Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

Resumo

A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.

Resumo

A capacidade de migrar é uma característica de vários tipos celulares e desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, e respostas imunes. Contudo, a migração celular é também um mecanismo de chave no cancro permitindo estas células cancerosas para separar a partir do tumor primário para iniciar a propagação metastática. Nos últimos anos vários ensaios de migração de células foram desenvolvidas para analisar o comportamento migratório das diferentes tipos de células. Porque o comportamento locomotor de células difere marcadamente entre uma a duas dimensões (2D) e do ambiente tridimensional (3D), pode presumir-se que a análise da migração de células que são incorporados dentro de um ambiente 3D produziria na migração de células mais significativa dados. A vantagem do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D é descrito que as células estão embutidos dentro de uma rede 3D fisiológica de fibras de colagénio que representam a principal componente da matriz extracelular. Devidotime-lapse microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações em resposta a fatores ou inibidores da pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisadas usando esta técnica, incluindo linfócitos / leucócitos, as células estaminais e as células tumorais. Da mesma forma, também grupos de células ou esferóides poderia ser incorporado dentro da matriz de colágeno concomitante com a análise da emigração de células individuais do grupo de células / esferóide na malha de colágeno. Conclui-se que o ensaio de migração 3D matriz de colagénio é um método versátil para analisar a migração de células dentro de um ambiente fisiológico 3D-like.

Introdução

Como a fusão celular (para uma síntese ver ^1,2) migração de células de um outro fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e respostas imunes (para revisão ver ^3). No entanto, a capacidade de migrar também é um pré-requisito para as células tumorais de metástases (para revisão ver ^3,4).

A migração celular é um complexo, não processo ainda totalmente compreendido que é dirigido pela interação de diversas vias de transdução de sinal iniciada por vários ligante (por exemplo, citocinas, quimiocinas,....

Protocolo

1 Preparação das Câmaras de Migração

1. Prepara-se uma geleia de parafina / petróleo (1: 1) mistura e aquecimento até que a mistura tenha derretido. Usando um pincel e desenhar 2-3 camadas da geleia de parafina / petróleo (1: 1) misturar no meio da placa de vidro, em conformidade com as Figuras 1B-1D.
   NOTA: Nós estamos usando lâminas de vidro comum (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H))
2. Aplicar a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo derreteu rapidamente sobre a lâmina de vidro para evitar a solidificação enquanto desenha. Certifique-se a camada de geléia de cera de parafina / petróleo é de cerca de 2-2,5 cm de comprim....

Resultados

O ensaio de migração matriz 3D-colagénio utilizado combinado com lapso de tempo de video-microscopia de rastreamento e de células assistida por computador permite a determinação de vários parâmetros, incluindo a migração de células, tanto do parâmetro de base populacional (por exemplo, a média de actividade locomotora) e parâmetros baseados em células individuais (por exemplo, tempo de movimento ativo, velocidade, distância migrados). Um exemplo dos conjuntos de dados de rastreio de células obtidas, pr.......

Discussão

A capacidade de migrar é uma característica de células tumorais ^4. Sem a capacidade de separar a partir do tumor primário e migração das células tumorais através de tecidos conjuntivos circundantes não irá ser capaz de propagar lesões secundárias, que são a principal causa de morte de quase todos os pacientes com cancro. Devido a esta relação muitos estudos estão se concentrando na migração de células cancerosas. O objectivo destes estudos é a identificação de novas moléculas de alvo e vias alvo que bloqueiam.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Leica DM IL microscópio invertido	Leica, Wetzlar, Alemanha
Aquecedor de platina de microscópio	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Alemanha
Câmera de vídeo JVC C1431	JVC, Bad Vilbel, Alemanha
Servidor de vídeo Axis 241Q	Axis communication GmbH, Ismaning, Alemanha
Mac G5 Computador	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleiß heim, Alemanha
Software de vigilância por vídeo multicâmera (Security Spy)	Bensoftware, Londres, Reino Unido
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edimburgo, Reino Unido
Parafina	Applichem GmbH, Darmstadt, Alemanha	A4264
Vaselina			farmácia local
Purecol (colágeno líquido)	Nutacon BV, Leimuiden, Holanda		contém 2,9 - 3,3 mg/ml de colágeno bovino (95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	M0275
Solução de bicarbonato de sódio a 7,5%	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha	662035	dissolver primeiro em CHCl3; reconstituir em DMSO imediatamente antes do uso