permisos
